全 文 ：收稿日期:2014-05-20
作者简介:马元旦(1986-)，女(汉族) ，浙江绍兴人，硕士研究生，E-mail lovesoul0101@ 126． com;* 通讯作者:邸欣
(1968-) ，女(汉族) ，辽宁沈阳人，教授，博士，主要从事药物分析和药物代谢动力学研究，Tel． 024-23986342，E-mail
dixin63@ hotmail． com。
文章编号:1006-2858(2015)05-0362-04 DOI:10． 14066 / j． cnki． cn21-1349 /r． 2015． 05． 007
HPLC法同时测定杨梅叶中杨梅素等
3 种黄酮类化合物的含量
马元旦，王 鑫，刘有平，邸 欣*
(沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立同时测定杨梅叶中杨梅素、槲皮素和山奈酚 3 种黄酮类化合物含量的反相高效液
相色谱方法。方法 采用 Thermo Scientific ODS-2 Hypersil色谱柱(200 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相
为乙腈-体积分数 0. 2%甲酸水溶液，梯度洗脱;柱温为 40 ℃;流速为 0. 7 mL·min －1;检测波长为
360 nm。结果 杨梅素、槲皮素和山奈酚的线性范围分别为 15. 0 ～ 150. 0 mg·L －1、1. 50 ～
15. 0 mg·L －1和 1. 0 ～ 10. 0 mg·L －1，r≥0. 999 4;平均加样回收率分别为 100. 2%、94. 9% 和
104. 2%，ＲSD分别为 1. 3%、1. 0%和 1. 7%(n = 6)。应用该法测定了 3批杨梅叶中 3种黄酮类化合
物的含量。结论 该方法准确、可靠、重复性好，为杨梅叶中黄酮类活性成分的开发利用提供参考。
关键词:杨梅;叶;杨梅素;槲皮素;山奈酚;反相高效液相色谱法;含量测定
中图分类号:Ｒ 917 文献标志码:A
杨梅(Myrica rubra)是双子叶纲杨梅科杨梅
属常绿灌木或小乔木，主要分布在我国的浙江、江
苏、福建、云南、贵州、广东和湖南等省份，在日本、
韩国、印度等国也有少量栽培［1 － 2］。杨梅的干燥
叶片收载于《中华本草》，其味苦、微辛，性温，具
有燥湿祛风和止痒的功效。杨梅叶中主要含有黄
酮类、原花色素类、挥发油类和多酚类化学成分，
其中黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、降血糖和防
癌抗癌等多种药理作用［3 － 7］。根据文献报道，杨
梅叶中所含有的黄酮类化合物主要为杨梅素及其
与葡萄糖、鼠李糖或芸香糖结合而成的杨梅苷，另
外还有少量的山奈酚苷和槲皮素苷等［8 － 10］。为
了便于分析，植物中黄酮类化合物的含量测定常
常以水解后的苷元为标准［11 － 13］。本文作者首次
建立了同时测定杨梅叶中杨梅素、槲皮素和山奈
酚 3 种黄酮苷元含量的反相高效液相色谱法，并
应用此方法测定和比较了不同季节杨梅叶中黄酮
类化合物的含量差异。杨梅素、槲皮素和山奈酚
的化学结构式见图 1。
Fig． 1 Structures of myricetin(a)，quercetin(b)and kaempferol(c)
图 1 杨梅素(a)、槲皮素(b)和山奈酚(c)的化学结构式
1 仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪(配有在线脱
气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、可变
波长紫外检测器、Chemstation 色谱工作站，美
国 Agilent公司) ，pHS-2C 酸度计(上海伟业仪
器厂)，LD5-2A 离心机(北京医用离心机厂)，
BT25S 准微量分析天平(北京塞多利斯科学仪
第 32 卷 第 5 期
2 0 1 5 年 5 月
沈 阳 药 科 大 学 学 报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol. 32 No. 5
May 2015 p. 362
器有限公司)。
杨梅素对照品(含量质量分数≥98%，宁波
德康生物制品有限公司，批号 20130208)，槲皮素
对照品(含量质量分数≥98%，中国药品生物制
品检定所，批号 10129905) ，山奈酚对照品(含量
质量分数≥98%，中国药品生物制品检定所，批号
1100861-200808)，甲酸、乙腈(色谱纯，天津康科
德科技有限公司) ，其他试剂(分析纯，市售) ，重
蒸水(自制)。
杨梅叶分别于 2013 年 2 月、5 月和 9 月采自
浙江绍兴，经沈阳药科大学路金才教授鉴定为双
子叶纲杨梅科杨梅属植物杨梅(Myrica rubra)的
干燥叶子。将杨梅叶阴干，粉碎，过 180 μm 筛，
用 10 倍体积石油醚浸泡进行脱脂，抽滤，阴干，作
为样品粉末，备用。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Thermo Scientific ODS-2 Hypersil 柱
(200 mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相:乙腈(A)-体
积分数 0. 2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱;洗脱程
序:0 ～ 10 min 20% ～80% A，10 ～ 12 min 80% A;
流速:0. 7 mL·min －1;检测波长:360 nm;进样量:
20 μL;柱温:40 ℃。
在上述色谱条件下，杨梅素、槲皮素和山奈酚
色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于 1. 5，理论
塔板数按杨梅素峰计算不低于 6 000，各色谱峰拖
尾因子在 0. 95 ～ 1. 05 内，色谱图见图 2。
1—Myricetin;2—Quercetin;3—Kaempferol
Fig． 2 HPLC chromatograms of standard solution(A)and sample solution(B)
图 2 对照品(A)和样品(B)的高效液相色谱图
2. 2 溶液的配制
2. 2. 1 混合对照溶液
精密称取杨梅素、槲皮素、山奈酚对照品适
量，分别置于 10 mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀
释至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为 10. 0、
2. 0、1. 0 g·L －1的单一对照储备液。精密量取杨
梅素储备液 1. 50 mL，槲皮素储备液 0. 75 mL，山
奈酚储备液 1. 0 mL，置同一 10 mL 棕色量瓶中，
用乙醇稀释至刻度，摇匀，制成杨梅素、槲皮素、山
奈酚质量浓度分别为 1. 50、0. 15、0. 10 g·L －1的混
合对照溶液。
精密量取杨梅素、槲皮素和山奈酚对照储备
液 0. 02、0. 1 和 0. 2 mL，分别置于 10 mL 棕色量
瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度均
为 20 mg·L －1的杨梅素、槲皮素和山奈酚对照溶
液，用于检测波长的选择。
2. 2. 2 供试溶液
取杨梅叶样品粉末(过 180 μm筛)约 0. 6 g，
精密称定。置于 50 mL 锥形瓶中，精密加入无水
乙醇(含 1. 2 mol·L －1的盐酸和 2 g·L －1抗坏血
酸)12 mL，于功率 100 W、频率 40 kHz 超声条件
下水解提取 40 min，共超声 2 次。室温冷却，滤
过，合并滤液，减压蒸干，残渣用无水乙醇溶解并
转移至 50 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，经
0. 45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试溶液。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 线性关系考察
分别精密量取混合对照溶液 0. 1、0. 2、0. 4、
0. 6、0. 8 和 1. 0 mL，分置于 10 mL量瓶中，用甲醇
稀释至刻度，摇匀。分别取上述溶液各20 μL，按
“2. 1”条色谱条件进样分析。以各对照品质量浓
度(ρ，mg·L －1)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，
绘制标准曲线并进行回归计算，得到线性回归方
程:杨梅素 A = 64. 785ρ + 138. 25(r = 0. 999 5) ，槲
皮素 A = 136. 37ρ － 34. 815(r = 0. 999 5) ，山奈酚
A = 176. 78ρ － 33. 297(r = 0. 999 4)。结果表明，
363第 5 期 马元旦等:HPLC 法同时测定杨梅叶中杨梅素等 3 种黄酮类化合物的含量
杨梅素、槲皮素和山奈酚的质量浓度分别在 15. 0
～ 150. 0 mg·L －1、1. 50 ～ 15. 0 mg·L －1和1. 0 ～10. 0
mg·L －1内与峰面积呈良好的线性关系。
2. 3. 2 精密度和重复性试验
取混合对照溶液，重复进样 6 次，测得杨梅
素、槲皮素和山奈酚峰面积的 ＲSD分别为 1. 5%、
1. 5%和 1. 4%，表明仪器精密度良好。
取同一批杨梅叶粉末，按“2. 2. 2”条方法平
行制备 6 份供试溶液，分别进样分析，测定峰面
积，计算其含量质量分数。测得杨梅素、槲皮素和
山奈酚含量质量分数的 ＲSD分别为 1. 4%、1. 4%
和 1. 4%，表明方法重复性良好。
2. 3. 3 稳定性试验
取同一供试溶液，室温放置，分别在 0、2、4、8
和 12 h，按“2. 1”条色谱条件进样分析，测得杨梅
素、槲皮素和山奈酚峰面积的 ＲSD分别为 0. 6%、
2. 0%和 1. 2%。结果表明，供试溶液室温放置 12
h内稳定。
2. 3. 4 加样回收试验
称取已知含量的杨梅叶粉末约 0. 3 g，共
6 份，分别精密加入对照溶液适量，按“2. 2. 2”条
方法平行制备供试溶液，分别进样分析，计算加样
回收率。由表 1 可知，杨梅素、槲皮素和山奈酚的
平均回收率分别为 100. 2%、94. 9%和 104. 2%。
Table 1 Ｒecoveries of myricetin，quercetin and kaempferol in leaves of Myrica rubra Sieb． et Zucc．(n =6)
表 1 杨梅叶中杨梅素，槲皮素和山奈酚的回收率(n =6)
Component moriginal /mg madded /mg mfound /mg Ｒecovery /% Average recovery /% ＲSD /%
Myricetin 1. 500 1. 500 3. 016 101. 1
1. 548 1. 500 3. 019 98. 1
1. 505 1. 500 3. 016 100. 7
100. 2 1. 3
1. 502 1. 500 3. 012 101. 6
1. 504 1. 500 2. 990 100. 7
1. 500 1. 500 2. 985 99. 0
Quercetin 0. 046 6 0. 050 0 0. 094 2 95. 2
0. 048 1 0. 050 0 0. 095 0 93. 8
0. 046 8 0. 050 0 0. 093 7 93. 8
94. 9 1. 0
0. 046 7 0. 050 0 0. 094 7 96. 0
0. 046 0 0. 050 0 0. 094 3 95. 0
0. 046 6 0. 050 0 0. 094 5 95. 8
Kaempferol 0. 025 3 0. 025 0 0. 051 2 103. 6
0. 026 1 0. 025 0 0. 052 6 106. 0
0. 025 4 0. 025 0 0. 051 8 105. 6
104. 2 1. 7
0. 025 3 0. 025 0 0. 051 5 104. 8
0. 025 4 0. 025 0 0. 051 4 104. 0
0. 025 3 0. 025 0 0. 050 6 101. 2
2. 3. 5 样品含量测定
取 3 批杨梅叶，每批 3 份，按“2. 2. 2”条方法
制备供试溶液，分别进样分析，用外标法测定杨梅
叶样品中杨梅素、槲皮素和山奈酚含量，平行测定
3 次，测定结果见表 2。
Table 2 Contents(c)of myricetin，quercetin and kaempferol in leaves of Myrica rubra Sieb． et Zucc．(n =3)
表 2 杨梅叶中杨梅素，槲皮素和山奈酚的含量测定结果(n =3)
No． Source
c /(mg·g －1)
Myricetin Quercetin Kaempferol
1 Feb. 5. 151 0. 172 0 nd
2 May 10. 53 0. 294 0 nd
3 Sep. 5. 050 0. 157 0 0. 085 2
463 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 32 卷
3 讨论
3. 1 检测波长的选择和峰纯度鉴定
分别取对照溶液和供试溶液，利用 DAD检测
器在波长 200 ～ 400 nm 内进行紫外光谱全扫描，
结果显示，杨梅素、槲皮素和山奈酚均在波长 260
nm和 360 nm处有较大的吸收。由于槲皮素和山
奈酚在波长 260 nm处的吸收强度小于360 nm处，
兼顾三者的灵敏度，最终选择 360 nm 为检测波
长。通过比较对照溶液和供试溶液的紫外光谱扫
描图，利用色谱工作站进行峰纯度检查，确定样品
谱图中的杨梅素、槲皮素和山奈酚为单一组分峰。
3. 2 流动相的选择
首先尝试了以甲醇-水和乙腈-水系统进行等
度洗脱，结果表明，3 个待测组分不能在合适的洗
脱时间内获得良好分离，且色谱峰峰形严重展宽。
进一步比较了两个溶剂系统的梯度洗脱效果，发
现以乙腈-水系统进行梯度洗脱时，3 个待测组分
的色谱峰形均较锐，且色谱运行时间较短。杨梅
素、槲皮素和山奈酚的化学结构中均含有酚羟基，
具有一定的弱酸性，在流动相中加入适量甲酸可
以改善峰形和分离效果。考察了不同浓度甲酸的
影响，结果表明，在体积分数 0. 2%甲酸水系统下
色谱峰的峰形较好，且此时流动相的 pH 值在色
谱柱所能承受的范围内。考察了柱温对组分分离
的影响，发现柱温为 40 ℃时各组分色谱峰的分离
度较好，峰形较锐，且分离时间较短。
3. 3 供试溶液制备方法的选择
供试溶液制备过程中对提取溶剂甲醇、乙醇
和纯水进行了考察。甲醇和乙醇的体积分数分别
为 40%、60%、80%和 100%，结果表明，体积分数
100%的乙醇对 3 种物质的提取效果最好，这是由
于所选择的溶剂要与目标物质具有一定的相似
性，黄酮类化合物在水中的溶解度差，不利于成分
的流出，而甲醇相对于乙醇毒性较大。另外对超
声时间和提取次数进行了考察，分别考察了 20、
30、40 和 50 min，提取 1 次和 2 次，结果表明，超
声40 min，提取 2 次时提取完全。因为提取时间
较短时，黄酮类化合物不易溶出，提取时间较长
时，黄酮类化合物不稳定，部分受到破坏。故最终
选择无水乙醇超声提取 40 min，提取 2 次。
3. 4 测定结果分析
样品含量测定结果表明，杨梅叶中杨梅素的
含量最高，槲皮素和山奈酚的含量较少。实验中
收集到的 3 批杨梅叶中，杨梅素、槲皮素和山奈酚
含量分别在 5. 050 ～ 10. 53 mg·g －1、0. 157 0 ～
0. 294 0 mg·g －1和 0 ～ 0. 085 2 mg·g －1内，差异较
大，说明生长季节对杨梅叶中黄酮类化合物的含
量影响很大。
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Determination of sodium deoxyribonucleotide for in-
jection by HPLC
LI Jiao-na1，ZHAO Xin-yu2，WANG Miao2，ZHAO Chun-jie2*
(1． The Fourth Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese，Shenyang 110101，China;
2． School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China)
Abstract:Objective To develop a method for the quantitative analysis of sodium deoxyribonucleotide by
HPLC．Methods The analysis was performed by using a WhatmanTM Partisil-10 SAX(250 mm ×4. 6 mm，
10 μm) at elution of 50 mmol·L －1 KH2PO4 with ultraviolet detector(258 nm) ，the flow rate was
1. 0 mL·min －1 and the column temperature was maintained at 30 ℃ ． Ｒesults All calibration curves showed
good linearity(r ＞ 0. 999 0)within test ranges． The recoveries were 98. 2% -100. 1% and the ＲSD for intra-
day was less than 2. 0% at nine levels． Conclusions This method is simple，exclusive and of effective separa-
tion and high sensitivity． It is suitable for the determination of sodium deoxyribonucleotide．
Key words:HPLC;sodium deoxyribonucleotide;
content determination
(上接第 365 页)
Silmultanoeus determination of three flavonoid agly-
cones in the leaves of Myrica rubra by HPLC
MA Yuan-dan，WANG Xin，LIU You-ping，DI Xin*
(School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China)
Abstract:Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of myricetin，quercetin
and kaempferol in the leaves of Myrica rubra Sieb． et Zucc． Methods These paration was carried out on a
Thermo Scientific ODS-2 Hypersil column(200 mm × 4. 6 mm，5 μm)with the mobile phase consisting of
acetonitrile-0. 2% formic acid under gradient elution． The column temperature was 40 ℃ and the flow rate
was 0. 7 mL·min －1，the detection wavelength was set at 360 nm． Ｒesults The linear ranges of myricetin，
quercetin and kaempferol were 15. 0-150. 0 mg·L －1，1. 50-15. 0 mg·L －1 and 1. 0-10. 0 mg·L －1，respective-
ly． The average recoveries of myricetin，quercetin，kaempferol were 100. 2%，94. 9% and 104. 2%，and the
relative standard deviations(ＲSDs)were 1. 3%，1. 0% and 1. 7%(n = 6)． Conclusions This method is accu-
rate，reliable and reproducible for quality control of leaves of Myrica rubra．
Key words:Myrica rubra Sieb． et Zucc．;leaf;myricetin;quercetin;kaempferol;ＲP-HPLC;content
determination
083 沈 阳 药 科 大 学 学 报 第 32 卷