全 文 ：收稿日期: 2001- 07- 03
基金项目:国家自然科学基金 ( 39870544)、霍英东教育基金会高等学校青年教师基金 ( 71026 )、福建省自然科学基金
( F99003)资助项目 .
作者简介:赖钟雄 ( 1966- ) ,副研究员 ,博士 .研究方向:园艺植物生物技术与遗传育种 .
文章编号: 1006-7817-( 2001) 03-0347-06
龙眼荔枝属间原生质体电融合
赖 钟 雄 , 陈 振 光
(福建农林大学亚热带果树研究所 ,福建 福州 350002)
摘要: 由龙眼的幼胚培养诱导、筛选出松散型胚性愈伤组织 ,由之建立了胚性悬浮细胞系 ;用同样的方法建立
了荔枝的松散型胚性愈伤组织系 .龙眼的胚性悬浮细胞和荔枝的胚性愈伤组织在含纤维素酶和果胶酶各 10.0
g· L- 1的 CPW-13M的酶解液中酶解 ,经纯化后可得到较为纯净的原生质体 .采用电融合方法进行两种原生
质体融合处理 ,获得了适宜的融合参数 ,融合率达 20%以上 .融合产物经初步培养 ,形成了多细胞团 .
关键词: 龙眼 ; 荔枝 ; 原生质体 ; 电融合
中图分类号: S667.2, S667.1, Q813.2　　文献标识码: A
Electrofusion of protoplasts between longan and litchi
LAI Zhong-xiong , CHEN Zhen-guang
( Institute of Subtropica l Pomo logy , Fujian Ag ricultur e and Fo rest ry Univ er sity , Fuzhou, Fujian 350002,
China)
Abstract: The friable embryogenic calli we re induced and sc reened from imma ture embryo s in longan
(Dimocarpus longan Lour. ) , fr om which embryogenic cell suspensions w ere established, and th e friable
embryogenic calli wer e also obtained in litchi ( Litchi chinensis Soon. ) with the same method. The pro toplasts
w ere isola ted in the CPW-13M so lution w ith 10.0 g· L- 1 cellula se ono zuka R-10 and 10.0 g· L- 1 pectinase
serv a, which w ere quite pure afte r purification tr ea tment. The suitable fusion parameter s wer e obtained
thr ough electro fusion tr eatment o f tw o kinds of pro topla sts, and the ra te o f fusion was up to 20% . The po ly-
cell cluster s wer e eventually formed f rom th e fusion products a fter the pr eliminary cultur e.
Key words: lo ngan; litchi; pro toplast; electro fusion
龙眼 (Dimocarpus longan Lour. )与荔枝 ( Litchi chinensis Soon. )分别属于龙眼属和荔枝
属 ,同属无患子科 ( Sapindaceae) ,是我国南方重要特产果树 .果树育种学家长期以来一直希望
育出兼有两者特点的新型水果 ,然而 ,通过有性杂交获得属间杂种是相当困难的 .植物原生质
体融合技术可以克服有性杂交不亲和的生殖障碍 ,是近缘种属间基因转移的重要途径 [1 ] . 20
世纪 90年代以来 ,利用原生质体技术进行龙眼、荔枝的遗传操作很受重视 ,龙眼、荔枝的原生
质体培养已获再生植株 [2, 3 ] .鉴于此 ,我们采用电融合的方法进行龙眼、荔枝属间原生质体融合
研究 ,旨在为获得龙眼、荔枝的体细胞杂种或进行基因组转移奠定基础 .
1　材料与方法
1.1　材料
龙眼为红核子品种的幼胚 ;荔枝为下番枝品种的幼胚 .
福建农业大学学报 30( 3): 347- 352, 2001
Journal of Fujian Ag ricultural Univ ersity
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 2001. 03. 014
1.2　方法
1. 2. 1　龙眼、荔枝的幼胚培养　参照赖钟雄等 [4 ]的方法进行 .取大小约 2- 3 mm的子叶形幼
胚 ,接种于含 2 mg· L- 1 2, 4-D或含 2 mg· L- 1 2, 4-D、 1 mg· L- 1 KT、 5 mg· L- 1 AgNO3的
MS培养基 ( M1、M2培养基 ) ,诱导胚性愈伤组织 .培养基附加 20 g· L- 1蔗糖、 7 g· L- 1琼脂 ,
pH 5.8.在 ( 25± 2)℃、黑暗条件下培养 .
1. 2.2　龙眼、荔枝的松散型胚性愈伤组织的筛选与保持　参照文献 [5- 7 ]的方法进行 .经筛选
获得的松散型胚性愈伤组织在两种继代培养基 ( M3、 M4培养基 )中交替培养保持 . M3培养基
含 1 mg· L- 1 2, 4-D; M4培养基含 1 mg· L- 1 2, 4-D、 0. 5 mg· L- 1 KT、 5 mg· L- 1 AgNO3 . M3
和 M4培养基均附加 20 g· L- 1蔗糖、 7 g· L- 1琼脂 , p H 5.8.
1. 2.3　龙眼胚性悬浮细胞系的建立　参照赖钟雄等 [8 ]的方法进行 .
1. 2.4　龙眼胚性悬浮细胞与荔枝胚性愈伤组织的原生质体分离与纯化　参照赖钟雄 [ 5]的方法
进行 .
1. 2. 5　龙眼、荔枝原生质体融合处理　采用 NCY-2型细胞融合仪进行电融合处理 ,确定适宜
的融合液成分和融合参数 .
1. 2.6　融合产物的培养　参照龙眼原生质体的优化培养方法 [5 ] .
2　结果与分析
2.1　龙眼、荔枝松散型胚性愈伤组织的获得与保持
　表 1　龙眼、荔枝的幼胚愈伤组织诱导 1)
　 Table 1　 Induction of emb ryog enic calli f rom immature embryoes in
longan and li tchi
种类 幼胚接种数
污染幼
胚数
形成愈伤组
织幼胚数
愈伤组织诱
导率 /%
龙眼 50 0 34 68.00
荔枝 50 2 15 31.25
　　 1)在 M 1培养基上培养 6周时的统计数据 .
　　于龙眼、荔枝花后 40- 50 d,取大小
约 2- 3 mm的子叶形幼胚 ,经常规表面
消毒后 ,接种于 M1、 M2培养基 ,在黑暗
中培养 .约 3- 5周 ,开始形成愈伤组织 .
培养 6周时 ,愈伤组织的诱导率如表 1
所示 .其愈伤组织都是松散、易碎的 .龙
眼、荔枝的幼胚在 M1和 M2培养基上的
培养反应类似 .根据前人的研究经
验 [4, 6, 7, 9- 12 ] ,龙眼、荔枝幼胚诱导出的愈伤组织应及时转移到 M1或 M2培养基交替继代培养 .
继代培养时 ,龙眼愈伤组织在黑暗中培养 ,荔枝愈伤组织在弱光下培养 .此时 ,龙眼的愈伤组织
为白色或淡黄色 (颜色很浅 ) ,荔枝愈伤组织为淡黄色或黄色 ;两者颗粒都很细 ,但荔枝愈伤组
织相对稍粗 .为验证得到的是否为胚性愈伤组织 ,将它们转移到无激素培养基 .培养 4- 5周 ,
都形成大量的胚状体 ,证明它们都是胚性愈伤组织 .但是 ,在荔枝继代培养和体胚分化过程中 ,
发现混杂有一些白色的非胚性愈伤组织 .因此 ,将荔枝在弱光下培养 ,以抑制非胚性愈伤组织
的生长 .在光照条件下 ,非胚性愈伤组织会褐变而停止生长 ,但光照不能太强 ,否则胚性愈伤组
织的生长也会受到抑制 .在上述条件下 ,龙眼、荔枝胚性愈伤组织得到长期保持 ,可为进一步建
立悬浮细胞系或直接分离原生质体源源不断地提供适宜的起始材料 .
·348· 福建农业大学学报　 2001年第 30卷
2.2　龙眼胚性悬浮细胞系的建立
将继代培养 15 d的龙眼松散型胚性愈伤组织轻轻夹碎后 ,接种于含 1 mg· L- 1 2, 4-D、
0. 5 mg· L- 1 KT、 5 mg· L- 1 AgNO3、 30 g· L- 1蔗糖 , p H 5.8的 M S液体培养基 ( M5培养基 ) ,
在 PYC普通摇床上进行液体振荡培养 (振荡速度为 120 r· min- 1 ) .在 150 m L的三角瓶装入
40 mL培养基 ,接种量为 2- 3 g·瓶 - 1 ,约 3- 4 d后镜检 ,即可看到大量的小细胞团和单细
胞 .过滤掉大块组织或细胞团 ,更换新鲜培养基 ,约 7- 10 d左右即可得到生长迅速、大量增殖
的悬浮细胞系 .用 M5培养基与含 1 mg· L- 1 2, 4-D、 30 g· L- 1蔗糖的 MS液体培养基 ( M6培
养基 )交替培养 ,可以连续继代保持 .该悬浮细胞系在无激素培养基上即可形成大量胚状体 ,表
明为胚性悬浮细胞系 .
2.3　龙眼、荔枝胚性悬浮细胞和愈伤组织原生质体的分离与纯化
参照龙眼胚性愈伤组织的原生质体分离优化方法 [ 7] ,将继代培养 4- 5 d的龙眼悬浮细胞
和继代培养 15- 17 d的荔枝胚性愈伤组织各 0.5 g ,放进已加入 5 mL酶解液的培养皿 (直径 6
cm ) .酶解液为含纤维素酶 ( cel lulase onozuka R-10)和果胶酶 ( pectinase serv a)各 10. 0 g· L- 1
的
　表 2　龙眼 、荔枝的原生质体分离
　 Table 2　 Isolat ion of protoplast s in longan and li tchi
种类 材料类型 产量× 106个· g- 1 存活率 /%
龙眼 胚性悬浮细胞 98 95. 1
荔枝 胚性愈伤组织 4 94. 5
CPW-13M (含 130 g· L- 1甘露醇 ) , p H 5.8[5 ] .
酶解在 ( 25± 2)℃、黑暗条件下进行 .酶解 14 h
后 ,去壁完成 ,即可得到大量的原生质体 .采用
过滤—离心法纯化原生质体 [13 ] , Evans Blue染
色法 [ 14]测定原生质体活力 .原生质体的产量和
存活率见表 2.由表 2可见 ,所获得的原生质体
产量和活力都很高 ,适于进一步的原生质体融合处理 .
2.4　龙眼、荔枝原生质体的电融合与融合产物的培养
龙眼、荔枝的原生质体按 1∶ 1比例混合 ,原生质体密度调整为 106个· m L- 1.用 NCY-2
型细胞融合仪诱导原生质体融合 .使用渗透压稳定剂为 100 g· L- 1甘露醇 ,并附加 0.01 mol·
L- 1 CaCl2融合诱导剂的融合液 ,在融合仪的参数调整范围之内 ,无法使原生质体排列成串 .但
当去除 CaCl2后 ,用仅含 100 g· L- 1甘露醇渗透压稳定剂的融合液 ( pH 5.8)调整融合参数 ,原
生质体可排列成串 .在融合室电极间距为 2 mm、交变电场电压为 40- 43 V、成串脉冲频率为
2. 0- 2.5 MHz的条件下 ,原生质体在 2- 3 min内迅速排列成串 .适当调整融合参数 ,可使多数
原生质体排列成 2- 4个细胞的短串 (图 1A、 1B、 1C) .如果原生质体串太长 ,容易造成多细胞
融合 .
原生质体排列成短串后 ,施加 1- 2个直流高压 ( 400- 500 V )电脉冲 (闸门中 ,脉冲宽度
40μs) , 5- 10 min有部分原生质体完成融合 , 1∶ 1融合比例较高 ,融合率一般大于 20% (图
1D) .由于荔枝原生质体明显大于龙眼原生质体 ,因而可以直接在倒置显微镜下观察 ,初步判
断有异核体融合情况 .图 1E、 1F、 1G为龙眼、荔枝原生质体 1∶ 1融合过程: ( 1)在交变电场作
用下 ,两个原生质体相互靠近 (图 1E) ; ( 2)在施加直流高压电脉冲后 ,原生质体逐渐融合 (图
·349·第 3期　　赖钟雄等: 龙眼荔枝属间原生质体电融合
1F) ,数分钟后两个原生质体融合形成一个融合体 (图 1G) .经电融合处理后的融合产物 ,参照
龙眼原生质体的优化培养方法 [5 ] ,采用海藻酸钙包埋悬浮振荡培养 , 20- 30 d后 ,形成含十几
个至几十个细胞的多细胞团 (图 1H) ,植板率为 0.13% .促使多细胞团进一步生长和融合杂种
早期筛选的工作正在进行之中 .
A.混合的龙眼、荔枝原生质体 ,其中较大者为荔枝原生质体 (箭头所示 ) ,较小者为龙眼原生质体 ; B、 C.在交变电场作用下原
生质体排列成串 (箭头所示 ) ; D. 2- 3个原生质体融合 ; E- G.龙眼、荔枝两个原生质体的融合过程 (从两个原生质体相互靠
近、融合到形成 1个融合体 ,箭头所示 ) ; H.融合产物培养形成多细胞团 .
图 1　龙眼、荔枝属间原生质体电融合过程的显微观察
Fig. 1　 Micros copic observation of p rotoplas t elect rofusion betw een longan and li tchi
3　讨论
3.1　电融合方法在龙眼、荔枝原生质体遗传操作上的应用潜力
电融合具有简便、对原生质体无毒害、融合条件易控制等优点 ,在植物原生质体融合研究
·350· 福建农业大学学报　 2001年第 30卷
中的应用已越来越广泛 [1 ] .本试验结果表明 ,电融合是龙眼、荔枝原生质体融合的适宜方法 ,利
用电融合仪可以达到较好的融合效果 .但是 ,本试验中参照龙眼原生质体优化培养方法 ,未能
使融合产物培养持续增殖 .其原因可能是多方面的: ( 1)龙眼、荔枝融合产物与龙眼原生质体的
培养条件要求可能不同 ,相互之间可能有一定的抑制作用 ; ( 2)未能找到融合产物再生的适宜
条件 ; ( 3)电融合处理本身对原生质体造成损伤 ,进而影响再生能力 .由于本试验所使用的
N CY-2型细胞融合仪为国产仪器 ,对融合参数的控制不很精确 ,特别是其电极为 Cu电极 ,对
原生质体可能产生毒害作用 ,而且其电极是平行电极 ,而龙眼、荔枝的原生质体大小差异较大 ,
影响了适宜参数的选择 .目前 ,本实验室已购置了美国 Cy to Pulse公司的 PA-4000电融合仪 ,
其融合电极为同心圆的 Pt电极 ,克服了 NCY-2型细胞融合仪的上述缺点 ,有可能取得较好的
效果 .虽然在本试验中尚未能获得龙眼、荔枝的体细胞杂种 ,但为龙眼、荔枝原生质体的遗传操
作做了有益的探索 .由于本实验室在龙眼、荔枝的原生质体培养方面已有较好的研究基
础 [2, 3, 5 ] ,相关的研究也较多 [15- 17] ,利用电融合技术可为其遗传操作 ,特别是进行微原生质体融
合和不对称原生质体融合 ,提供较为简便的试验手段 .
3.2　龙眼、荔枝属间基因组转移的应用前景
龙眼、荔枝为近缘种属 ,自然界中有一些外观性状介于龙眼与荔枝之间的特殊资源 ,据推
测有些可能是龙眼、荔枝的天然杂种 .长期以来果树育种工作者对两属间有性杂交进行了不少
尝试 ,但都没有很成功的报道 .澳大利亚联邦科工部园艺所的科学家曾通过有性杂交结合胚胎
挽救的办法获得龙眼、荔枝的属间杂种小苗 ,但未能使小苗存活下来 [ 18] .龙眼、荔枝之间的有
性杂交仍是非常困难的 .利用原生质体融合技术 ,可以实现龙眼、荔枝属间全部或部分的近缘
种属基因组的转移 ,特别是近年来发展起来的微核技术 ,可以实现不同植物之间部分基因组或
特异染色体的转移 [ 19- 22] .这样 ,可以绕过有性杂交的障碍 ,创造龙眼或荔枝的新种质 ,从而为
培育龙眼、荔枝新品种或新型的水果开辟新的途径 .因此 ,进一步开展龙眼、荔枝原生质体的遗
传操作研究 ,特别是利用电融合技术进行的各种原生质体遗传操作 ,具有重大的意义 .
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(责任编辑:施晓棠 )　
·352· 福建农业大学学报　 2001年第 30卷