全 文 ：分子植物育种,2006年,第4卷,第1期,第117-124页
MolecularPlantBreeding,2006,Vol.4,No.1,117-124
专题介绍
Review
栗属分子生物学研究进展
韩继成 张新忠 刘庆香 王广鹏 孔德军 *
河北农林科学院昌黎果树研究所,昌黎,066600
*通讯作者,kongdejun02@163.com
摘 要 壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea)植物的7个种分布广泛,不仅可用于木材生产,而且在坚果生产
上也占有独特地位。基于形态学、同工酶、子叶储藏蛋白和RAPD数据,通过对分布于亚洲、欧洲和北美的栗
属植物的遗传多样性研究表明中国板栗(Castaneamolissima)是世界栗属植物的原始种,长江流域是中国板
栗的遗传多样性中心,土耳其是欧洲板栗的起源中心之一。在分子标记辅助育种方面,已发表了基于形态学、
同工酶、RAPD和ISSR数据的两张栗属植物的遗传连锁图谱,其中一个是用欧洲板栗种内杂交后代F1全部
单株构建的,另一张是用美洲板栗与中国板栗种间杂交后代F2单株构建的,并已经定位了3个假定的栗疫
病抗性位点;并且证明在多年生木本果树上同工酶基因可通过连锁关系分析与形态基因整合为1个单一基
因图而无需另外的杂交。从栗属植物中已分离纯化了包括可抑制HIV-1反转录酶活性的Molisin在内的几
丁质酶等抗真菌蛋白、胱氨酸蛋白酶抑制剂、热击蛋白、红血球凝集素、脱水素、花粉过敏原等功能蛋白质,并
已经克隆了包括伤害应答基因在内的部分功能蛋白质相关基因。因此,作为具有独特性质的栗属植物,有必
要开展更多的研究,就此本文对栗属植物遗传多样性、分子标记辅助育种和功能蛋白纯化和有关基因克隆等
几方面的研究进展进行了总结,希望能位同行提供参考。
关键词 栗属[Castanea(Tourn.)L.],遗传多样性,分子标记,功能蛋白,基因
TheProgressoftheMolecularBiologicalStudiesonCastanea(Tourn.)L.
HanJicheng ZhangXinzhong LiuQingxiang WangGuangpeng KongDejun*
ChangliInstituteofPomology,HebeiAcademyofAgricultureandForestrySciences,Changli,066600
*Corespondingauthor,kongdejun02@163.com
Abstract ThegenusCastanea,belongingtotheFagaceae,includessevenspecies,whichareCastaneamolissima
BL.,CastaneaseguiniDode.,Castaneahenryi(skan)Rehd.etWils.,nativetoChina,CastaneacrenataSieb.&
Zucc.,nativetoJapaneseandKoreanPeninsula,CastaneadentateMarsh.,CastaneapumilaMil.,nativetoAmeri-
ca,andCastaneasativaMil.,nativetoEuropeandWestAsia.Castaneaistheoneofthemostimportanttree
speciestotheproductionoftimbersandnuts.Basedonmorphological,isozyme,storageproteinsincotyledonand
RAPDdata,CastaneamolissimaistheoriginatedspeciesoftheCastanea,andtheYangtzeRivervaleyisthecen-
terofgeneticdiversityofCastaneamolissima,whileTurkeyisoneofthesupposedcentersoforiginofCastanea
sativa.Twogeneticlinkagemapshavebeenconstructedbasedonmorphological,isozyme,ISSRandRAPD,and3
putativelociresistanttothechestnutblightfungus(Chryphonectriaparasitica)havebeenlocated.Inwoodspecies,
isozymegenescanbeintegratedwithmorphologicalmarkergenesintoasinglelinkagemapwithouttheneedfor
additionalcrosses.SomeofthefunctionalproteinsfromCastaneahavebeenpurified,suchaschitinase,molisin,
smalheat-shockprotein,lectin,alergenanddehydrin,andsomerelatedgeneshavebeenalsocloned.Inthispa-
per,wesummarizedthestudiesonthegeneticdiversity,molecularmarkerassistedbreeding,thepurificationof
functionalproteinsandthecloningofrelatedgenes.
Keywords Castanea(Tourn.)L.,Geneticdiversity,Molecularmarker,Functionalproteins,Genes
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
栗属[Castanea(Tourn.)L.]属于壳斗科(Fagaceae)
植物,共包括7个种,即原产于中国大陆的中国板栗
(CastaneamolissimaBL.)、茅栗(CastaneaseguiniDo-
de.)和锥栗[Castaneahenryi(skan)Rehd.etWils.];原
产于日本和朝鲜半岛的日本板栗 (Castaneacrenata
Sieb.&Zucc.),原产于北美的美洲板栗(Castanea
dentateMarsh.)和美洲榛果栗(CastaneapumilaMil.),
原产于欧洲、非洲和西亚的欧洲板栗(Castaneasativa
Mil.)。由于板栗兼有木材和果实生产,其研究越来越
受到重视,近几年来的分子生物学在栗属植物遗传
多样性、分子标记辅助育种和功能基因克隆方面有
很大进展,本文就此进行了总结。
1栗属植物遗传多样性和品种鉴定
通过对土耳其类群的同工酶标记的空间自相关
分析(Pigliuccietal.,1990a;1990b)以及在遗传、形态
和生理等3个水平上(Vilanietal.,1991;1992;1997)
分析表明选择性机制在欧洲板栗居群中可能都加重
了遗传和形态变异,气候因子,特别是降雨量也影响
了板栗的空间分布,土耳其东部和西部居群有很高
的遗传多样性,中部地区显示典型的杂交区域,土耳
其西部与意大利等欧洲其它地域的板栗的遗传差异
小于土耳其西部与土耳其其它地区的遗传差异,确
认土耳其是欧洲板栗的起源中心之一,存在明显的
自东向西的渐变或双渐变的非随机分布的空间结
构,罗马时代在土耳其从东部向中心缓慢散播,随后
与人类的活动相随的迅速向西、Anatolia和地中海盆
地扩散,后期在地理隔离的微环境选择下逐步分化,
但在扩展过程中其遗传资源逐渐枯竭,几乎没有新
的遗传变异。RAPD分析的结果与同工酶数据相吻
合(Galderisietal.,1998;Fornarietal.,1999),并且果
园人工种植板栗个体间多样性少,而高海拔和灌木
丛地带分布的板栗具有更大的遗传多样性(Seabraet
al.,2001)。对欧洲板栗核糖1,5-二磷酸羧化酶的大
亚基基因(rbcL)核苷酸序列和对叶绿体和线粒体基
因组的PCR/RFLP的分析进一步明确欧洲的板栗几
乎没有地理上的结构变化,人类活动,特别是罗马文
明时期及其后持续数千年的文明实践的长期活动对
该种分布的影响(Fineschietal.,2000),Fagaceae科植
物的 rbcL进化速率明显慢于已分析的其它科的一
年生植物(Frascariaetal.,1993)。
应用人控杂交和单树后代分析(single-tree-proge-
ny)研究美洲板栗和中国板栗同工酶位点的遗传关系
表明美洲板栗在栗属中的居群和种水平具有较低的
遗传多样性,可将美国的板栗分为最南部、南部—中
部 Appalachian、北部—中部Appalachian和南部 Ap-
palachian等 4个居群 (Huangetal.,1994a;1994b;
1998),和欧洲板栗一样,美洲板栗也几乎没有地理结
构的变化(KubisiakandRoberds,2003)。美洲榛果栗
比北美大陆其它栗属种的居群有更高的的遗传多样
性,居群内检测到高水平的杂和性,但居群间的遗传
变异没有显著差异(Daneetal.,1999)。在北美板栗和
中国大陆板栗种的DIA同工酶的遗传分析发现了3
个DIA位点的两个等位基因是共显性遗传的。在美
洲榛果栗和茅栗中检测到Dia1的遗传变异,Dia2在
美洲板栗被检测到,而Dia6的遗传多态性只在美洲
榛果栗中被检测到(DaneandHuang,2002)。后分析
美国自然区带分布的板栗濒危品种[Castaneapumila
var.pumila(Aleghenychinkapin)]的 12个居群间的
同工酶变异(70%)大部分发生在居群水平。该种没有
自然区带分布性的居群差异(FuandDane,2003)。
Alvarez等(2003)认为板栗种子储存蛋白可以对
欧洲板栗遗传多样性进行分析。国内对中国西北、华
北、西南、东南和长江流域等 5个品种群的 33个板
栗品种的贮存蛋白多态性的分析表明西北品种群和
华北品种群的品种的谱带分布最为广泛,其中Ⅴ区
的谱带仅限于西北品种群,南北方品种的带型多样
性较明显,带型与品种原分布的地理区域存在相关
关系(张辉和刘鎏,1997)。
通过检测中国板栗同工酶位点的遗传变异分析
认为长江流域品种群的居群与东南品种群的居群较
其它居群关系更为密切,东南品种群与西北品种群
的亲缘关系最远 (张辉等,1998;张辉和刘鎏,1998)。
通过对栗属种的PGI同工酶遗传的分析发现 Pgi位
点(Pgi-1)主要有 3个等位基因并呈共显性遗传,还
检测到了出现频率较少的另外2个等位基因,长江
流域居群 Pgi杂合度最高,东南部居群最低(黄宏文
等,1999)。陕西实生板栗以秦岭为界分为秦岭以南与
秦岭以北2个自然分布亚区,具有复杂的遗传基础
(秦岭等,2002)。应用同工酶对89个中国板栗品种的
遗传多样性分析,除5个品种外,其余品种均可用多
位点同工酶对其做专一性鉴定,同地域的板栗品种
具有遗传关系相近的特征,朝鲜板栗也可能来自中
国板栗(暴朝霞和黄宏文,2002)。茅栗和锥栗可能起
源于板栗,中国板栗为世界栗属植物的原生种,长江
流域的神农架及周边地区为中国板栗的遗传多样性
中心(郎萍和黄宏文,1999)。对中国板栗华北、长江流
域和西南主要地区的遗传变异的空间自相关分析及
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F-统计分析结果表明多数等位基因频率在居群间呈
随机分布模式,缺乏一定的空间结构,而部分等位基
因表现为渐变或双向渐变的非随机分布模式,又具
特定空间结构,推测中国板栗遗传变异空间结构模
式的形成可能是长距离基因流、自然气候、人类活
动、地理距离隔离等诸因素综合作用的结果。居群等
位基因分布格局的成因是在第四纪冰川后,中国板
栗以长江流域中下游的孑遗中心为起点,等位基因
分别沿着向北和向南的不同方向迁移形成现在的居
群结构,季风气候和人类活动干扰是削弱居群多样
性的主要因素,而基于环境梯度的选择,是形成由北
向南渐变分布的原因(李作洲等,2002)。
RAPD分子标记研究方面,高捍东等研究了江苏
省溧阳市龙潭林场国家林业局板栗良种基地保存的
46个中国板栗品种的遗传多样性,建立了RAPD标
记的标准程序和DNA指纹数据库,为板栗品种鉴别
提供了准确、可靠的标准方法 (高捍东和黄宝龙,
2001)。利用RAPD标记对浙江、安徽和湖北等省份的
优良板栗品种(无性系)和地方特色品种进行指纹分
析,分析了供试板栗品种的系统发育(翁尧富等,2001;
项艳等,2003;张新叶和黄敏仁,2004),还运用特殊谱
带,建立了板栗品种的分子检索表(项艳等,2003)。
对中国栗属特有种中国板栗、茅栗和锥栗的10
个样品的RAPD分析,利用UPGMA法构建遗传关
系聚类图,以相似性系数为0.62阈值,板栗与茅栗为
一个聚类组,锥栗为另一个聚类组(杨剑等,2004)。通
过520多个随机引物分析这三个特有种的保守片段,
筛选出引物B08(GTCCACACGG),该引物在所有供
试的中国板栗、茅栗和锥栗中均扩增出各自特异的
DNA片段,其片段大小分别为 2050bp,900bp和 1
500bp,这些DNA片段在种水平上的高度保守性,可
以用来区分这3个种(沈永宝和施季森,2004)。
应用同工酶和AFLP分析,分布于朝鲜的日本
板栗不同于分布于日本的,它可能是中国板栗与日
本板栗的杂交种 (Yamamotoetal.,1998),但是SSR
分析表明,日本板栗是从野生板栗中筛选出来的,并
具有相同的遗传背景(Yamamotoetal.,2003)。
通过调查来自该属东亚和北美种群等3个地域
的 5个种的 62个群体的同工酶位点的等位基因的
变异,发现其中中国板栗的遗传变异最大,而美洲板
栗的遗传变异最小。最大洲内遗传一致性出现在
Alegheny和 Ozarkchinkapins(0.931)以及中国板栗
和茅栗(0.870),较低的遗传一致性出现在美洲的美
洲榛果栗和美洲板栗(0.720~0.729)。洲间比较时,美
洲板栗与中国板栗、茅栗和锥栗的遗传一致性分别
为 0.505,0.495和0.507,而美洲榛果栗与中国板栗
和茅栗的遗传一致性较低,分别为0.469和0.435,中
国栗与锥栗的稍高,为0.520。美洲板栗和中国板栗、
美洲榛果栗、锥栗的遗传分化时间估计为10~13百
万年以前(Daneetal.,2003)。
2分子标记辅助育种
分子标记辅助育种主要应用于美国板栗回交后
代的辅助育种方面。因为分子标记和相应的遗传连
锁图谱可以明确栗疫病抗性相关的基因或基因家
族,这样的标记和图谱在以后的回交后代中可以筛
选出不希望的中国板栗DNA(Elinboe,1994)。
利用 8个同工酶位点、17个 RFLPs、216个
RAPDs对102个美洲板栗和中国板栗种间杂交后代
的 F2单株构建初级连锁图,将 2个同工酶位点、12
个RFLPs、170个RAPDs定位于12个连锁图,覆盖
了530.1Kosambicentimorgans的遗传距离,通过对
F2植株的栗疫病抗性分析,定位了3个假定的抗性
位点(P<0.001)(Kubisiaketal.,1997)。美洲板栗与中
国板栗种间杂交的1个F2代和2个回交一代进行同
工酶基因与形态标记的遗传连锁关系,证明在多年
生木本果树上同工酶基因可通过连锁关系分析与形
态基因整合为1个单一基因图而无需另外的杂交(黄
宏文等,1996)。根据双假测交理论应用 311个
RAPDs、65个 ISSRs、5个同工酶等 381个分子标记
对F1全部后代家族的96个单株构建了欧洲板栗的
遗传连锁图。其中母本和父本的图框分别 720和
721cM(Kosambi),分别覆盖了 76%和 68%的基因组
(Casasolietal.,2001)。
利用欧洲板栗中分离到的 33个简单序列重复
(SSR)在品种GaroneNero的5个样品中筛选出24
个多态性位点,每个位点检测到 2~7个等位基因
(Marinonietal.,2003)。在日本板栗中应用(AG)/(TC)
富集的基因组文库发展了15个SSR位点,每个位点
产生 1~16个等位基因,其中 14个具多态性(Ya-
mamotoetal.,2003),从中国栗AC/GT富集的基因组
文库中筛选出了10个微卫星标记,并对14个品种
进行了聚类分析(肖正东等,2005)。来自栎属和栗属
的简单重复序列(SSR)标记用于Quercusrobur(L.)和
欧洲板栗的比较作图。47%(25)的栎属SSRs和63%
(19)的栗属 SSRs在不同种中可获得较强的扩增产
物,19个 (15个来自 Quercus和 4个来自 Castanea)
被整合进先前所构建的分属两个属的遗传连锁图。
栗属分子生物学研究进展
TheProgressoftheMolecularBiologicalStudiesonCastanea(Tourn.)L.
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
通过对SSR位点的序列测定确认了这些标记的正确
性。从两个连锁图的综合信息以及序列分析证明在7
个连锁组有同源性,Q.robur和欧洲板栗之间的保守
位点可作为Fagaceaefamily锚定位点的比较作图研
究(Barenecheetal.,2004)。
3功能蛋白分析和基因克隆
3.1几丁质酶及其基因克隆
碱性几丁质酶是板栗(Castaneasativa)子叶中丰
富的蛋白质,从中纯化了 Ch1(25kD)、Ch2(26kD)、
Ch3(32kD)等3个碱性几丁质酶,其中 Ch1属于
classⅡ内源几丁质酶,它可以抑制真菌 Trichoderma
viride的生长。Ch2和Ch3与抗Ch1抗体都有交叉反
应,Ch3富含半胱氨酸属于几丁质酶classIb,有抗真
菌活性(Coladaetal.,1992)。应用拟南芥classI几丁
质酶基因的中心区作为异源探针从欧洲板栗未成熟
子叶构建的cDNA文库中筛选出cDNA克隆,其开
放阅读框为951核苷酸,编码316个氨基酸残基,有
hevein类似的N-末端区域。但没有classIb几丁质
酶液泡定位所必需的 C-末端延伸区,因此 Ch3可
能是胞外定位的,Ch3可能首先合成带有 18个氨基
酸残基信号序列的前体,成熟多肽分子量为 31
978Da,等电点为7.9(Alonaetal.,1996)。
3.2其他抗真菌蛋白
从中国板栗的种子中分离的一个新的抗真菌
蛋白 castamolin的 N-末端序列与欧洲板栗的几
丁质酶的 N-末端序列几乎没有相似性,其分子量
为 37kD。IC为 50时,抑制人免疫缺陷病毒 -1反
转录酶的活性的浓度为 7!mol/L,抑制兔网状细胞
无细胞溶解液系统的浓度为 2.7mol/L。Casta-
molin对 Botrytiscinerea、Mycosphaerelaarachidi-
cola、Physalosporapiricola和 Coprinuscomatus等真
菌都有抗性,但没有凝集素活性 (WangandNg,
2003)。从中国板栗的种子中分离到的另一个
molisin蛋白质的 N-末段与 thaumatin-likepro-
teins(TLPs)有明显的一致性,可被Afi-gelbluegel
和MonoS.Molisin吸附,但不被 DEAE-celulose吸
附,其分子量为28kD,比TLPs的大。这种蛋白抑制
Fusariumoxysporum、Mycosphaerelaarachidicola和
Physalosporapiricola的菌丝体生长,对F.oxysporum
和 M.arachidicola的抗真菌活性高于法国菜豆和猕
猴桃果实的TLPs。Molisin的抗真菌活性在40℃保
温10min不受影响,60℃时活性下降,80℃时完全丧
失。在抑制HIV-1反转录酶活性方面,Molisin比猕
猴桃的TLPs更有效(ChuandNg,2003)。
3.3板栗半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CsC)
首次从欧洲板栗种子中纯化出 CsC,并从一个
未成熟板栗子叶cDNA文库中克隆了该抑制剂基因
全长 cDNA,同时在大肠杆菌中得到表达,应用 ma-
trix-assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrom-
etryanalysis、双向凝胶电泳和N-末端测序等方法确
认天然的 CsC和大肠杆菌中的表达物性质一样。
CsC的氨基酸序列包含了被认为是与抑制活性有关
的所有 3个基序(motifs),并与其它植物 cystatins序
列非常相似。重组 CsC抑制 papain、ficin、chymopa-
pain和cathepsinB的活性。与大多数cystatins不同
的是它对trypsin也有抑制活性,并且 CsC对 2个重
要 农 业 害 虫 (Tribolium castaneum 和 Der-
matophagoidesfarinae)的消化性蛋白酶也有活性。
CsC与大部分植物 cystatins的性质有些不同,它不
仅与昆虫和病源侵染的防卫有关,而且与非生物胁
迫也有关(Pernasetal.,1998;2000)。
应用EST方法,从美洲板栗茎cDNA文库中得
到71个单一的ESTs,后用RNA斑点杂交分析了20
个ESTs的表达特性,其中13个主要在茎和叶组织
中表达,另外7个在茎、叶和其它组织中表达(Con-
norsetal.,2001)。后研究表明其中的 CASde:Picl与
欧洲板栗 cystatincDNA有高度的一致性,通过测
序,推定的氨基酸序列中发现了所有抑制活性所需
的基序(motifs)。对美洲板栗和中国板栗中编码该假
定cystatin的基因片段的比较结果表明,包括缺失和
酶切位点改变在内的内含子区在2个种间有显著差
异(Connorsetal.,2002a)。
3.4伤应答基因
应用基因组步行技术和与从茎表达文库中分离
得到的 cDNA克隆 (CASdeBBP2、CASdeER10A和
CASdeHyp94)互补的引物相结合,分离了相应cDNA
克隆的启动子。这些启动子克隆到pCAMBIA载体上
的GUS报告基因的上游,转化拟南芥,通过肉眼和显
微观察,CASdeBBP2启动子在所有组织的维管束中
表达一致,CASdeHyp94启动子是组成性的,而CAS-
deER10A表达非连贯性活性(Connorsetal.,2002b)。
从离体培养的板栗小苗的茎组织中分离得到大
量伤应答基因的cDNA片段,其中假定编码1个丝
氨酸/苏氨酸蛋白激酶、2个钙调素同系物、1个分子
伴侣和1个富脯氨酸蛋白的基因的代表性片段或全
120
长cDNA克隆已被明确。应用伤害3h和24h后的差
异显示mRNA方法及随后的cDNA文库筛选,分离
得到了26个伤应答基因的 cDNA,通过序列比对,
将所分离基因的功能归为信号转导、胁迫和病源应
答、细胞壁修饰、蛋白和固醇代谢以及细胞间转运等
五类。利用反式Northern斑点杂交分析伤害和栗疫
病病原真菌接种的瞬时表达分析表明大部分伤应答
基因的表达量可被 Chryphonectriaparasitica接种所
改变。但Chryphonectriaparasitica总体上不抑制宿主
的基因表达,它通过特定途径影响转录体的积累。虽
然大部分基因表达的变化与在拟南芥中所观察到的
一致,但也发现了未知功能的基因,因此板栗或树木
的伤应答基因的调控可能不同于已知的草本植物
(SchafleitnerandWilhelm,1997;2002a;2002b)。
3.5热击蛋白
从欧洲板栗种子的子叶中纯化的蛋白质 CsH-
SP17.5,体外证据表明该蛋白有分子伴侣功能,推测
冷害抗性与 CsHSP17.5积累有关 (Coladaetal.,
1997)。应用重组CsHSP17.5在大肠杆菌中过量表达
证明了该推测,并且重组大肠杆菌从37℃转到50℃
培养,积累CsHSP17.5的细胞较对照细胞提高了生
存能力,细胞裂解物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分
析表明这种体内的保护作用是由于重组 CsHSP17.5
具有维持胞质蛋白依然处于天然构象的能力,并且
没有底物特异性。因此,CsHSP17.5代表了HSP在2
个极端温度下具有保护细胞的能力 (Sotoetal.,
1999)。研究欧洲板栗的茎中的季节性含量变化表明
CsHSP17.5在春季和秋季被显著上调节,夏末达到
最大量。此外,生长在培养箱中的板栗实生苗暴露于
寒冷条件下可快速激活 shsp基因的表达。纯化的
CsHSP17.5可有效保护冷易变酶乳酸脱氢酶的冷冻
失活(CsHSP17.5的活性比鸡蛋清白蛋白裂解酶的冷
冻保护作用高400倍),反复冷冻/化融丝毫不影响
稀释的CsHSP17.5的分子伴侣活性,也不影响其体
外形成十二聚体复合物的能力。这些结果进一步证
实 了 sHSPs积 累 与 冷 冻 抗 性 相 关 的 假 说
(Lopez-Matasetal.,2004)
3.6红血球凝集素
从日本板栗的子叶中纯化的红血球凝集素
(CCA)对唾液酸酶处理的人红血球的凝集作用非常
强,但可以被甘露糖、葡萄糖以及它们的衍生物所抑
制,甚至也可被具有N末端连接的复合碳水化合物
型糖蛋白所抑制,与其它植物凝集素一样具有强的
促有丝分裂活性。CCA的某些性质与甘露糖/葡萄
糖特异性的豆类凝集素相似,但其分子结构与它们
不同。通过氨基酸测序,CCA由309个氨基酸残基组
成,富含甘氨酸(16.5%)和 1个半胱氨酸残基,N-末
端氨基酸为Acetyl-Met-Glu-Glu。天然CCA(nCCA)
的C-末端序列分析只有单一序列(HMEYF),没有像
一些豆类凝集素所发生的转译后C-末端切割。CCA
可分为2个结构区域,N-末端和C-末端,几乎没有
中心区,这些区域有 35%的相同残基,因此 CCA有
重复序列。此外,两个区域与jacalin-relatedlectins有
27%~38%的一致性。这些结果表明CCA的结构类似
于 jacalin-relatedlectin的 2个分子 (Nomuraetal.,
1998;2000)。
克隆的 CCA的 cDNA的开放阅读框有 927bp,
编码309个氨基酸残基。天然CCA(nCCA)绝对分子
量为 332.7kD,表明 nCCA是有相同的 33kD亚基
组成的十聚体,他们还获得了与nCCA性质相同的
重组 CCA (rCCA)。应用 Northern比较日本板栗
CCA基因与其种子储存蛋白(SSP)基因的表达。SSP
mRNA是种子特异性的,而CCAmRNA不仅在种子
中而且在茎和花都有表达。应用Western分析时,所
观察的种子的所有组织中的提取物都呈阳性反应,
SSPmRNA的大量表达仅限于成熟晚期和收获期,
在休眠期表达水平不变,发芽期没有观察到其表达。
相反,CCAmRNA在发育的进程中保持高水平的表
达,休眠期相对低水平表达,在发芽期又表现高水平
表达,因此CCA的一个生理作用是作为营养储存蛋
白,其表达可能在转录和翻译两个水平上被调节
(Nakamuraetal.,2002;2004)。
从中国板栗(Castaneamolisima)的种子中也纯化
了一个新的具有使红血球凝集的甘露糖 /葡萄糖特
异性的凝集素,该凝集素的分子量为140kD,由2个
亚基组成,一个分子量为31kD,另一个为32kD。它
们与豆球蛋白的N-末端有相当大的同源性,并且在
酸、碱或温度高于50℃都不稳定,但不受各种盐离子
的影响(Ngetal.,2002)。
3.7其他蛋白质
从欧洲板栗花粉水相的提取物中提纯了分子量
为22kD的蛋白质(Cass1),通过与白桦(Betv1)、桤木
(Alng1)、榛子(Cora1)和角树(Carb1)的主要过敏原的
免疫点杂交和组胺释放方法证明该蛋白质代表了欧洲
板栗主要的过敏原活性。虽然分子量与Betv1(17kD)
栗属分子生物学研究进展
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
显著不同,但Cass1的N-末端氨基酸序列与Betv1
(17kD)显著相似,应用抗 Betv1单克隆抗体 BIP-1
的吸附试验和重组Betv1IgE-抑制实验证明它们的
免疫抗原性也接近(Kosetal.,1993)。
应用 Western-blot方法从板栗种子的子叶中检
测到了dehydrin,但是应用 LEAD11cDNA作为探
针分析其mRNA的表达时,只有在中等条件下杂交
才能得到杂交信号,但应用体外翻译技术可检测到
大量的dehydrin产物(Finch-Savageetal.,1994)。
4展望
板栗作为一个具有独特性质的树木树种,在木材
生产以及坚果生产方面占有独特的地位。在北美曾是
主要的木材生产树种之一,只是由于栗疫病的危害才
逐渐萎缩,现在又在逐渐恢复。板栗在我国分布广泛,
各地的地理条件、气候和栽培习惯差异等使我国板栗
形成了风味明显不同的品种群,而目前的遗传多样性
研究缺乏整体性,根据我们的研究,华北种群又分为
燕山和太行山2个明显不同的群体(待发表),我们已
在该种群筛选出带有“ 替码”、“ 垂枝”、“ 薄皮”等优良
农艺性状的品种,并已进行了8个品种(系)的9种杂
交组合,目前已得到3年生至8年生的杂交苗8000
余株,有些性状已在获得的杂交苗上得到表现,即将
开展分子标记和相关性状的基因定位研究。
致谢
本 研 究 由 河 北 省 农 林 科 学 院 重 点 项 目
(A03-1-01-15)资助。
参考文献
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