全 文 ：世界科学技术—中医药现代化★中药研究
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2010-04-02
修回日期：2010-04-19
＊ 科技部卫生行业科研专项（200802043）：药用植物 DNA barcoding(条形码)鉴定研究，负责人：陈士林。
＊＊ 联系人：高婷，博士研究生，主要研究方向：药用植物 DNA条形码，Tel：010-62899729，E-mail：tgao@implad.ac.cn；宋经元，副研究员，硕士生
导师，主要研究方向：药用植物功能基因组及 DNA条形码，Tel：010-62811448，E-mail：jysong@implad.ac.cn。
中国黄芪属药用植物 DNA条形码（ITS2）鉴定＊
□高 婷＊＊ 姚 辉 马新业 朱英杰 宋经元＊＊
（中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所 北京 100193）
摘 要：中国黄芪属植物种类繁多，具有重要的药用及生物学价值。本文采用了植物 DNA条形码
候选序列之一的 ITS2片段来探讨在黄芪属药用植物中的鉴定能力。结果显示，ITS2基因区通用性强，
序列在黄芪属物种间的差异较大，具有明显的 Barcoding Gap，能够正确鉴定 41 个黄芪属植物物种，
仅 6个物种不能鉴定。此外，ITS2的二级结构也具有一定的系统学及分类学意义。本研究表明 ITS2能
够作为黄芪属药用植物鉴定的 DNA条形码序列，具有重要的应用价值。
关键词：ITS2序列 黄芪属 鉴定 DNA条形码
doi: 10.3969/j.issn.1674-3849.2010.02.016
Astragalus L.黄芪属，属于豆科蝶形花亚科，全世
界约有 1600 个物种。我国黄芪属资源分布广泛，品
种繁多，据中国植物志记载为 400余种[1]。药用黄芪
主要分布于黄芪亚属（Subgen. Phaca Bunge）、华黄芪
亚属（Subgen. Astragalus）、簇毛黄芪亚属（Subgen.
Pogonphace Bunge）、裂萼黄芪亚属（Subgen. Cerci－
dothrin Bunge）和密花黄芪亚属（Subgen. Hypoglottis
Bunge）等 5个亚属[2]。2005版《中华人民共和国药典》
收载的黄芪属植物包括蒙古黄芪 A. mongholicus、膜荚
黄芪 A. membranaceus和扁茎黄芪（A. complanatus）[3]。
膜荚黄芪和蒙古黄芪均为国家三级保护植物，属渐
危种[2]。该属一些植物如紫云英 A. sinicus、笔直黄芪
A． strictus等含有植物毒素[5]。
黄芪属中药材品种较混乱 [2]，直接影响到药材质
量。除中药黄芪（膜荚黄芪、蒙古黄芪）外，其他很多
黄芪属植物均可为黄芪代用品，如多花黄芪、单体蕊
黄芪、金翼黄芪、东俄洛黄芪、贺兰山黄芪、川黄芪、
秦岭黄芪、白芪等，或一些地方习用品，如直立黄芪、
背扁黄芪等。市场上曾出现了约 4科 10种植物的种
子作为沙苑子（扁茎黄芪）的伪品，常见的有独尿豆、
凹叶野百合、尾州野百合、田皂角、紫云英、直立黄芪
的种子，前 3种种子均含生物碱，误服后出现中毒症
状，甚至致人死亡[6]。对黄芪属药用植物进行准确鉴
别是开展相关研究的基础，对植物资源保护和药用
植物安全合理利用具有重要意义。
有关黄芪属植物的鉴定，已有形态学、细胞学
(包括核型和染色体多态性 )、孢粉学、化学和
RAPD，PCR -RFLP，AP -PCR，SSCP 等 DNA 分子多
态性方面 [7~14]的研究，5S rRNA、ITS和 18S rRNA 等的
序列差异也曾被用于鉴定黄芪属某些植物 [15~18]。但
是这些分类方法均存在种种局限性 [19]，已不能满足
日益复杂的分类需求。因此，急需一种快速准确的
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鉴定方法。
DNA条形码（DNA barcoding）是一种通过短的标
准的 DNA序列作为标记来实现物种快速准确鉴定的
方法，具有操作简易、可重复性强、结果稳定可靠等优
点[20]，成为近几年国际生物鉴定及多样性研究的一个
热点。在动物界，线粒体细胞色素 c氧化酶亚基 1(Cy－
tochrome coxidase I，CO I) 被公认为为 DNA条形码序
列[21]。然而植物界的标准条形码
序列，各专家众说纷纭（如 psbA-
trnH、ITS、matK、rbcL等[22~26]）。其
中 ITS2 序列正在逐步引起广大
学者的关注。本课题组在 2010
年比较了 7条热门条形码序列，
通过对 6000余个样本的分析[27]，
依据各条形码评价指标，筛选出
ITS2 序列是药用植物鉴定最优
的序列，且物种水平的鉴定成功
率高达 92.7%。此外，多位学者
已提出 ITS2具有很多优点 [27~28]，
其序列长度较短，易于扩增，甚
至适用于已降解的药材 [29]；ITS2
作为 ITS 一部分，一直受到广大
系统进化专家青睐，被广泛用于
系统进化研究[28~30]。ITS2的二级
结构研究也具有一定的系统分
类价值[30，37]。然而 ITS2在黄芪属
的鉴定能力相关研究较少，因
此，本文采用 ITS2 序列来鉴定
黄芪属植物，探索该属植物的
DNA barcoding 鉴定方法，为植
物保护和利用提供数据基础和
科学依据。
一、材料与方法
1. 材 料
2007 年 7 月至 2008 年 9
月，自北京、陕西、湖北等地采集
了黄芪属 7 种重要药用植物的
14 份样品，经中国医学科学院
药用植物研究所林余霖副研究
员鉴定。同时我们在 GenBank数
据库下载中国植物志电子版及
EFOLRA中收载的中国全部黄芪属植物(下载日期是
2009 年 10 月)，共获得序列 70 条，黄芪属植物 47
种，材料详见表 1。3 个药典种及多个药用植物物种
都收集在内。研究材料中不少于 2 个样本数的物种
有 11个，样本总数为 34个。样本涵盖了中国黄芪属
全部 8个亚属[1]。
2. 样品 DNA的提取、PCR 扩增和测序
表 1 本研究采用的黄芪属植物样本的序列
Species Accession Number Species Accession Number
A. adsurgens AF121674 A. hoantchy subsp. dshimensis AF359755
A. adsurgens L10757 A. lehmannianus AF359756
A. adsurgens GU217639 A. lepsensis AF359752
A. adsurgens GU217640 A. leucocephalus AB231135
A. adsurgens GU217641 A. masanderanus AB051969
A. agrestis L10759 A. membranaceus AF121675
A. aksuensis AB231091 A. membranaceus AF359749
A. aksuensis AF359753 A. membranaceus EF685968
A. alopecias AB051949 A. membranaceus EU852042
A. alopecias U50509 A. membranaceus FJ572044
A. alpinus L10761 A. membranaceus GU217642
A. arpilobus AB051913 A. milingensis AF521954
A. austrosibiricus AF359758 A. mongholicus AF359750
A. bakaliensis AB051924 A. mongholicus EF685969
A. balfourianus AF521951 A. mongholicus GU217643
A. bisulcatus L10767 A. monticola EU282982
A. campylorrhynchus AB051914 A. oophorus AB051993
A. capillipes GU217636 A. ophiocarpus AB051927
A. capillipes GU217637 A. oxyglottis AB051932
A. capillipes GU217638 A. persepolitanus AB051920
A. chinensis AF121681 A. polycladus AF121676
A. chinensis FJ980292 A. pseudonobilis AB231117
A. chinensis GQ434365 A. scaberrimus AB051988
A. chinensis GQ434366 A. sesamoides AB051921
A. commixtus AB051925 A. sieversianus AF359757
A. complanatus AF521950 A. sinicus AB051965
A. complanatus U50501 A. sinicus U50503
A. cysticalyx AF121682 A. tanguticus AF521956
A. dahuricus GU217635 A. tribulifolius AF521953
A. filicaulis AB051919 A. tribuloides AB051922
A. frigidus AB231092 A. tribuloides L10795
A. hancockii GQ434364 A. uliginosus EF685970
A. hendersonii AF521957 A. variabilis GQ422821
A. hoantchy AF359754 A. vicarius AB051934
A. hoantchy AF521952 A. yatungensis AF521955
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对采集到的黄芪属植物（表 1）进行了 DNA提
取，rDNA ITS2序列扩增和测序方法见文献报道[27]。
3. 序列拼接和数据分析
测序峰图采用序列拼接软件 CodonCode Aligner
V 3.5（CodonCode Co.，USA）校对拼接，去除低质量
序列及引物区，进行多序列比对并人工校验。对于
ITS2 序列，拼接得到一致序列后使用基于隐马尔可
夫模型的 HMMer 注释方法去除两端 5.8S 和 26S 区
段获得 ITS2间隔区序列[31]。去掉测序质量差、不能确
定具体物种的（比如含“sp.”的序列）及不完整序列。
通过 HMM真菌模型（Florida State University，USA）计
算 K2P 距离。采用平均种内距离、最大种内距离、及
theta值来描述种内变异，相应的采用平均种间距离、
最小种间距离及 theta’值来描述种间变异 [27，32~33]。用
计算机 Perl 语言统计种间、种内遗传距离的分布频
度，评价 Barcoding Gap[23，27]。通过 Wilcoxon两个样本
的统计检验[22~23，27]，进一步比较种间、种内变异程度的
大小。最后采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距离
法（Nearest Distance）考察 ITS2的鉴定成功率[27，34]。
二、结果与分析
1. 序列通用性及种内种间差异分析
同以往的研究一样 [27，29，35~36]，ITS2序列在黄芪属
植物样品中也显示出很好的通用性。PCR 效率为
100%，测序效率为 85.7%。
ITS2序列长度变异为 207bp~214bp。种内变异较
小，变异度为 0.0%～14.8%，平均变异（All Intra-specific
Distance）为 1.1%，平均 θ值（Theta）为 0.0193，平均溯
祖度（Coalescent Depth）为 0.0243；而种间变异较大 ,
变异度为 0.0%～16.3%，平均最小变异（The Minimum
Inter-specific Distance）为 0.0%，平均变异（All Inter-
specific Distance）为 8.0%，种间变异 θ’值(Theta Prime）
为 0.0797。利用 Wilcoxon两个样本的统计检验，也再
次证实了这个结果：ITS2序列的种间变异远大于种内
变异（Wilcoxon Value= 3592，P<2.3536×10-24）。
2. Barcoding gap检验
以 0.002 为遗传距离基本单位，分析 ITS2 序列
遗传距离分布频度，并做出 Barcoding Gap（如图 1）。
尽管图中 ITS2序列种内变异和种间变异存在少量重
叠，但是 ITS2的 Barcoding Gap较为明显，相对来说，
种内种间遗传距离有所分离，且种间遗传距离为零
的样本比例仅仅占总样本的 0.37%。说明研究中绝大
多数物种的 ITS2序列具有唯一性，进而表示 ITS2 可
以将绝大多数物种进行区别和鉴定。
3. 鉴定效率
我们采用比对法（BLAST1）和最小距离法（Dis－
tance）同时评估 ITS2 的鉴定效率，结果表明，采用比
对法时，ITS2 对于物种的鉴定效率（可以鉴定的物种
数/总物种数） 高达到 87.0%，仅仅 6 个物种（A.
mongholicus 和 A. membranaceus；A. tribulifolius 和 A.
tanguticus；A.adsurgens 和 A. austrosibiricus） 不能鉴
定。使用最小距离法验证上述 6个物种仍无法鉴定，
此外，A. complanatus和 A. sinicus也不能正确鉴定。
4. 二级结构初步分析
ITS2 一级结构序列可以进行 RNA 二级结构预
测，解决高级分类阶元（如门、纲、目、科）的序列一
级结构差异过大而导致的比对失真问题，在系统进
化研究上具有重要意义，并且从二级结构的角度鉴
定物种也具有一定的意义 [30~31，37]。如图 2，选取了 4
个黄芪属物种的 ITS2 二级结构图（HMM 预测模
型），我们可以看到 4 个物种的二级结构相对保守，
ABCD 均具有Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ 4 个颈环结构，但同时
在各部分又存在细节上的差异，能够为鉴定提供依
据。如 a 和 b 的 Ⅱ部分碱基长度有所不同，Ⅱ，Ⅲ
部分的夹角也有差异。这种依据分子形态进行的鉴
定可称为 Molecular Morphological Characteristic，对于
今后进行更大范围的 ITS2 序列比对分析及鉴定具
有重要启示。
三、讨 论
采用 DNA条形码这种快速有效准确的鉴定方法
图 1 黄芪属 ITS2序列种内变异和种间变异分布图
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图 2 黄芪属 4个物种的 ITS2二级结构图
a. A.complanatus（U50501）；b. A.chinensis（AF121681）；
c. A.membranaceus（EU852042）；d. A.sinicus（AB051965）。
对我国豆科植物大属黄芪属进行植物鉴定，对于保
护濒危植物，保证药材市场安全生产及植物资源合
理利用具有重要意义。本研究用 ITS2序列鉴定我国
黄芪属药用植物，是样本量最大、密切相关物种最多
的研究之一。已有研究大多专注于该属的系统学研
究 [18]，或者仅仅对该属某一些物种 [16~17]做了鉴定分
析。本研究显示在豆科黄芪属植物样品中，ITS2序列
通用性较好，变异度适合，提供的遗传信息充足，鉴
定能力较强，因此 ITS2是一个非常有效的分子鉴定
序列；ITS2序列可以进行 RNA 二级结构预测，可解
决高级分类阶元的多重序列比对困难问题，其二级
结构还具有一定的鉴定应用价值[30，37]。因此对于更高
分类等级鉴定来说，ITS2 序列可能具有更广泛的应
用性。
ITS 序列比 ITS2 更早受到关注，其变异水平也
高于 ITS2, 然而 ITS 序列在某些植物类群中扩增成
功率很低 [27，38~39]，不符合条形码通用性的要求。而
ITS2 在广大植物类群中的通用性较好，如 ITS2 在
98 个科 326 个物种的 400 份样本中的扩增效率仍
能达到 93.8%[27]，在芸香科、重楼属植物中扩增效率
都较高（95%~100%）[36~37]。此外，ITS2 序列是系统进
化研究中常用的片段之一 [28~30]，网上有大量相关数
据可以利用。ITS2 具有较为保守的二级结构，在高
级结构上具有一致性，保证比对能够顺利进行 [30]。
因此，ITS2 跟其他几个条形码序列相比，具有一些
不可比拟的优势。
对于国际上提出的 ITS2 的真菌污染问题，本研
究通过 HMM 真菌模型，可以去掉这部分的影响，保
证数据的可靠性。对于 ITS2 的多拷贝问题，目前仍
存在争议，Coleman 指出 ITS 在基因组上数百个拷贝
间序列是高度相似的，在大多数物种中，PCR 扩增
的 ITS2 的拷贝可以代表该个体的 ITS2 核基因信
息，因此，ITS2 可以作为一个有效的单序
列条码进行使用 [40]。
ITS2 未成功区别鉴定的 6 个物种在传
统分类学上多存在争议。如膜荚黄芪和蒙
古黄芪在形态及化学成分上十分相似，但
是分类学家对于它们的分类关系一直存在
分歧。Hsiao[41]曾把 A. mongholicus 定做 A.
membranaceus 的一个变种。董婷霞 [17]曾采
用 5S rRNA Spacer，ITS 和 18S rRNA 来验
证，她的观点也支持二者为变种关系。蒺藜
叶 黄 芪 A. tribulifolius 和 甘 青 黄 芪 A.
tanguticus 的分类关系也十分复杂。甘肃南
部的漠北黄芪和甘青黄芪十分相似，因此
Wenninger（1991 年）[42]曾把二者合并为一
个种。康云等 [18] 用 ITS 序列分析也认为，
二者可能是变种关系。斜茎黄芪 A.adsur－
gens 和漠北黄芪 A. austrosibiricus 二者关
系也十分密切。Положий 曾因为二者形态
近似将其并为一种 [1]。总之，ITS2 为这些物
种的分类学难题提供了一个分子证据。
本研究认为 ITS2 序列比较适合做为
DNA 条形码用于黄芪属药用植物的鉴定。
本研究拓宽了 DNA条形码技术在植物界的
应用，并为黄芪属分类鉴定专家、系统进化
学家、种群遗传学家提供了一种新方法 [43]。
DNA 条形码技术将为黄芪属濒危植物保
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅱ
Ⅳ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ Ⅳ
Ⅱ
Ⅳ
Ⅲ
Ⅲ
a b
c d
225
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护、物种资源多样性研究及维持药材市场的稳定具
有重要意义。
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（责任编辑：李沙沙，责任译审：张立崴）
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Identification of Astragalus Plants in China Using the Region ITS2
Gao Ting， Yao Hui， Ma Xinye， Zhu Yingjie， Song Jingyuan
(Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences,
Beijing 100193, China)
Abstract: Astragalus is a large genus in China, containing various medicinal plant species. In this study, we tested
the applicability of a DNA barcode ITS2 for identifying medicinal plant species within the Astragalus genus. The re-
sult showed that ITS2 has great universality, proper intra- /inter-specific divergence, obvious Barcoding Gap, and
strong species discrimination power. Based on the BLAST1 method, 41 of 47 Astragalus species have been identi-
fied by ITS2. In addition, ITS2 secondary structure is of significance for the systematic and taxonomic study. There -
fore, ITS2 may be a useful barcode for Astragalus species, with great application value.
Keywords: ITS2, Astragalus, Identificaion, DNA barcoding
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