全 文 ：〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 1419
世界科学技术—中医药现代化★中药材DNA条形码鉴定研究
　　　收稿日期：2016-07-28
　　　修回日期：2016-08-10
＊　　 广东省中医院院内专项（2015KT1817）：岭南中草药 DNA条形码分子鉴定和生态适宜性研究，负责人：黄志海。
＊＊　 通讯作者：张晓柠，助理研究员，主要研究方向：分子生物学研究；丘小惠，研究员，主要研究方向：中药质量标准及物质基础研究。
大戟科叶下珠属植物余甘子 Phyllanthus emblica
Linn.具有重要的药用价值，其果实为中药余甘子，
收录于 2015版《中国药典》一部，药食兼用，具清热
凉血、消食健胃、生津止咳的功效。余甘子树皮以
“紫荆皮”之名收录于《北京市中药饮片炮制规范》
2008 版等地方标准，部分研究者认为其为紫荆皮
的正品 [1,2]。然而，由于历史和地区习俗等多种原因，
历代草本和各地方标准对紫荆皮的基原植物记载均
不相同，存在严重的“一名多药”现象，给监管带来难
题，如：《全国中药炮制规范》收载的紫荆皮来源为豆
科植物紫荆 Cercis chinensis Bunge，《上海市中药饮
片炮制规范》2008版收载紫金皮的来源为木兰科植
物南五味子 Kadsura longipedunculata的干燥根皮，
两者常难以分辨 [3]。此外，还有卫矛科植物昆明山
海棠 Tripterygium hypoglaucum Hutch（《滇南本草》）
的根皮、桃金娘科植物水翁 Cleistocalyx operculatus
的干燥树皮等多种植物来源 [4]。
DNA条形码鉴定技术基于遗传信息的鉴定方
法，具有鉴定准确快速、不受研究对象外部形态干扰
等特点，尤其适合以部位入药中药材的真伪鉴定 [5]。
其中 ITS2 条形码在中草药鉴定应用中非常广泛，
Chen等 [6]对 753个属 4 800个种内的 6 600个药用
植物样本进行研究，结果发现 ITS2在物种水平的鉴
定效率达到 92.7%，故推荐其作为药用植物的标准
条形码。Luo 等 [7] 以芸香科 72 属 192 种 300 个样
本为研究对象，通过候选条形码（matK、rbcL、psbA-
trnH、rpoC1、ycf5、ITS2、ITS）的对比筛选研究，发现
ITS2条形码在所考察的序列中具有最高的物种鉴定
成功率。基于前期研究，本文将探讨应用 ITS2条形
码技术鉴别余甘子及其同属药用植物及紫荆皮混伪
品的 DNA鉴定方法，为保证紫荆皮、余甘子等中药
材的质量提供依据。
应用 ITS2 条形码鉴定岭南药材余甘子及其
混淆中药品种＊
黄辉庆 1，黄志海 1，黄 娟 1，张 靖 1，张晓柠 2＊＊，丘小惠 1＊＊
（1. 广州中医药大学第二临床医学院 广州 510006；2. 国家人类基因组北方研究中心 / 北京诺赛基因组
研究中心有限公司 / 基因组学研究北京市重点实验室 北京 100176）
摘 要：目的：本研究应用 ITS2序列作为 DNA条形码，建立余甘子及其混淆品分子鉴定方法。方法：
收集 8种共 17份余甘子及其混淆品植物样本，提取基因组 DNA，扩增 ITS2基因并双向测序。所得序列采
用 Codon Code Aligner进行拼接，同时，从 GenBank数据库中获 3条相关 ITS2序列用于比较分析。利用
MEGA 6.06软件分析其种内及种间遗传距离，并构建系统进化树。结果：余甘子 ITS2序列长度为 208 bp，
与其他各物种种间变异位点较多，遗传距离较大，为 0.174-0.823。聚类树结果显示，余甘子基原植物独聚
一支，与其他混淆品能够容易区分。结论：本研究采用 ITS2序列能够有效鉴别余甘子及其混淆品基原植物，
可为保证临床用药真实安全提供技术支撑。
关键词：余甘子 ITS2序列 分子鉴定 DNA条形码
doi：10.11842/wst.2016.08.029　　中图分类号：R282　　文献标识码：A
2016　第十八卷　第八期　★Vol.18 No.8
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1 材料和方法
1.1 药材
本 研 究 共 收 集 余 甘 子 P. emblica 及 其 市
场 常 见 混 淆 品 紫 荆 C .chinensis、南 五 味 子 K.
longipedunculata、昆明山海棠 T. hypoglaucum、紫薇
Lagerstroemia indica L.、叶下珠 Phyllanthus urinaria
L.、小果叶下珠 Phyllanthus reticulatus Poir. 9个物种
共 20个样本。其中 17个样本为实地采集，材料由
广东省中医院黄志海主任药师鉴定，凭证标本已保
存于广东省中医院。此外，从 GenBank数据库中获
3条完整的 ITS2序列，验证后用于比较分析。具体
信息见表 1。
1.2 试剂和仪器
植物基因组 DNA 提取试剂盒（北京天根生化
科技有限公司，批号：P4104）；2×Taq PCR Mix 酶
（北京艾德莱生物科技有限公司，批号：262451AX）；
D2000 DNA Marker（日 本 TaKaRa 公 司，批 号：
P4219）；Glodview核酸染料（上海赛百盛基因技术有
限公司，批号：20151209）；β-巯基乙醇（美国 sigma
公司，批号：M6250）；Tris（美国 sigma 公司，批号：
V900483）；Tris-HCl（上海麦克林生化科技有限公
司，批号：T818979）；琼脂（美国 sigma 公司，批号：
V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，
其余试剂均为分析纯。
PCR system（美 国 Life Technologies 公 司，型
号：ProFlex）；水平电泳槽（美国 Bio-Rad公司，型号：
Mini-Sub Cell GT）；凝胶成像系统（美国 Bio-Rad公
司，型号：GelDoc XR+）；小型离心机（德国 eppendorf
公司，型号：5418）；多功能样品均质器（法国 Bertin
Technologies，型号：Precellys 24）；多功能垂直旋转
混合器（英国 Grant公司，型号：PTR-30/PTR-60）。
1.3 方法
选取低温干燥的植物叶片 30 mg或根皮 40 mg
左右，磨碎后采用天根植物基因组提取试剂盒提取
基因组 DNA，方法依照说明书。PCR扩增选用通用
引物，ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，
ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。
PCR 反应体系为 25 μL，包含：上下游引物各 1 μL
（2.5 μmol·L-1）、2×Taq PCR Mix 酶 12.5 μL、 总
DNA 2.0 μL、dd H2O 8.5 μL。 扩 增 程 序：94 ℃、5
min；94℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，
共 40 个循环；72℃、10 min[12]。PCR 扩增产物采用
1.2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳条带明亮、
单一、清晰的 PCR产物送至上海美吉生物有限公司
广州办事处完成测序。
1.4 数据分析
所得峰图利用 CodonCode Alinger 6.02 软件进
行校对拼接，基于隐马尔可夫模型的 HMMer注释
方法去除 5.8S 和 28S 区段，获得 ITS2 序列 [8]。将
所得序列采用软件 MEGA 6.06进行分析比对，基于
K2P模型进行种内种间遗传距离分析，并用邻接法
（Neighbour-Joining，NJ）及最大似
然法（Maximum Likehihood，ML）构
建系统发育 NJ树及 ML树 [9,10]，同
时以 bootstrap 支持率 1 000 次重
复检验各分支的支持率。
2 结果
2.1 ITS2 序列变异分析
余甘子序列长度均为 208 bp，
比对后发现种内无变异位点，GC
含量为 54%。将余甘子与其混伪
品紫荆、南五味子、昆明山海棠及
紫薇比对后发现，不同品种间存在
较多变异位点，分别为 80、90、80
及 85 个变异位点；同时该物种与
其同属植物蜜甘草、浙江叶下珠、
表 1 余甘子及其混淆品的样本信息
序号 基原物种 拉丁学名 采集地或序列信息
1-3 余甘子 P. emblica 江西
4 紫荆 C .chinensis 江西武陵
5-6 南五味子 K. longipedunculata 广东乐昌
7-8 江西
9-10 昆明山海棠 T. hypoglaucum GQ43476、HM115952
11 紫薇 L. indica AF201689
12 蜜甘草 P. ussuriensis 湖南祁东
13 浙江叶下珠 P. chekiangensis 广东乐昌
14-16 叶下珠 P. urinaria 广东肇庆
17-20 小果叶下珠 P. reticulates 广东肇庆
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叶下珠及小果叶下珠之间也存在明显差异，分别有
60、63、36及 42个变异位点。其余物种种内比对后
发现：南五味子序列长度为 231 bp，有 2个变异位点，
分别为 99、177位 T/C突变；昆明山海棠序列长度均
为 230 bp，种内存在 1个变异位点，为 80位 C/T突变；
小果叶下珠序列长度为 208 bp，种内均存在 2个变
异位点，分别为 35位 A/C 突变、144位 C/G突变；叶
下珠种内暂未发现变异位点。由此可见，余甘子及
其混淆品种间变异位点明显多于种内变异位点，能
够较好地区分。
2.2 遗传距离分析
基于 K2P模型分析得到各物种种内及种间遗传
距离。结果显示，余甘子种内遗传距离为 0，其余物
种种内遗传距离均不超过 0.013。种间遗传距离较
大，余甘子与其混淆品之间种间距离在 0.174-0.823
之间，具体各物种间 K2P距离见表 2。
2.3 聚类树分析
为确定 ITS2序列在余甘子与其混淆品之间的
鉴定能力，本研究采用邻接法及最大似然法分别构
建 NJ树和 ML树，同时去除 bootstrap 支持率小于
50% 的分支，聚类树见图 1 和图 2。分析显示，两
种聚类树结果基本一致。余甘子与叶下珠亲缘关
系最近，但两者之间 NJ 树支持率为 84.0%，ML 树
支持率为 65.0%，可将两者进行很好的区分。同属
植物余甘子、叶下珠、蜜甘草、浙江叶下珠及小果叶
下珠聚为一大支，符合植物分类学特点。同时，各
物种种内样本分别聚在一支，表现出单系性，与其
他品种能够明显区分。
表 2 余甘子及其混淆品种间遗传距离
药材 余甘子 紫荆 南五味子 昆明山海棠 紫薇 蜜甘草 浙江叶下珠 叶下珠 小果叶下珠
余甘子 0.648 0.627 0.487 0.693 0.375 0.391 0.174 0.238
紫荆 0.648 0.647 0.566 0.680 0.684 0.644 0.536 0.542
南五味子 0.658 0.685 0.693 0.703 0.762 0.572 0.520 0.520
昆明山海棠 0.493 0.590 0.742 0.546 0.666 0.537 0.456 0.535
紫薇 0.693 0.680 0.745 0.567 0.823 0.570 0.567 0.519
蜜甘草 0.375 0.684 0.784 0.697 0.823 0.478 0.379 0.379
浙江叶下珠 0.391 0.644 0.601 0.544 0.570 0.478 0.365 0.266
叶下珠 0.174 0.542 0.679 0.493 0.572 0.380 0.387 0.255
小果叶下珠 0.246 0.545 0.559 0.558 0.531 0.389 0.284 0.268
注：右上角为最小种间距离，左下角为最大种间距离。
图 1 基于 ITS2 序列的余甘子与其混淆品 NJ 树
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图 2 基于 ITS2 序列的余甘子与其混淆品 ML 树
3 讨论
根据调研，多数人认为正品紫荆皮来源为大戟
科植物余甘子的干燥树皮 [2]，为骨伤科和妇科常用
药材，具有消肿解毒、收敛止血、杀菌祛腐的作用；用
于痈肿、阴囊湿疹、外伤出血、跌打损伤、蛇虫咬伤。
临床使用的紫荆皮伪品主要来源于豆科植物紫荆
的干燥树皮及木兰科植物南五味子的干燥树皮。
由于“紫荆皮”未被《中国药典》收录，该药材品种
混乱，甚至在研究文献中来源也不尽相同 [11-13]。由
于 3 种植物来源于不同种属，药理作用及化学成分
存在一定的差异 [4,11]，在临床上不宜混用。由于地
方习俗和标准记载不一致，各地使用的紫荆皮来源
于不同基原植物，容易引起用药混乱，导致临床疗
效不确切。
传统鉴别专业性强，尤其是一些外观形态较为
相似或深加工饮片，通常无法进行快速鉴定。本实
验基于 ITS2序列建立了一种快速鉴定余甘子及其
他紫荆皮基原植物的方法。分析发现，余甘子及其
混淆品种内变异位点较少（为 0-2个），而种间均有
几十个变异位点，且物种内最大遗传距离（0.013）远
小于种间最小遗传距离（0.173），存在明显的条形码
间隔；NJ及ML进化树图结果显示，各物种单独成支。
以上结果均说明，利用 ITS2片段可迅速将余甘子及
其混淆品区分开来。同时，结果显示，物种 ITS2序
列非常稳定，如余甘子长度均为 208 bp、紫荆长度为
216 bp、南五味子序列长度为 231 bp，昆明山海棠长
度为 230 bp，表明 ITS2序列适用于余甘子与其混淆
品的鉴定。
本研究首次将临床常用紫荆皮的 3种基原植物
进行 ITS2序列分析，说明采用分子鉴定技术易将这
3种混用品区分开来。笔者认为，针对现在市场及临
床使用紫荆皮药材混乱现象，监管部门应制定统一
标准，规范该药的来源，同时更正其它以紫荆为皮名
的药材。结合传统鉴定技术及 DNA分子鉴定手段，
从源头保证药材来源的准确性，杜绝临床同名异药
现象。
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Molecular Identification of Phyllanthus emblica and Their Adulterants via DNA Barcode
Huang Huiqing1, Huang Zhihai1, Huang Juan1, Zhang Jing1, Zhang Xiaoning2, Qiu Xiaohui1
(1. The 2nd Clinical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China;
2. Chinese National Human Genome Center, Beijing / SinoGenoMax Co., Ltd / Beijing Key Laboratory of Genomics,
Beijing 100176, China)
Abstract: In order to guarantee the species correction of Phyllanthus emblica, a molecular identification method
taken ITS2 as DNA barcode has been verified. Samples from P. emblica and its adulterants were collected, and
their ITS2 regions were amplified and sequenced. Sequences were then assembled by CodonCode Aligner and
analyzed with MEGA 6.06. The Kimura 2-Parameter (K2P) distances were computed and the phylogenetic tree
was built using the neighbor-joining (NJ) and maximum likelihood (ML) trees. It was found that the length of ITS2
sequence of P. emblica was 208 bp. The K2P distance of the inter-specific samples between P. emblica and its
adulterants ranged from 0.174 to 0.823. The phylogenetic tree indicated that P. emblica and its adulterants could
be distinguished clearly. In conclusion, it was demonstrated that the ITS2 sequence was convevient for uncovering
the molecular evidence behind the identification of P. emblica and its adulterants, and provided a fundation for
identifying the original plants, which secured the safety and effectiveness of clinical medication.
Keywords: Phyllanthus emblica, ITS2, molecular identification, adulterants, DNA barcode
（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）