全 文 ：第 28 卷第 4期
2004 年 7月
南 京 林 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)
Journal of Nanjing Forestry University(Natural Sciences Edition)
Vol.28 , No.4　
Jul., 2004　
中国栗属特有种保守 RAPD片段分析
沈永宝 ,施季森
(南京林业大学国家林业局南方林木种子检验中心 , 江苏　南京　210037)
摘　要:利用 RAPD DNA分子标记技术研究了栗属特有种(板栗 、茅栗和锥栗)特异保守片段。 结果表明 , 从
520 多个随机引物中筛选出有扩增产物 , 且多态性丰富的 10 个引物 ,其中引物 B08(GTCCACACGG)分别在所有
供试的板栗 、茅栗和锥栗中均扩增出各自特异的 DNA 片段 , 其片段大小分别为 2 050 , 900 和1 500 bp。这些
DNA片段在种水平上的高度保守性 ,可以用来区分这 3 个种。此次研究结果同时也说明 RAPD 标记是鉴别近
缘种的理想工具。
关键词:RAPD标记;板栗;锥栗;茅栗;鉴定;保守 DNA片段
中图分类号:Q78　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-2006(2004)04-0051-03
Analysis on Conservative DNA Segment for Different Species
of Castanea in China by RAPD Marker
SHEN Yong-bao , SHI Ji-sen
(National Southern Tree Seed Inspection Center , Nanjing Forestry University ,Nanjing 210037 ,China)
Abstract:Identification method of plant species mainly done according to their morphologic characters can
not be applied to close species or their parts of tissue.However , development of DNA molecular markers
during the past more than 10 years made it possible.This paper studies the application of RAPD molecular
marker in distinguishing 3 different species following Castanea mollissima , C.henyi and C.seguinii.The
results shown that different special conservative segment of each species was enlarged with primer B07
(GTCCACACGG).Respectively three species-specific DNA segments weighted of 2 050 bp ,900 bp and 1
500 bp.This method can be used in species identification widely.
Key words:RAPD marker;Castanea mollissima;C.henyi;C.seguinii;Identification;Conservative seg-
ment of DNA
植物种间 ,特别是近缘种的区分比较困难 。即使是传统分类学可以区分的那些近缘种 ,当要区分其
不同发育阶段或附属器官(如种子 、幼苗等)时 ,传统分类学手段便难以做到。对种子 、苗木真实性的鉴
定是生产实际中经常遇到而又较难解决的问题 ,如华北落叶松 、兴安落叶松和日本落叶松种子的区别;
黑松 、黄山松 、马尾松等松属树种种子及幼苗的鉴别等 。20世纪 90 年代前 ,对近缘种或品种的研究主
要集中在酶上[ 1～ 3] ,但酶发育的阶段性以及标记数量有限性并不能满足需要。随着 DNA标记的发展 ,
在分子水平上对种或品种的鉴定研究越来越多 ,尤其是对品种鉴定。使用的标记包括 RAPD , RFLP ,
AFLP ,SSR , ISSR等[ 4] 。在RAPD标记方面 ,Perron等曾对云杉属几个种进行鉴别 ,获得红云杉和黑云杉 4
个种级水平上 100%保守的 RAPD标记[ 5] 。Furman等则获得了中美洲和墨西哥几个松属树种种级水平
的特异 RAPD谱带[ 6] 。在众多的 DNA分子标记中 ,RAPD标记在探求种水平上 DNA 保守片段有着独特
特点 ,即简单 、快速 、准确 。为此 ,以我国栗属特有种(板栗 、锥栗和茅栗)为研究对象 ,探讨这 3个种的保
守 RAPD片段 ,为进一步开展种的真实性鉴定奠定基础 。
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收稿日期:2003-09-29　　　　修回日期:2004-03-08
基金项目:国家林业局重点资助项目(2000-36)
作者简介:沈永宝(1963-),江苏新沂人 ,南京林业大学森林资源与环境学院副教授 ,博士。
1　材料与方法
1.1　材料采集及引物筛选
板栗叶片采于江苏溧阳龙潭林场板栗品种园;茅栗 、锥栗采于福建建瓯。每树种样品数量均为
30个单株。
DNA的提取采用文献[ 7]的 CTAB-硅珠法。
实验所用 520个寡核苷酸引物均购自上海生工生物技术有限公司 。经过对板栗 、茅栗和锥栗 DNA
的扩增 、初选和复选 ,选择多态性强 、扩增产物清晰的引物用于实验。
1.2　PCR扩增条件和反应体系
PCR扩增在 PE9600基因扩增仪上进行。反应条件为:94 ℃预变性 2 min后进入 38个循环(每循环
94 ℃变性 30 s ,40 ℃退火30 s , 72 ℃延伸 1.5 min)。所有循环完成后延伸7 min ,最后于 4 ℃保存。总反
应体积 20 μL ,其中 5 ng 左右模板 DNA ,10 μmol引物 ,dNTP 各为 100 μmol/L , 2μL 10×反应缓冲液(100
μmol/L Tris-HCl(pH8.3), 500 μmol/L KCl ,2.0 mmol/L MgCl2 ,0.01%明胶 ,5.0 g/L BSA),1.0U TaqDNA聚
合酶。扩增产物在含溴化乙锭的 1%琼脂糖凝胶中电泳分离 ,最后在紫外灯下用Polaroid成像系统记录
扩增产物 。
2　RAPD分析结果
近源物种在长期的进化过程中 ,由于生殖隔离 、地理隔离或生态位上的差异 ,在系统分类上具有相
对稳定性。分子遗传学研究表明基因的进化可以反映物种的进化。由于基因进化频率不同 ,导致种在
不同分类等级上具有一定保守性[ 8] 。从图 1中可明显看出各个种 RAPD片段同源性较差 。但在进化过
程中 ,不同种同时固定了不同基因 ,在种水平上表现出高度的保守性 。实验中最终选择 10个引物 ,通过
对板栗 、锥栗和茅栗大量样品的 RAPD分析 ,发现引物 B08(GTCCACACGG)分别在板栗 、茅栗和锥栗的各
个样品中 ,扩增出各自特异保守片段(图 1),片段的大小分别为 900 ,1 500和 2 050 bp。这些保守性片段
是识别种的特异片段 。
图 1　板栗 、茅栗和锥栗特异 RAPD片段(引物 B08:GTCCACACGG)
Fig.1　Conservative DNA segment for different species of Castanea spp.in China by RAPD maker
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南 京 林 业 大 学 学 报(自 然 科 学 版)　　　　　　第 28卷　第 4 期　
3　讨　论
由于品种之间的遗传相似程度较高 ,在 PCR基础上的一些标记 ,如 RAPD ,AFLP 和 ISSR等 ,许多扩
增产物相同。DNA水平上对种的鉴定与品种鉴定有所不同 ,即使是比较近缘的种 ,其 DNA的同源性较
差 ,但可利用物种在进化过程所固定的特异基因位点进行近缘种的鉴定 。由于 RAPD标记可用的随机
引物数量多 ,所以不难寻找种间的这些保守 DNA片段。笔者在大量引物的筛选过程中 ,选择 1个随机
引物就分别扩增出 3个种的特异保守 DNA片段。在用 RAPD寻找种的特异保守片段时并不都是这样
幸运 ,有时发现每个种的特异保守片段是由各自引物来实现 ,但也同样达到鉴别种的目的 。用 RAPD标
记寻找种的特异保守片段时 ,还可以先建立摸板 DNA 基因池[ 6] 。如取 40株左右个体材料 ,混合提取
DNA ,建立种的初级基因池 ,通过 RAPD扩增 ,寻找各种初级基因池间有差异的谱带 ,再分种源各取 10
个个体材料 ,混合提取DNA ,建立各种的亚基因池 ,以亚基因池验证在初级基因池中所获得的差异性谱
带重复性及在种内的保守性 ,最后用单个个体进行验证 。
鉴于 RAPD标记的局限性 ,即稳定性不高 ,易受实验条件变化的影响等 ,用 RAPD标记获得的特异
DNA片段还很难用于实际 ,除非很严格地控制实验条件 。笔者认为 ,可将 RAPD片段进行转化 ,即经过
克隆 、测序 ,然后根据测定的序列合成特异的 PCR引物 ,实现 RAPD标记向 SCAR标记的转化 ,从而对物
种相应的保守片段进行特异性 PCR扩增。
[ 参 考 文 献 ]
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(责任编辑　郑琰炎炎)
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　2004 年　总第 112 期　　　　　　　沈永宝等:中国栗属特有种保守 RAPD片段分析