全 文 ：收稿日期:2011 － 02 － 25
作者简介:李莉(1983 －) ，女，博士研究生，研究方向:药用
植物种质资源与质量关系;刘志华(1979 －) ，
男，副研究员，研究方向:生物信息学与系统生
物学，并列第一作者。
* 通讯作者:秦民坚，教授，E － mail:minjianqin@ 163． com
刘志华，E － mail:zhliu@ implad． ac． cn
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2011． 05． 013
HPLC法同时测定千斤拔属植物 7 种黄酮的含量
李 莉1，2，刘志华3* ，秦民坚1，2*
(1．中国药科大学中药资源学研究室，江苏 南京 210009;2．中国药科大学教育部现代中药研究重点实验室，
江苏 南京 210009;3． 中国医学科学北京协和研究院药用植物研究所，北京 100193)
摘 要 目的:测定千斤拔属 7 种植物中的 7 种黄酮类的含量，为千斤拔类药材质量控制提供依据。方法:色谱条
件为 Hedera C18色谱柱 (250 mm ×4． 6 mm，5． 0 μm) :流速 1． 2 mL /min，流动相为 0． 5% HAc水和乙腈梯度洗脱，
柱温 35℃，检测波长 263 nm。结果:七种黄酮类成分在 90 min内达到现行分离，线性关系良好，(R2 ＞ 0． 9995) ，日
内、日间精密度、稳定性和重复性的 RSD≤3． 0%。该法成功的应用于千斤拔药材 7 种黄酮的评均回收率分别为
96． 94% ～ 105． 29% (RSD≤2． 98%)结论:本方法准确、快速、重现性好，不同品种的千斤拔药材质量存在差异，可
以为研究千斤拔药材的质量标准提供依据。
关键词 千斤拔;HPLC;黄酮;含量测定
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2011)05 － 0054 － 04
Simultaneous Determination of Seven Flavonoids
in the Radix of Flemingia by HPLC
Li Li1，2，Liu Zhihua3，Qin Minjian1，2
［1． Department of Resources Science of Traditional Chinese Medicines，China Pharmaceutical Universi-
ty，Nanjing 210009，China;2． Key Laboratory of Modern Traditional Chinese Medicines (Ministry of Ed-
ucation) ，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;3． Institute of Medicinal Plant De-
velopment，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100193］
Abstract Objective:To develop a High － Performance Liquid Chromatography (HPLC)method for the
simultaneous determination of the radix of Flemingia． Method:The separation was carried out on a Hed-
era ODS(4． 6 mm ×250 mm，5 μm)column eluted with in mobile phases of water containing 0． 5% HAc
and Acetonitrile gradient mode at the flow rate of 1． 2 mL /min． The detective wavelength was 263nm and
column temperature was 35 ℃ ． Results:The good separation of seven flavonoids was achieved within 90
min and showed good linear relationship (R2 ＞ 0． 9995) ，with the RSD of intra － day and inter － day
presision ，repeatability and stability ＜ 3． 0% ． The average recoveries of the seven flavonids were within
96． 94% －105． 29%(RSD≤2． 98%)． Conculsion:The developed method is simple，accurate and re-
peatable，and can be readily used as a powerful tool for the quality control of Flemingia．
Key words Flemingia;HPLC;flavonoids;determi-
nation
豆科(Leguminosae)千斤拔属(Flemingia)植物
在我国有 16 种 1 变种，主要分布于西南、中南和东
南等 11 个省份［1］。千斤拔属植物在我国一直作为
民族药及民间药而被广泛使用，大都具有补肝肾、祛
—45—
第 30 卷第 5 期
2011 年 10 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Resources
Vol． 30 No． 5
Oct． 2011
风湿、强腰膝等功效，民间常用于治疗风湿性关节
炎、腰腿痛、腰肌劳损、气虚脚肿、肺虚久咳、白带、月
经不调、跌打损伤等症［2 － 3］。
现代化学与药理研究结果表明，千斤拔属植物
主要含有多种异黄酮，黄酮，二氢异黄酮和香豆雌醇
等化合物［4 － 7］，其中黄酮类成分是千斤拔属的特征
性成分，具有良好的雌激素与抗雌激素作用、抗炎镇
痛、抗血栓和抗氧化作用［8 － 11］。随着其在临床上治
疗妇科炎症和治疗关节炎方面发挥着越来越大的作
用，需求量也相应的不断增大，但是作为千斤拔药材
的基源植物蔓性千斤拔、大叶千斤拔和锈毛千斤拔
的资源却日益匮乏，不能满足临床应用得需要。因
此，我们采集了千斤拔属七个不同品种，并对其中的
六种主要成分的含量测定进行了测定，以求为进一
步控制药材质量和扩大药源提供理论依据。
1 仪器、试剂与材料
1． 1 供试样品
所有植物样品均采自不同产地，经作者鉴定，中
国药科大学中药资源教研室秦民坚教授复核，为豆
科植物千斤拔属植物蔓性千斤拔、大叶千斤拔、宽叶
千斤拔、绒毛千斤拔、腺毛千斤拔、云南千斤拔、球穗
千斤拔共 7 个品种 14 个样品。均取其根部为实验
材料，凭证标本存放于中国药科大学标本馆。样品
编号、种名采集地、采集时间如表 1 所示。
表 1 千斤拔药材的样品信息
样品编号 样品名 采集时间 采集地
FP1 Flemingia philippinensis 2008，8 广西钟山
FP2 F． philippinensis 2008，8 广西钟山
FP3 F． philippinensis 2008，8 广西南宁医科院植物园
FP4 F． philippinensis 2008，8 云南景洪医科院植物园
FM1 F． macrophylla 2008，8 湖南炎陵
FM2 F． macrophylla 2008，7 云南勐海
FM3 F． macrophylla 2008，7 云南大渡岗
FGR1 F． grahamiana 2008，7 云南勐阿
FGR2 F． grahamiana 2008，7 云南勐养
FG1 F． glutinosa 2008，7 云南景洪医科院植物园
FW1 F． wallichii 2008，7 云南景洪医科院植物园
FW2 F． wallichii 2008，7 云南大渡岗
FS1 F． strobilifera 2008，7 云南勐阿
FL1 F． latifolia 2008，7 云南勐阿
1． 2 试剂与标准品
乙腈为色谱纯 (TEDIA，Fairfeld，OH，USA) ，
超纯水由 Milli － Q系统制备 (Milli － pore，Bedford，
MA，USA) ，乙酸为分析纯(南京化学试剂有限公
司，江苏) ，甲醇为色谱纯(汉邦，江苏)。
对照品染料木苷 genistin (1) ，orobol(2) ，染料
木素 genistein (3) ，3’－ O － methylorobol(4) ，lupin-
abin A(5) ，鹰嘴豆素 A biochanin A (6) ，5 7，3＇，4＇－
tetrahydroxy － 6，8 － diprenylisoflavone 均为本实验室
自行分离纯化所得，经 NMR、MS 等方法鉴定其结
构，HPLC检测纯度，均在 98%以上。
1． 3 仪器
高效液相色谱系统为安捷伦 1100 高效液相系
统 (Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA) ;色
谱柱为 Hedera C18 column (250 mm × 4． 6 mm，5． 0
μm) ;十万分之一天平(上海天平仪器厂)。
2 实验方法
2． 1 供试品溶液的制备
精确称取各药材干燥根粉末各 0． 5 g，加入 20
mL甲醇，超声提取 30 min，重复超声 1 次，过滤洗
涤。滤渣中，再加入 20 mL 甲醇，超声提取 30 min，
过滤，合并续滤液，浓缩成浸膏，以色谱甲醇定容 10
mL容量瓶中，过 0． 45 μm 滤膜，即得供试品溶液，
每次精确进样 20 μL。
2． 2 对照品溶液的制备
称取一定量的各对照品，色谱甲醇溶解，各自稀
释至合适的浓度作为储备液。混合对照品储备溶液
由 7 个对照品的储备液混合定容于甲醇中制得，4℃
以下保存备用。
2． 3 色谱条件
表 2 色谱洗脱条件
时间(min) A(%) B(%)
0 85 15
6 75 25
16 75 25
32 60 40
38 46 54
44 46 54
58 32 68
66 32 68
72 24 76
76 14 86
85 5 95
—55—
第 5 期 李 莉，等:HPLC法同时测定千斤拔属植物 7 种黄酮的含量
流速 1． 2 mL /min，柱温 35℃，进样量 20 μL，检
测波长 263 nm，流动相为 0． 5% HAc 水(A)和乙腈
(B) ，洗脱程序如表 2 所示。
2． 4 标准曲线的制作
分别精密吸取混合对照品溶液 6 个不同体积，
置容量瓶中，色谱甲醇定容至刻度，进样 20 μL，测
定峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度(μg /
mL)为横坐标，绘制标准曲线，见表 3。
表 3 七种黄酮类成分的回归方程、线性关系 LOD 和 LOQ值
标准品 回归方程 R2(n = 6) 线性范围(μg /mL) LOD(ng) LOQ (ng)
genistin y = 88． 701x + 60． 909 0． 9995 0． 84 ～ 84． 0 1． 1 4． 0
orobol y = 92． 835x + 23． 941 0． 9998 0． 52 ～ 52． 0 0． 7 3． 7
genistein y = 172． 55x + 48． 122 0． 9997 0． 51 ～ 51 0． 3 1． 2
3 － O － methylorobol y = 142． 45x + 26． 237 0． 9995 0． 49 － 49 0． 8 1． 9
lupinalbin A y = 28． 024x + 30． 117 0． 9995 0． 63 ～ 63 0． 6 2． 1
biochanin A y = 167． 3x + 14． 384 0． 9996 0． 17 ～ 17 0． 9 3． 0
5，7，3，4 － tetrahydroxy － 6，8 － diprenylisoflavone Y = 113． 85x － 11． 85 0． 9998 2． 4 ～ 120 1． 3 4． 5
2． 5 精密度实验
取混合标准品溶液，连续进样 6 次，测定其日内
精密度;取混合标准品溶液，连续 3 天进样，测定其
日间精密度。计算各待测峰的相对标准偏差 RSD，
结果见表 4，RSD均小于 3． 0%，说明仪器的精密度
良好。
2． 6 稳定性实验
取样品 FP4 溶液各 20 μL，分别在配制后 0，2，
4，6，12，24 h 进样 1 次，计算各待测峰的相对标准偏
差 RSD，结果见表 4 。RSD均小于 3． 0%，说明样品
的稳定性良好。
2． 7 重复性实验
同混合标准品溶液称取 5 份，按供试品溶液制
备项下要求，制备成供试品溶液，进样检测，计算各
待测峰的相对标准偏差 RSD，结果见表 4。RSD 均
小于 3． 0%，说明样品的稳定性良好。
表 4 精密度，稳定性，重复性结果
标准品
精密度
日内精密度 日间精密度
稳定性 重复性
1 0． 91 2． 39 1． 70 0． 97
2 0． 78 1． 96 2． 90 1． 98
3 1． 67 2． 41 1． 52 2． 32
4 0． 63 2． 08 2． 93 2． 09
5 1． 18 2． 47 1． 68 1． 50
6 0． 73 2． 56 1． 86 2． 40
7 1． 58 2． 76 2． 17 3． 0
2． 8 加样回收率实验
精密称取已知含量的千斤拔样品 FP4 粉末 0． 5
g，加入已知浓度混合对照品溶液适量，按“样品溶
液的制备”项下制备 3 份，分别测定加样回收率。
具体数据见表 5。结果表明，7 种对照品的加样回收
率都在 95%到 106%之间，说明加样回收率良好。
表 5 各标准品加样回收试验结果
标准品
样品中量
(mg)
加入量
(mg)
测得量
(mg)
回收率
(%)
平均值 RSD%
1
0． 159 0． 087 0． 247 98． 85 96． 94 1． 48
0． 161 0． 244 95． 4
0． 155 0． 239 96． 55
2
0． 104 0． 071 0． 173 97． 18 97． 18 1． 18
0． 103 0． 171 95． 77
0． 107 0． 177 98． 59
3
0． 113 0． 101 0． 216 101． 98 99． 67 1． 69
0． 111 0． 21 98． 02
0． 112 0． 212 99． 01
4
0． 008 0． 009 0． 0172 102． 22 103． 7 1． 01
0． 008 0． 0174 104． 44
0． 007 0． 0164 104． 44
5
0． 16 0． 143 0． 3 97． 9 98． 37 0． 34
0． 164 0． 305 98． 6
0． 158 0． 299 98． 6
6
0． 015 0． 017 0． 033 105． 88 105． 69 0． 26
0． 017 0． 035 105． 88
0． 014 0． 0319 105． 29
7
0． 03 0． 032 0． 061 96． 88 98． 96 2． 98
0． 031 0． 064 103． 13
0． 034 0． 065 96． 88
2． 9 样品测定
在 2． 1 节色谱条件下，取不同品种的千斤拔药
材供试液，进行测定(n = 3) ，每次进样 20 μL。外标
法计算样品含量，含量计算结果见表 5，对照品溶
液、药材样品的色谱图见图 1。
—65—
中 国 野 生 植 物 资 源 第 30 卷
表 5 千斤拔药材的七种黄酮的含量测定结果
样品
编号
含量(mg /mL)
genistin orobol genistein
3 － O － methy
lorobol
lupinalbin
A
biochanin
A
5，7，3，4 － tetrahydroxy
－ 6，8 － diprenylisoflavone
FP1 0． 135 0． 029 0． 088 0． 006 0． 035 0． 014 0． 027
FP2 0． 159 0． 104 0． 113 0． 008 0． 160 0． 015 0． 030
FP3 0． 077 0． 089 0． 080 0． 004 0． 187 0． 002 0． 008
FP4 0． 159 0． 104 0． 113 0． 005 0． 154 0． 019 0． 028
FM1 0． 377 0． 443 0． 327 0． 008 0． 014 0． 000 0． 043
FM2 0． 461 0． 137 0． 184 0． 013 0． 203 0． 008 0． 047
FM3 0． 436 0． 133 0． 453 0． 013 0． 223 0． 031 0． 039
FGR1 0． 502 0． 212 0． 382 0． 017 0． 482 0． 072 0
FGR2 0． 094 0． 055 0． 080 0． 014 0． 082 0． 005 0
FGL 0． 775 0． 187 0． 153 0． 032 0． 218 0． 015 0
FW1 0． 377 0． 075 0． 267 0． 017 0． 046 0 0
FW2 0． 387 0． 183 0． 151 0． 019 0． 057 0 0
FS 0． 238 0． 036 0． 242 0． 000 0． 072 0 0
FL 2． 255 1． 065 0． 380 0． 012 0． 086 0 0
A标准品 1 genistin ，2 orobol，3 genistein，4 3’－ O － methylorobol，5 lupinabin
A，6 biochanin A，7 5，7，3＇，4＇－ tetrahydroxy － 6，8 － diprenylisoflavone;B样品
图 1 高效液相色谱图
3 讨 论
3． 1 数据结果
通过分析数据得知，7 种千斤拔属植物均含有
genistin，orobol，genistein，3 － O － methylorobol 和
lupinabin A这 5 种黄酮类物质，除球穗千斤拔和宽
叶千斤拔外，其余 5 种千斤拔均含有 biochanin A，而
化合物 5，7，3，4 － tetrahydroxy － 6，8 － diprenyli-
soflavone则只存在于蔓性千斤拔和大叶千斤拔中。
以 7 种黄酮的总量来计算，采自云南勐阿的宽叶千
斤拔所含黄酮总量最高，为 3． 80 mg /mL。而作为分
布省份最广，市场使用最多的蔓性千斤拔品种，虽然
7 种黄酮都含有，但是总量却较低，特别是采自广西
GAP生长基地的蔓性千斤拔 FP1 黄酮含量为最低，
仅为 0． 33 mg /mL。因为黄酮类物质是一种次生代
谢产物，我们分析除品种有关外，可能还与生长环
境，生长年限等有关。
3． 2 对照品及提取条件的选择
千斤拔属植物化学成分复杂，作者通过对蔓性
千斤拔进行的化学成分分析得出，主要成分为小极
性的简单异黄酮类物质，并具有较高的活性，因此选
择 6 个异黄酮类化合物和 1 个异黄酮的衍生体化合
物为对照品，综合评价药材质量。采用单因素考察，
在比较了超声提取、热回流提取及索氏提取的方法
效果，因为千斤拔内主要为小极性化合物，最终选定
100%纯甲醇，超声提取的方式，提取的物质杂质较
少，且能将主要的活性成分提取完全。
3． 3 流动相系统的选择
分别以甲醇 －水、乙腈 －水、乙腈 － 0． 5%的冰
醋酸水和乙腈 － 0． 5%的甲酸水等不同浓度和比例
的流动相系统的色谱图，最终确定以乙腈 － 0． 5%冰
醋酸为流动相进行梯度洗脱。
3． 4 检测波长的选择
根据紫外全波长扫描的结果显示，千斤拔在
206 nm、263 nm 和 335 nm 处均有最大吸收。实验
分别在 206 nm、263 nm 和 335 nm 下对各样品的色
谱峰进行比较，结果发现在 263 nm下的各黄酮成分
峰形较好，基线较稳， (下转第 65 页)
—75—
第 5 期 李 莉，等:HPLC法同时测定千斤拔属植物 7 种黄酮的含量
制制备工艺条件下可以制备出三维尺度相差不大的
微晶 B纳米纤维素，Z均粒径为 163． 8 nm。
参考文献
［1］ 丁喜桂，叶思源，高宗军． 粒度分析理论技术进展及其应用
［J］． 世界地质，2005，24(2) :203 － 207．
［2］ 梁国标，李新衡，王燕民． 激光粒度测量的应用与前景［J］．
材料导报，2006，20(4) :90 － 93．
［3］ 李向召，谢 康，黄志凡，等． 激光粒度仪的技术发展与展望
［J］． 现代科学仪器，2009(4) :146 － 148．
［4］ 孙 丽，罗 婷，梁 蕾． 浅述激光粒度仪的应用［J］． 佛山
陶瓷，2011(1) :37 － 39．
［5］ 刘雨佳． 激光粒度测量仪的应用及展望［J］． 航空精密制造技
术，2009，45(5) :43 － 45．
［6］ 胡汉祥，丘克强． 激光粒度分析结果在形貌分析中的应用
［J］． 理化检验 －物理分册，2006，42(2) :72 － 73．
［7］ 李 兰，石玉成． 激光粒度分析仪测量黄土粉体粒度的应用
研究［J］． 甘肃科学学报，2009，21(4) :46 － 50．
［8］ 杨道媛，马成良，孙宏魏，等． 马尔文激光粒度分析仪粒度检测
方法及其优化研究［J］． 中国粉体技术，2002:8(5):27 －30．
［9］ 中国科学院中国植物志编辑委员会． 中国植物志［M］． 北京:
科学出版社，2002:27 － 28．
［10］ 杨利民． 植物资源学［M］． 北京:中国农业出版社，2008．
295 － 309．
［11］ 蒋玲玲，陈小泉． 纳米纤维素晶体的研究现状［J］． 纤维素
科学与技术，2008，16(2) :73 － 78．
［12］ 叶代勇． 纳米纤维素的制备［J］． 化学进展，2007，19(10) :
1568 － 1574．
［13］ 李金玲，陈广祥，叶代勇． 纳米纤维素晶须的制备及应用的
研究进展［J］． 林产化学与工业，2010，30(2) :121 － 125．
［14］ 朱世东，周根树，蔡 锐，等． 纳米材料国内外研究进展
［J］． 热处理技术与装备，2010，31(3) :1 － 5，26．
［15］ 张力平，唐焕威，曲 萍，等． 一维棒状纳米纤维素及光谱
性质［J］． 光谱学与光谱分析，2011，31(4) :1097 － 1100．
［16］ Bai W，Holbery J，Li K． A technique for production of nanocrys-
talline cellulose with a narrow size distribution［J］． Cellulose，
2009，16:455 － 465．
［17］ Liu D，Chen X，Yue Y，et al． Structure and rheology of nano-
crystalline cellulose ［J］． Carbohydrate Polymers，2011，84:
316 － 322．
［18］ Hamad W Y，Hu T Q． Structure － process － yield interrelations
in nanocrystalline cellulose extraction［J］． The Canadian Journal
of Chemical Engineering，2010，88:392 － 402．
［19］ Ma H，Zhou B，Li H S，et al． Green composite films composed
of nanocrystalline cellulose and a cellulose matrix regenerated
from functionalized ionic liquid solution［J］． Carbohydrate Poly-
mers，2011，84:383 － 389．
［20］ 倪寿亮． 粒度分析方法及应用［J］． 广东化工，2011，38(2) :
223 － 224，227．
［21］ 李建立． 基于光散射的微粒检测［D］． 烟台:烟台大学，
2009:9 － 60．
［22］ 徐怀洲，陈 军． 关于激光粒度仪测试报告的解析［J］． 中
国水泥，2007(3) :
櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚櫚
90 － 92．
(上接第 57 页)
各色谱峰之间的分离度高，因此选用 263 nm为其检
测波长。
参考文献
［1］ 韦裕宗． 中国千斤拔属植物的初步研究［J］． 广西植物，
1991，11(3) :198 － 204．
［2］ 吴征镒． 新华本草纲要［M］． 上海:上海科学技术出版社，
1991:138 － 140．
［3］ 中华人民共和国卫生部药典委员会． 中华人民共和国药典
(1977 年版) ［S］． 北京:人民卫生出版社，1978:附录 22．
［4］ Ahn E M，Nakamura N，Akao T，et al． Estrogenic and Antiestro-
genic Activities of the Roots of Moghania philippinensis and Their
Constituents［J］． Biol Pharm Bull，27(4) ，2004:548 － 553．
［5］ 张 雪，宋启示． 锈毛千斤拔根的化学成分研究［J］． 中草
药，2009，40(6) :865 － 868．
［6］ Ahn E M，Nakamura N，Akao T，et al． Prenylated flavonoids
from Moghania philippinensis［J］． Phytochemistry，2003，64:1389 －
1394．
［7］ Shiao Y J ，Wang C N ，Wang W Y，et al． Neuroprotective fla-
vonoids from Flemingia macroplylla［J］． Planta Med，2005，71:
835 － 840．
［8］ 陈 一，李开双，黄凤娇，等． 千斤拔的镇痛和抗炎作用
［J］． 广西医学，1993，15(2) :77 － 79．
［9］ Bonnie S P，Ying Y K，Chen T Y． Anti － oxidative and anti － in-
flammatory activities of two different species of a Chinese herb I －
Tiao － Gung［J］． Life Sciences． 2005，77:2830 － 2839．
［10］ Hsieh P C，Huang G J，Ho Y L，et al． Activities of antioxida-
nts，α － Glucosidase inhibitors and aldose reductase inhibitors of
the aqueous extracts of four Flemingia species in Taiwan［J］． Bo-
tanicl Stusies，2010，51(3) :293 － 302．
［11］ 牛艳秋，关 铭，靳丹虹，等． 大叶千斤拔抗血栓实验研究
［J］． 长春医学，2007，5(1) :3 － 6．
—56—
第 5 期 刘志明，等:微晶和芦苇浆纳米纤维素的粒度分布分析