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杨树花、千里光、连翘与抗菌药联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用



全 文 :  收稿日期:2012-12-27
  基金项目:河南省重点科技攻关项目(122102110185)
  作者简介:张国祖(1957-),男,副教授。
杨树花、千里光、连翘与抗菌药联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用
张国祖1,贾艳华2,郭振环2,马仲彬2,李荣誉1,刘 梅2 (1.郑州牧业工程高等专科学校,河南 郑州450008;
2.河南省康星药业股份有限公司,河南 郑州451464)
摘要:采用琼脂稀释法分别测定杨树花、千里光、连翘与头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星3种抗菌药联用对大肠杆菌
的抑菌效果。结果显示,3味中药与头孢噻呋联用以协同作用为主,与恩诺沙星联用以拮抗作用为主,杨树花和连
翘分别与氟苯尼考联用均100%表现为协同作用,千里光与氟苯尼考联用90%表现为协同作用,10%表现为无关
作用。结果表明,杨树花、千里光、连翘在体外均可与氟苯尼考联用,且以连翘与氟苯尼考联用效果最好。
关键词:抗菌药;联用;大肠杆菌;抑菌作用;协同作用
中图分类号:S852.61;S859   文献标志码:A   文章编号:1005-4545(2014)01-0140-04
Antibacterial effect in vitro of Poplar flower,Groundsel and Fructus forsythiae
combined with antimicrobial agents on chicken E.coli
    ZHANG Guo-zu1,JIA Yan-hua2,GUO Zhen-huan2,MA Zhong-bin2,LI Rong-yu1,LIU Mei 2 
(1.Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering,Zhengzhou450008,China;
2.Henan Province Health Star Pharmaceutical Co.,Ltd.,Zhengzhou451464,China)
Abstract:To study the antibacterial effect in vitro of Poplar flower,Groundsel and Fructus for-
sythiae combined with antimicrobial agents,such as ceftiofur,florfenicol and enrofloxacin on path-
ogenic E.coli separated from sick chicken,the in vitroinhibitory effect was evaluated by using the
agar dilution method.The results showed that three herbs combined with ceftiofur mainly dis-
played synergy,with enrofloxacin mainly showed antagonism.Poplar flower and Fructus forsythi-
ae respectively combined with florfenicol showed 100%synergy,Groundsel combined with Flor-
fenicol showed 90%synergy,and 10%unrelated action.These results indicated that Poplar flow-
er,Groundsel and Fructus forsythiae in vitro can combine with Florfenicol,and the best effect is
obsered in Fructus forsythiae combined with Florfenicol.
Key words:antimicrobial agents;combined with;E.coli;antibacterial effect;synergy
  杨树花是清热燥湿类中药,为杨柳科植物毛白
杨、加拿大杨或同属植物的干燥雄花序,其中毛白杨
在我国西北、华北、东北、和西南地区分布极广,具有
清热解毒、健脾养胃、化湿止痢等功能。杨树花所含
黄酮类、酚苷类是其主要的抗菌、抗炎活性物质,在
兽医临床上常用于治疗家畜的各类细菌性痢疾和肠
炎等[1]。李宏胜等[2-3]通过体外抑菌试验证明,常见
病原菌及奶牛乳房炎病原菌对毛白杨提取物均呈现
高度或中度敏感。千里光是清热解毒类中药,具有
广谱抗生素作用,对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、志
贺菌、大肠杆菌等均有不同程度的抑制作用。连翘
是清热解毒类中药,主要功效为清热解毒、消痈散
结,经现代药理研究证明,连翘为广谱抗菌药,对多
种革兰阳性菌、阴性菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链
球菌、大肠杆菌等均有抗菌作用[4]。头孢噻呋、氟苯
尼考、恩诺沙星都是临床常用动物专用抗菌药物,具
有广谱抗菌作用,但是随着临床上耐药菌株和多重
耐药菌株的出现,头孢噻呋等单独使用已经不能达
到理想的临床效果。中西药物联用具有提高疗效、
减少抗菌药用量、降低毒副作用、减少耐药性产生、
促进体质恢复等多种优势[5-7]。杨树花、千里光、连
翘分别与头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星联用,是否
有协同增效作用,增强其对鸡大肠杆菌的抑菌作用,
来治疗临床上大肠杆菌引起的感染,值得探讨。
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DOI:10.16303/j.cnki.1005-4545.2014.01.029
1 材料与方法
1.1 菌株 临床分离的致病性鸡大肠杆菌10株,
分别 编 号 为 1~10 株;质 控 菌 大 肠 埃 希 菌
(ATCC25922)购自中国普通微生物菌种保藏管理
中心。
1.2 抗菌药 头孢噻呋钠(齐鲁晟华制药有限公
司,含量93.6%,批号110301199)、氟苯尼考(张家
港市恒盛药用化学有限公司,含量99.8%,批号
FB20110771)、恩诺沙星(浙江国邦药业有限公司,
含量99.4%,批号100629-6),按照《中华人民共和
国兽药典》(2010年版一部)各项下鉴定合格。
1.3 中药 杨树花、千里光、连翘,均购自河南省禹
州市药材公司。按照《中华人民共和国兽药典》
(2010年版二部)地锦草项下鉴定合格。
1.4 培养基 MH(A)培养基(北京奥博星生物技
术有限责任公司,批号:20120206)、麦康凯琼脂(北
京奥博星生物技术有限责任公司,批号:20120502)、
GN增菌液(北京奥博星生物技术有限公司,批号:
201108016)。
1.5 器材 YJ系列医用净化工作台,吴江市雄峰
空调净化设备有限公司;YXQ-LS-75SⅡ立式压力
蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;
GHP9160隔水式恒温培养箱,上海申贤恒温设备
厂;AUW220D电子天平,日本岛津公司;超低温冰
箱,合肥美菱电器股份有限公司;Hisense冰箱,青
岛海信电器股份有限公司;不同量程单道手动可调
移液器,百得实验室仪器(苏州)有限公司。
1.6 杨树花、千里光、连翘中药液的制备 准确称
量杨树花、千里光、连翘各100g,分别加入10倍量
左右蒸馏水浸泡30min后,先用武火煮沸,水沸后
计算煎煮时间,杨树花和千里光头煎30min,二煎
20min,三煎15min,连翘三煎都是30min。煎煮
过程中需要经常搅拌,每煎药液都用4层纱布趁热
过滤,药渣也趁热过滤,合并3次滤液后用文火浓缩
至生药质量浓度为1g/mL。100℃高压灭菌15
min,4℃冰箱保存备用。
1.7 头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星原药液的制备
 用电子分析天平精确称取适量的药物,无菌操作
溶于50mL灭菌过的蒸馏水中,若药物不溶于水,
可加入相应的助溶剂使之溶解,然后加入灭菌蒸馏
水定容至50mL,制备成质量浓度为2560mg/L的
母液,然后根据需要分装于离心管中,置冰箱内-20
℃保存备用。
1.8 含药平板的制备 根据试验所需平板的含药
量,计算出需要的中药和西药量,分别预先加入到灭
菌过的培养皿中,混匀,然后加入适量50℃左右灭
菌过的MHA培养基,混合均匀,等琼脂平板凝固后
倒置待用。每次试验均需要做中药含药平板、西药
含药平板作为中药和西药的对照。
1.9 试验用大肠杆菌菌液的制备 从4℃冰箱中
拿出事先培养好的大肠杆菌菌种,在超净工作台中
无菌操作用接种环勾取单个菌落接种于GN增菌液
中,置隔水式恒温培养箱中37℃培养12h后,调整
试管中菌液浓度为0.5麦氏,即菌液浓度为108
CFU/mL,用GN增菌液将菌液1∶10稀释,置无菌
操作台中备用。
1.10 中西药物联用体外药敏试验 在无菌操作台
上,用微量移液器吸取1~2μL事先制备好的大肠
杆菌菌液,接种于已制备好的含药平板琼脂表面(每
点菌数约为104 CFU),待菌液被琼脂充分吸收后,
倒置于37℃温箱内培养16~18h。试验重复做3
次,取其平均值。根据临床和实验室标准化研究所
(CLSI)抗菌药物敏感性试验执行标准第十九版
(2009)规定中肠杆菌科有关解释标准对上述试验结
果进行判定。
结果判断:将平板置于暗色、无反光物体表面上
判断试验结果,以无细菌生长的最低药物浓度为
MIC,单个菌落生长的忽略不计。
2 结果
2.1 杨树花、千里光、连翘对鸡大肠杆菌的体外抑
菌作用  杨树花对10株大肠杆菌的最小抑菌质量
浓度均为0.25g/mL,千里光对10株大肠杆菌的最
小抑菌质量浓度为0.062 5~0.125 0g/mL,连翘对
10株大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为0.0625~
0.125 0g/mL。
2.2 杨树花、千里光、连翘与头孢噻呋联用对鸡大
肠杆菌的体外抑菌作用 杨树花、千里光、连翘分别
与头孢噻呋联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用见表
1。由表1可知,10株大肠杆菌对头孢噻呋的耐药
率为100%,杨树花与头孢噻呋联用对鸡大肠杆菌
的协同率为60%,无关作用占20%,无关或拮抗作
用占20%;千里光与头孢噻呋联用协同率为80%,
无关作用占20%;连翘与头孢噻呋联用协同率为
80%,无关作用占10%,无关或拮抗作用占10%。
杨树花、千里光与头孢噻呋联用时虽然以协同增效
作用为主,但是协同作用后对大肠杆菌的最小抑菌
浓度仍处于耐药区,连翘与头孢噻呋联用也是以协
同作用为主,协同后有3株大肠杆菌对该组合表现
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为敏感,说明3个组合中,以连翘联用头孢噻呋为最 佳组合。
表1 杨树花、千里光、连翘分别与头孢噻呋联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用
药 物
各药对10株菌的最小抑菌质量浓度(MIC值)/(mg·L-1)
菌1 菌2 菌3 菌4 菌5 菌6 菌7 菌8 菌9 菌10
联用效果/株
协同 无关 无关或拮抗
头孢噻呋 128 >256 >256 >256  32 >256 >256  32 >256 >256
杨树花+头孢噻呋 128  256  256  256  8 >256  64  32 >256  128  6  2  2
千里光+头孢噻呋 128  256  32  32  16  128  128  32  64  64  8  2
连翘+头孢噻呋 128  64 ≤2* 64  16  256  256 ≤2* ≤2* >256  8  1  1
  注:*示大肠杆菌对该药敏感。下同
2.3 杨树花、千里光、连翘与氟苯尼考联用对鸡大
肠杆菌的体外抑菌作用 杨树花、千里光、连翘分别
与氟苯尼考联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用见表
2。由表2可知,10株大肠杆菌对氟苯尼考的耐药率
达100%,杨树花与氟苯尼考联用对大肠杆菌100%
呈现协同作用;千里光与氟苯尼考联用对大肠杆菌
90%呈现协同作用,10%呈现无关作用;连翘与氟苯
尼考联用对大肠杆菌100%呈现协同作用。千里光
和连翘分别与氟苯尼考联用时均有2株大肠杆菌对
该组合表现为敏感,综合考虑3组药物组合对10株
菌的最小抑菌质量浓度及各组合的协同率等因素,
以连翘和氟苯尼考联用的效果为最好。
表2 杨树花、千里光、连翘分别与氟苯尼考联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用
药 物
各药对10株菌的最小抑菌质量浓度(MIC值)/(mg·L-1)
菌1 菌2 菌3 菌4 菌5 菌6 菌7 菌8 菌9 菌10
联用效果/株
协同 无关
氟苯尼考 256 >256 >256 >256  256  256  256  256  256  256
杨树花+氟苯尼考 64  4  128  64  64  64  64  128  16  64  10
千里光+氟苯尼考 64  64 ≤2* 8 ≤2* 32  64  16  16  256  9  1
连翘+氟苯尼考 32 ≤2* ≤2* 32  64  4  32  128  32  64  10
2.4 杨树花、千里光、连翘与恩诺沙星联用对鸡大
肠杆菌的体外抑菌作用 杨树花、千里光、连翘分别
与恩诺沙星联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用见表
3。由表3可知,10株大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率
达100%,杨树花与恩诺沙星联用对10株鸡大肠杆
菌100%呈现拮抗作用;千里光与恩诺沙星联用对鸡
大肠杆菌10%呈现协同作用,10%呈现无关作用,
80%呈现拮抗作用;连翘与恩诺沙星联用对鸡大肠
杆菌10%呈现协同作用,90%呈现拮抗作用。可见,
恩诺沙星与杨树花、千里光、连翘都不能联用。
表3 杨树花、千里光、连翘分别与恩诺沙星联用对鸡大肠杆菌的体外抑菌作用
药 物
各药对10株菌的最小抑菌质量浓度(MIC值)/(mg·L-1)
菌1 菌2 菌3 菌4 菌5 菌6 菌7 菌8 菌9 菌10
联用效果/株
协同 无关 拮抗
恩诺沙星 8  128  2  64  8  128  32  64  128  64
杨树花+恩诺沙星 >256 >256  128 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256  10
千里光+恩诺沙星 256 >256 ≤1  128  64  256 >256  256  128 >256  1  1  8
连翘+恩诺沙星 256 >256 ≤1  256  64  256  256  256  256  256  1  9
3 讨论
目前,对杨树花研究的内容大都集中在有效成
分的研究及杨树花复方制剂对家畜肠炎、腹泻等方
面的治疗作用,对鸡有关作用方面的研究很少,尚未
见资料报道杨树花对鸡致病性大肠杆菌的抗菌效
果,本试验所测杨树花对临床分离的耐药型鸡致病
性大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为0.25g/mL,董
发明等[8]和房春林等[1]试验结果基本一致。白云娥
等[4]测定的连翘水提物对标准菌株大肠杆菌
(44148-5)的最小抑菌质量浓度为73.63g/L,本试
验测定的连翘对10株大肠杆菌的最小抑菌质量浓
度为0.062 5~0.125 0g/L,试验结果一致。刘胜贵
等[9]报道的千里光水提物对大肠杆菌O1的最小抑
菌质量浓度为3.906g/L,本试验测定的结果是250
g/L,两者相差很大。推其原因可能是千里光中药材
来源不同,大肠杆菌菌株不同造成的。
10株鸡大肠杆菌对头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙
星的耐药率均是100%,说明随着这几种抗菌药物长
期、大量的使用,细菌已经对其产生了严重的耐药
性,试验结果表明,如果这10株大肠杆菌引起鸡临
床感染,单用头孢噻呋、氟苯尼考或恩诺沙星去治疗
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均无效,应考虑联合用药。10株大肠杆菌都是多重
耐药菌株,临床治疗时,一定要先做药敏试验,根据
试验结果选择敏感的药物治疗或者联合用药。
鸡大肠杆菌病是严重危害养鸡业发展的主要细
菌性疾病,虽然抗菌药的广泛使用,对鸡大肠杆菌病
的防控方面发挥了重要作用,但随着多重耐药菌株
的出现及药物残留的加重,抗菌药的使用受到一定
限制。中药应用时着眼于整体调节功能,能提高机
体自身的抗病能力,长期应用安全可靠。临床上将
两者结合应用,可内外兼重,起到单独使用二者时所
不能达到的效果。本试验结果表明,杨树花、千里光
和连翘与头孢噻呋联用时以协同作用为主,与恩诺
沙星联用时以拮抗作用为主,3种中药都可以与氟苯
尼考联用,且以连翘与头孢噻呋联用和连翘与氟苯
尼考联用为最佳药物组合。此结果尚未见有资料报
导。
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