全 文 ：冬青属植物为亚热带常绿阔叶林中常见树种,
我国有140种,分布于长江流域以南各地和台湾省,
有数种分布至河南、陕西和甘肃。浙江有35种,3变
种,1变型,主要分布浙东、浙西、浙南地区,其中不
少种类可作药用,如冬青、铁冬青等。枸骨、小果冬
青的树皮能作染料,树姿美观,常可作庭院绿化树
种,具有一定的经济价值和观赏价值[1]。对冬青属的
研究主要集中在对该属植物的化学成分和药理研
究,物种分类主要以形态学指标为主[2]。Manen[3,4]、
Cuenoud[5]对该属植物不同个体之间的叶绿体基因
保守序列(atpB-rbcL、trnL-trnF和 rbcL)、核基因的
保守序列(rDNAITS)进行了比较,Setoguchi等[6]应
用RFLP技术结合传统分类研究系统进化,张凤琴
等[7]应用RAPD技术对冬青属的苦丁茶进行了亲缘
关系的研究,均获得了有意义的结果,但是对冬青
属植物种间的遗传多样性的 AFLP分析尚未见报
道。本文利用RAPD[8,9]技术和AFLPs[10]技术相结合,
在分子水平上对10种冬青属植物多态性进行分析,
以求为冬青属植物的系统分类和发育进化关系的研
究,以及为今后冬青属植物的育种和杂交亲本选择
提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
10种冬青属植物的嫩叶均采自杭州植物园,所
用材料见表1。
1.2 基因组DNA提取
基因组DNA提取参照毛娟[11]方法进行。
1.3 RAPD方法
RAPD引物:100条 S系列随机引物(10bp)购
自上海Sangon公司。将植物DNA溶液稀释成 80-
100ng/μl,作为RAPD反应的模板。Taq酶购自上海
生工生物工程技术服务有限公司,RAPD反应体系
10种冬青属植物遗传多样性RAPD和AFLPs分析*
钱永生 1 王慧中 1** 施农农 1 赵 艳 2 黎念林 3 胡 中 3
(1杭州师范大学生物化学与分子生物学杭州市重点实验室,杭州 310018;2浙江工商大学、生物工程系,
杭州 310018;3杭州植物园环境绿化工程部,杭州 310013)
摘要 采用RAPD和AFLP技术,对10种冬青属植物基因组进行DNA片段扩增,以研究该属种间
遗传多样性。结果表明:在RAPD分析中,通过对100种10个碱基随机引物的筛选,发现11种引物
能得到多态性较高扩增产物,11种引物共扩增出301条多态性条带,多态率为98.63%。在AFLP分
析中,3对选择性引物组合均扩增出了丰富的多态性片段。利用RAPD和AFLP技术分析,结果按
UPGMA类平均法进行聚类,聚类结果显示冬青和代茶冬青,木姜冬青和浙江冬青以及光枝刺缘冬
青与毛枝三花冬青之间的亲缘关系最近。
关键词:冬青属 RAPD AFLP 遗传多样性
本文2007年8月24日收到。2007年11月30日接受。
*浙江省自然科学基金(301406),浙江省“151”和杭州市“131”
人才基金资助项目。
**通讯作者,Tel:(0571)-28865330;Fax:(0571)-28865198,
Email:whz62@163.com
第41卷 第1期 Vol.41,No.1
February20082008年2月
分 子 细 胞 生 物 学 报
JournalofMolecularCelBiology
表1 材料名称
Table1 Materialstestedinexperiment
编号
No.
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
材料名称
Species
大果冬青 I.macrocarpa
显脉冬青 I.editicostata
波缘冬青 I.crenata
光枝刺缘冬青 I.hylonomavar.glabra
毛枝三花冬青 I.trifloravar.kanehirai
木姜冬青 I.litseaefolia
冬青 I.purpurea
浙江冬青 I.zhejiangensis
代茶冬青 I.vomitoriaAit
华中枸骨 I.centrochinensis
41卷
见表 3。RAPD反应程序:94℃变性 1min,36℃复性
1min,72℃延伸反应2min,36个循环。
1.4 数据分析
电泳图谱中根据分子迁移率及其有无进行统
计:有带计为 1,无带或模糊不能辩认计为 0。用
NTSYS软件计算出遗传相似性系数,用UPGMA法
进行聚类分析[12,13]构建聚类图。
1.5 AFLP方法
AFLP实验流程主要参照 Vos和 Zabeau1995年
发表的论文[10],接头与引物由上海生工合成,预扩
增引物对选用E+A/M+C(序列见表4),开始选用12
对选择性引物对 E+ACA/M+CAG、E+AAC/M+CAT、
E+ACC/M+CAC、E+ACT/M+CAA、E+ACG/M+CAA、
E+ACT/M+CAC、E+ACT/M+CAG、E+ACA/M+CAT、
E+ACT/M+CAC、E+ACG/M+CAT、E+ACG/M+CAG、
E+AAC/M+CAA分别进行扩增。最后选用其中多态
性较好的 3对选择性引物对 E+AAC/M+CAT、E+
ACT/M+CAA、E+ACG/M+CAA(序列见表 4)分别进
行扩增。
1.5.1 酶切连接
酶切连接模板量约为 250ng,2.5μl10×酶切缓
冲液,2.5μl10×T4DNA连接酶切缓冲液,5U EcoR
Ⅰ,5UMseⅠ,2UT4连接酶,50pmolMseⅠ和5pmol
EcoRⅠ接头(序列见表4),双蒸水补至25μl。用PE
公司PCR扩增仪(型号为 eppendorf)设定 37℃过夜
反应后,于65℃20min灭酶活,-20℃保存,作为预扩
增模板。
1.5.2 预扩增
预扩增取3μl酶切连接产物,加入75ngE+A,
75ngM+C引物,15mmol/LMg2+,25mmol/LdNTPs,
1UTag酶,3μl10×PCR缓冲液,加双蒸水补至
30μl。反应参数为:94℃90s;94℃30s,56℃1min,
72℃1min,30循环;72℃10min(PE公司 PCR仪)。
反应结束后,用 0.8%琼脂糖凝胶(含 EB0.5!g/ml)
电泳检测扩增产物(图 1),取 3μl产物释稀 30倍,
用作选择性扩增模板。
1.5.3 选择性扩增
选择性扩增取释稀后的产物 3μl,加入 EcoRⅠ
选择性引物、MseⅠ选择性引物各 75ng,15mmol/L
Mg2+,25mmol/LdNTPs,1UTag酶,3μl10×PCR缓冲
液,加双蒸水补至30μl。反应参数为:94℃90s;94℃
30s,65℃1min,72℃1min,13循环(每循环降 0.7℃);
94℃30s,56℃1min,72℃1min,25循环;72℃5min
钱永生 王慧中 施农农 赵 艳 黎念林 胡 中
表2 11种不同引物碱基序列
Table2 Sequenceoftheelevenprimers
引物编号
No.ofprimers
S22
S24
S48
S79
S82
S84
S86
S96
S105
S112
S115
碱基序列
Sequenceofprimers
5′TGCCGAGCTG3′
5′AATCGGGCTG3′
5′GTGTGCCCCA3′
5′GTTGCCAGCC3′
5′GGCACTGAGG3′
5′AGCGTGTCTG3′
5′GTGCCTAACC3′
5′AGCGTCCTCC3′
5′AGTCGTCCCC3′
5′ACGCGCATGT3′
5′AATGGCGCAG3′
表3 RAPD反应体系
Table3 RAPDamplificationreactionsystem
成分 Ingredient
10×Bufer
dNTP(10mmol/L)
MgCl2(25mmol/L)
Taqpolymerase(5u/μl)
DNA(80-100ng/μl)
ddH2O
RapdPrimer
Total
体积Volume(μl)
2.52
0.252
225
0.22
125
18.05
125
2525
表4 不同扩增引物和接头的名称和序列
Table4 Nameandsequenceofdiferentamplification
primersandadapters
引物名称
Primers
Name
E+A
M+C
EcoRⅠadapter1
EcoRⅠadapter2
MseⅠadapter1
MseⅠadapter2
E+ACT
E+AAC
E+ACG
M+CAA
M+CAT
序列(5′-3′)
Sequences(5′-3′)
Sequence
GACTGCGTACCAATTCA
GATGAGTCCTGAGTAAC
CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTCTAC
GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT
GACTGCGTACCAATTCACT
GACTGCGTACCAATTCAAC
GACTGCGTACCAATTCACG
GATGAGTCCTGAGTAACAA
GATGAGTCCTGAGTAACAT
36
1期 10种冬青属植物遗传多样性RAPD和AFLPs分析
(PE公司 PCR仪),先用 0.8%琼脂糖凝胶 (含 EB
0.5!g/ml)电泳检测选择性扩增产物。
1.5.4 电泳
电泳扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺胶 (厚度
0.5mm)和1×TBE电泳缓冲液电泳分离 (BIO-RAD
公司测序电泳仪)。
1.5.5 银染
根据刘建斌等的银染方法并有所改进[14-16]。固
定液:取100ml冰醋酸到900ml去离子水或双蒸水
中。染色液:1gAgNO3,1.5ml37%甲醛,加去离子
水至1L。显色液:30gNa2CO3,1.5ml37%甲醛,2mg
硫代硫酸钠,加去离子水至1L。
1.6 数据分析
选用 3对选择性引物对 E+AAC/M+CAT、E+
ACT/M+CAA、E+ACG/M+CAA(序列见表4)分别进行
扩增,得到非常丰富的条带,虽然银染方法在理论上
能够将所有的扩增出的条带都可显影出来,但在实
际操作过程中,仅能清楚地显示出中等大小(100-
550bp)的分子量片段,大分子量(>550bp)的片段
分不开,而小分子量(<100bp)的片段又比较模糊。
因此,我们选用全部清晰、可分辩的条带进行记录分
析。我们先用 BIO-RAD公司的 QuantityOne软件
统计,根据电泳图谱中同一位置有无进行统计。有带
计为1,无带或模糊不能辩认计为0。由于全泳道的
AFLP图谱高分子量和低分子量的扩增带比较模糊,
所以在 AFLP图谱中我们只分析了 300-150bp之
间带。在150-300bp之间共得到484条带,多态性
带 442条,多态性百分率为 91.3%(表 5)。再用
NTSYS软件计算出遗传相似性系数,用UPGMA法
进行聚类分析构建聚类图。
2 结 果
2.1 10种冬青属植物的RAPD多态性分析
11种随机引物(名称和序列见表2)均扩出4条
以上的多态性DNA带,平均每个引物有31个DNA
扩增位点(包括单态和多态位点)见表6。随机引物
扩增冬青属植物的多态性很高,这与冬青属植物的
遗传基础复杂有关,任一特定引物与冬青属不同植
物的基因组DNA序列均有其特定的结合位点,但扩
增出的片段多少、大小均不同。文中只选出4个引物
扩增出的代表性图(图2)。
从表 6可知:由引物(S22、S48、S79、S82、S84、
S86、S96、S112、S115)(序列见表2)扩增的冬青属植
物的多态性为100%,变异系数在 0.63-1.00之间,
说明本文研究的材料遗传距离很大,是冬青属植物
遗传改良的重要种质资源。研究发现,引物S105在
图1 预扩增产物电泳结果
M:1KbDNA标准分子量;1-10实验样品材料编号名称见表1。
Fig.1 Pre-amplifiedresultsusing0.8% agrosegel
M:1kbDNAmarker;1-10:Experimentalsamplenumbersthatarethesameasintable1.
表5 选择性引物组合对供试材料的扩增结果
Table5 AmplificationresultsofprimercombinationsonmaterialsinIlex
引物
Primers
E+AAC/M+CAT
E+ACT/M+CAA
E+ACG/M+CAA
扩增带数
Totalbands
118
174
192
多态带数
Polymorphicbands
101
163
178
多态带的百分率
Polymorphicbands(%)
85.6
93.7
92.7
37
41卷钱永生 王慧中 施农农 赵 艳 黎念林 胡 中
表6 11种不同引物扩增结果
Table6 Amplificationresultsoftheelevenprimers
引物编号
No.ofprimers
S22
S24
S48
S79
S82
S84
S86
S96
S105
S112
S115
扩增总带数
Totalamplifiedbands
28
25
38
22
43
30
17
35
15
30
18
多态性带数
No.ofpolymorphicbands
28
23
38
22
43
30
17
35
14
30
18
多态率 %
%ofpolymorphism
100
092
100
100
100
100
100
100
093.3
100
100
注:多态性数指用同一引物扩增不同品种时非单态的 DNA扩增带数[17]。
Note:NumbersofpolymorphismamplificationproductsarethenumbersofnomonomorphicamplifiedDNAbandsbyusingthe
sameprimertoamplifydiferentcultivars.
a b
c d
图2 4种随机引物扩增RAPD图谱
a:S48,b:S82,c:S105,d:S22,样品编号代表的植物材料见表1。
Fig.2 MapsofRAPDproductsfrom 4primers
a:S48,b:S82,c:S105,d:S22.Forthenumbersrepresentingtheplantmaterial,consulttable1.
38
1期 10种冬青属植物遗传多样性RAPD和AFLPs分析
740bp处、引物S24在530bp和1100bp处供试植物
均可扩增出条带,重复性试验进一步证明了这些片
断遗传上的高度保守性。目前我们已将这些片段用
切割冻溶法回收与纯化,然后进行TA克隆测序,为
下一步冬青属植物的鉴定及特异性基因的定位提供
一定的实验依据。另外,引物S48在10种冬青属植
物扩增中,在2200bp处只有光枝刺缘冬青能出现特
异性条带;引物S82在 10种冬青属植物扩增中,在
1900bp处只有冬青能出现特异性条带;引物S105
在10种冬青属植物扩增中,在850bp处只有毛枝三
花冬青能出现特异性条带,重复性试验进一步证明
了这些片断的高度特异性,下一步我们将这些特殊
片段进行回收、纯化和测序,为冬青属植物特异物种
的鉴定提供快速准确的方法。
2.2 10种冬青属植物的RAPD聚类分析
实验所得的相似系数矩阵表见表7,应用UP-
GMA法聚类,所得聚类图见图3。
RAPD聚类结果显示:毛枝三花冬青、大果冬
青、显脉冬青、波缘冬青、光枝刺缘冬青、冬青、代茶
冬青、华中枸骨归为Ⅰ类,木姜冬青和浙江冬青归为
Ⅱ类。Ⅰ类中的光枝刺缘冬青和毛枝三花冬青在
0.73处首先聚在一起,表明两者亲缘关系最近,华中
枸骨和冬青在0.68左右聚合。Ⅰ类中有三组聚类是
比较近的,分别是大果冬青和显脉冬青、冬青和华中
枸骨、波缘冬青和代茶冬青,Ⅱ类中木姜冬青和浙江
冬青归聚类最近,说明亲缘关系最近。
2.3 10种冬青属植物的AFLP多态性及其聚类分析
3对引物组合 AFLP扩增结果得到 484条带,
多态性带442条。其中引物组合E+ACG/M+CAA和
E+ACT/M+CAA扩增结果分别见图4和图5,相似
表7 根据RAPD标记计算的相似系数
Table7 GeneticsimilaritybetweenspeciesonthebasisofRAPDmarkers
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
1
0.7005
0.6538
0.6868
0.6538
0.6401
0.6676
0.6181
0.6346
0.6676
2
1
0.6126
0.6511
0.6511
0.6319
0.6648
0.6099
0.6429
0.6593
3
1
0.6813
0.6648
0.5962
0.6621
0.6291
0.7005
0.6291
4
1
0.7308
0.6511
0.6841
0.6566
0.6786
0.6951
5
1
0.6236
0.6786
0.6786
0.6841
0.7060
6
1
0.6154
0.6429
0.5769
0.6593
7
1
0.6099
0.6703
0.7088
8
1
0.6264
0.6978
9
1
0.6593
10
1
图3 根据相似系数构建的10种冬青属植物的树状图
Fig.3 Dendrogram of10SpeciesofIlexlistedintable1basedonsimilaritycoeficient
4I.hylonomavar.glabra
5I.triflora
7I.purpurea
10I.centrochinensis
9I.vomitoriaAit
3I.crenata
2I.editicostata
1I.macrocarpa
6I.litseaefolia
8I.zhejiangensis
0.63 0.72 0.81 0.91 1.00
39
41卷
表8 根据AFLP标记计算的相似系数
Table8 GeneticsimilaritybetweenspeciesonthebasisofAFLPmarkers
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
1
0.6653
0.6281
0.7585
0.6033
0.5806
0.6302
0.6178
0.6364
0.6281
2
1
0.6405
0.5702
0.5909
0.6178
0.6178
0.5888
0.6322
0.6157
3
1
0.5905
0.5909
0.6012
0.5682
0.6219
0.6239
0.6281
4
1
0.6322
0.5723
0.6426
0.6178
0.5868
0.5537
5
1
0.5929
0.5929
0.5971
0.6446
0.6239
6
1
0.5826
0.6198
0.5929
0.5682
7
1
0.5785
0.6632
0.6219
8
1
0.6095
0.6012
9
1
0.6529
10
1
钱永生 王慧中 施农农 赵 艳 黎念林 胡 中
系数见表8,数据分析聚类见图6。
根据图 6,由 AFLP技术得到的聚类图在相似
系数0.6处,可将这 10种材料分为Ⅰ类和Ⅱ类。Ⅰ
类包括毛枝三花冬青、大果冬青、显脉冬青、波缘
冬青、光枝刺缘冬青、冬青、代茶冬青、华中枸骨。
在 0.62处光枝刺缘冬青和毛枝三花冬青聚在一
起。大果冬青和显脉冬青在 0.67处聚在一起,表明
两者亲缘关系最近。Ⅱ类包括木姜冬青和浙江冬
青,并且在 0.62左右之间聚类,表明两者亲缘关系
最近。
图4 引物对E+ACG/M+CAA扩增结果
M:1kbDNA标准分子量;1-10:实验样品材料编号名
称见表1。
Fig.4 AFLPfingerprintusingprimercombinationsof
E+ACG/M+CAA.
M:1kbDNAmarker;1-10:experimentalsamplenumbers
thatarethesameasintable1.
图5 引物对E+ACT/M+CAA扩增结果
M:1kbDNA标准分子量;1-10:实验样品材料编号名称
见表1。
Fig.5 AFLPfingerprintusingprimercombinationsof
E+ACT/M+CAA
M:1kbDNAmarker;1-10:experimentalsamplenumbers
thatarethesameasintable1.
M 109 8 7 6 5 4 3 2 1 M
300bp
250bp
200bp
150bp
M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
300bp
250bp
200bp
150bp
40
1期
图6 AFLP标记构建的UPGMA聚类图
Fig.6 UPGMAdendrogramsgeneratedfrom AFLPmarkers
3 讨 论
长期以来冬青属植物的分类局限于其形态学性
状,利用分子标记技术对冬青属植物进行亲缘关系
分类研究报道较少。传统的冬青属植物的分类主要
是以形态学特征为依据,分类研究过程中不同的学
者有不同的看法,较为普遍采用的是 1949-1950年
胡秀英 [18]发表的中国冬青属(TheGenusIlexin
China)专论和1983年中国科学院植物研究所出版
的《中国高等植物图鉴补编第二册》。按照胡秀英的
分类系统,冬青属分为两大亚类:落叶冬青亚属和常
绿冬青亚属。其中大果冬青属于落叶冬青亚属大柄
冬青组,而波缘冬青、冬青、华中枸骨、木姜冬青、显
脉冬青、浙江冬青、毛枝三花冬青、光枝刺缘冬青等
属于常绿冬青亚属,常绿冬青亚属又分小组,波缘冬
青属于波缘冬青组,冬青、木姜冬青、显脉冬青属于
光果冬青组,华中枸骨属于构骨组[19]。
本研究同时采用 RAPD和 AFLP技术对 10份
冬青属植物进行分子标记分析,RAPD和AFLP两种
标记系统都能产生各自有效的多态性条带,但多态
性水平不相同,经RAPD引物筛选后发现只有少数
引物能扩增出理想的多态性带,且每条引物平均扩
增出的多态性带数仅为9条,只有通过AFLP图谱
的补充分析才可以获得较为理想的效果。而本研究
首次在冬青属上采用AFLP银染分析技术,仅用 3
对引物组,就平均检测到 147个多态性位点,这充
分证实AFLP技术在冬青属遗传亲缘关系分析中的
高效性。
从大类来看,AFLP与 RAPD聚类分析结果完
全吻合。但AFLP聚类分析属于Ⅰ类的冬青和代茶
冬青、光枝刺缘冬青和毛枝三花冬青聚类关系是比
较近的,这与 RAPD聚类分析有些区别,主要是冬
青、波缘冬青和代茶冬青上的区别。 但从聚类图上我
们可以清晰的看到这三种冬青属植物在聚类上都是
最近的,表明三者的亲缘关系也是最近的。
从两种标记的聚类图上可以看出除大果冬青与
传统的分类上有区别外,其余均与形态学上的分类
结果较吻合,都属于常绿冬青亚属。然而在AFLP聚
类显示中大果冬青与显脉冬青的亲缘关系是最近
的,并将其划在同一组,但在传统的分类学上,大果
冬青和显脉冬青分别属于两个亚属,即落叶冬青亚
属和常绿冬青亚属。
综上所述,RAPD和 AFLP两种分子标记以及
传统形态学分类所得数据虽然有所差别,但大类划
分完全吻合,只是小类亲缘关系的聚类分析结果有
些差异,表明RAPD和AFLP两种分子标记方法应
用于冬青属植物遗传多样性分析是可行的。AFLP
标记比RAPD标记的检测效率明显要高,更适合于
冬青属的多态性检测。从比较每个引物(或组合)扩
增出的带数及多态性条带来看,AFLP标记同时具
备高效率多态检出、引物通用性及重复性好等特点,
被广泛应用于分子遗传图谱构建、目的基因定位、品
种鉴别分类及系统发育研究等方面[20-22]。但 RAPD
也具有数据分析清晰,实验时间短,结果可靠等优
点,可以作AFLP标记的参考性补充。两则标记部分
差异,有可能是AFLP标记高灵敏度性和RAPD重
10种冬青属植物遗传多样性RAPD和AFLPs分析
1I.macrocarpa
2I.editicostata
3I.crenata
7I.purpurea
9I.vomitoriaAit
10I.centrochinensis
4I.hylonomavar.glabra
5I.trifloravar.kanehirai
6I.litseaefolia
8I.zhejiangensis
0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
41
41卷
复弱带性的统计上有差别,本研究也为传统植物分
类研究提供一些佐证,对冬青属植物特定基因 QTL
研究打下一定的基础,也将是今后我们研究的重要
方向。
参 考 文 献
[1]浙江植物志编委会,浙江植物志,第四卷。杭州:浙江科
技出版社,1986,1-23。
[2]李冬玲、付 晖、任全进、姚 淦,中国华东地区冬青属药
用植物资源调查。中国野生植物资源,2003,2(1):22-24。
[3]ManenJF,ArebothsympatricspeciesIlexperadoand
Ilexcanariensissecretlyhybridizing? Indicationfrom
nuclearmarkerscolectedinTenerife,BMCEvolutionary
Biology,2004,4(1):46-58.
[4]ManenJF,GravenYN&BoulterMC,Thecomplexhistory
ofthegenusIlexL.(Aquifoliaceae):evidencefromthe
comparisonofplastidandnuclearDNAsequencesand
fromfossildata.PlantSyst.Evol.2002,235(1):79-98.
[5]CuenoudP,MariaA,MartinezDO,LoizeauP.A,Spichiger
R,AndrewsS&ManenJF.,Molecularphylogenyand.
biogeographyofthegenusIlexL.(Aquifoliaceae).An-
nals.ofBotany,2000,85(1):111-122.
[6]SetoguchiH&WatanabeI,Intersectionalgeneflowbe-
tweeninsularendemicsofIlex(aquifoliaceae)onthe
boninislandsandtheryukyuislands,AmericanJournalof
Botany,2000,87(6):793-810.
[7]张凤琴、刘国民、周 鹏、徐立新、郭安平,用 RAPD技术
探讨冬青属苦丁茶的遗传差异、亲缘关系与分类地位。
云南植物研究,2004,26(6):637-644。
[8]ConnolyAG,GodwinID&CooperM,Interpretationof
randomlyamplifiedpolymorphicDNAmarkerdatafor
finger-printingsweetpotato(IpomeeabatatasL.)geno-
types.TheorApplGenet,1991,88(1):332-336.
[9]LiangHJ,LiuM,ZhongZY,WuYX&LiWB,Identifica-
tionandclassificationofChineseCymbidiumwithRAPD.
ActaHorticulSin.,1996,23(1):365-370.
[10]VosP,HogersR&BleederM,AFLP:anewtechniquefor
DNAfingerprinting.NucleiAcidsResearch,1995,23
(1):4407-4414.
[11]毛 娟、赵长增、赵丽娟、雷艳红,扁桃基因组 DNA提取
及RAPD扩增体系的建立。甘肃农业大学学报,2005,
40(1):17-21。
[12]RohlfFJ.NTSYS-PC2.01,NumericalTaxonomyand
MultivariateAnalysisSystem.Exetersoftware,Inc.,New
York.1997.
[13]SneathPHA&SokalRR,Numericaltaxonomy: The
principlesandpracticeofnumericalclassification.Free-
manWHCo,SanFrancisco,California.1973.
[14]刘建斌、陈新露、方 海、张云芳,用银染方法分析 RAPD
产物。北京农学院学报,1996,11(2):42-44。
[15]石 锐、郭长虹,聚丙烯酰胺凝胶中 DNA的银染方法。
生物技术,1998,8(5):46-48。
[16]乐晓萍、杜 鹏、张钦宪、金 辉、吴景兰,聚丙烯酰胺银
染技术改良。河南医科大学学报,2001,36(4):395-396。
[17]阳含熙、卢泽愚,植物生态学的数量分类方法。北京:科
学出版社,1983,97-103。
[18]ShiuYH,TheGenusIlexinChina.JournalofTheArnold
Arboretum,1949,30:233-344.
[19]祁承经、林亲众,湖南冬青科植物研究。中南林学院学
报,1999,3(19):1-8。
[20]LabraM,FabioTDi,GrassiF,RegondiSMG,BracaleM.,
VanniniC.&gradieA,AFLPanalysisasbiomarkerofex-
posuretoorganicandinorganicgenotoxicsubstancesin
plants.Chemosphere,2003,52(1):1183-1188.
[21]KatiaGV,CorinaD,AlejandroNC&JuneS,AFLPanal-
ysisofAgavetequilanavarieties.PlantScience,2006,170
(1):904-909.
[22]MireileF,VirginieL&MarkP,AFLPanalysisofthe
geneticdiversityofMeloidogynechitwoodiandM.falax,
majoragriculturalpests.CRBiologies,2005,328(1):455-
462.
钱永生 王慧中 施农农 赵 艳 黎念林 胡 中42
1期 10种冬青属植物遗传多样性RAPD和AFLPs分析
ABSTRACT ThetechniquesofrandomamplifiedpolymorphicDNA (RAPD) andamplifiedfrag-
mentlengthpolymorphisms(AFLPs)wereusedtoamplifythegenomicDNAof10speciesofIlex,
soastorevealthepolymorphismindiferentspeciesofIlex. InRAPDanalysis, atotalof301
lineswereamplifiedwith11kindsofprimersselectedfrom100kindsof10bprandomprimers,
andthepolymorphismwas98.63%. InAFLPsanalysis,ahugediversitywasshowedby3primers
combinationscariedoutonthesespecies.BothRAPDandAFLPsanalysiswereclusteredbyUPG-
MAandtheresultsshowedthatthegeneticdistancesweretheclosestbetweenI.purpureaandI.
vomitoriaAit,I.LitseaefoliaandI.zhejiangensis,I.hylonomavar.glabraandI.trifloravar.kanehi-
rai.
Keywords:Ilex.RAPD.AFLP.polymorphism
STUDIESOFGENETICDIVERSITYAMONG10SPECIESOF
ILEXBASEDONRAPDANDAFLPs*
QIANYongSheng1 WANGHuiZhong1** SHINongNong1
ZHAOYan2 LINianLin3 HUZhong3
(1KeyLaboratoryofHangzhouCityforBiochemistryandMolecularBiology,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou,
310018,China;2DepartmentofBiologicalEngineering,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou 310018,China;
3GreenEnvironmentEngineering,HangzhouBotanicalGardens,Hangzhou 310013,China)
**ThisworkwassupportedbytheNaturalScienceFoundationofZhejiangProvince,China(GrantNo.301406).
**Corespondingauther,Tel:0571-28865330;E-mail:whz62@163.com.
43