全 文 ：文章编号:1006-1126-2011 (1) -0004-04
桉树无性系与亲本及桉属其它种遗传关系分析
基金项目:广西壮族自治区科技厅项目 (桂科能 05112001-1C)
作者简介:刘海龙 (1980—), 男 , 工程师 , 博士研究生 , 从事林木遗传育种研究工作。
刘海龙 , 王以红 , 吴幼媚 , 蔡　玲 , 覃子海 , 黄金使
(广西林业科学研究院 , 南宁　530002)
摘　要:对桉属 (Eucalyptus)的 11 个种和 3 个无性系的 ITS 序列进行了比对分析 , 桉属的不同种以及 3 个无
性系的 ITS 长度范围为 633 ～ 678 bp。分析表明 , 3 个无性系的 ITS 为假基因 , 其 ITS 序列长度比近缘种长 38～
45 bp。因此 , 通过 ITS 引物扩增和测序可以将无性系与其它种类 、 品种或类型区分。系统发育分析表明 , 柠檬
桉(Eucalyptus citriodora)、粗皮桉(E.pellita)与尾叶桉(E.urophylla)有比较近的亲缘关系 , 而巨桉
(E.grandis)与窿缘桉 (E.exserta)有比较近的亲缘关系 , 这些有较近亲缘关系的种可以作为杂交育种的亲本
组合。
关键词:桉属;无性系;鉴定;ITS 序列;遗传关系
中图分类号:S792.39　文献标识码:A
Analysis of Genetic Relationship among Eucalyptus Clones , Parents ,
and Other Species in Eucalyptus
LIU Hai-long , WANG Yi-hong , WU You-mei , CAI Ling , QIN Zi-hai , HUANG Jin-shi
(Guangxi Fo restry Research Institute , Nanning 530002 , China)
Abstract:Sequences of the internal transcribed spacer (ITS)region of the nuclear ribosomal DNA
were obtained from 11 species of Eucalyptus and 3 clones , ranging f rom 633 bp to 678 bp in size.ITS
analy sis indicated that the non-functional pseudogenes w ere identified in 3 clones.Compared wi th o th-
er species , the amplified f ragments of 3 clones were 38 ～ 45 bp longer than those of 11 Eucalyptus
species.Therefore , we could differentiate the clones f rom other species in Eucalyptus by amplifying
and sequencing of ITS primers.Phy logenetic analysis revealed that E.pelli ta , E.urophyl la and
E.ci triodora in genet ic relationship w ere near , and E.grandis was related to E.exserta.These relat-
ed species in Eucalyptus could be used as parental combinations of hybridization in order to combine
desirable characteristics f rom different Eucalyptus species.
Key words:Eucalyptus;clone;identificat ion;ITS sequence;genetic relat ionship
　　桉属 (Eucalyptus)原产澳大利亚 、 巴布亚新
几内亚和菲律宾南部 , 是重要的生态和经济树
种[ 1] 。桉属种类是优良的建筑和工业用材 , 其适
应性广 、 抗逆性强 、 繁殖容易 , 也是经济林和防护
林的理想树种[ 2] 。因此 , 桉属树种被世界其它各
国广泛引种 , 我国引种桉树也已有 100年的历史。
广西林业科学院从上个世纪 70年代后期 , 对引种
桉树种间进行杂交实验以及基于实生苗群体进行性
状比较和优株选育实验 , 选育出多个生产性状良好
的桉树无性系 , 并成功地建立这些无性系的组培快
第 40 卷　第 1 期
2011 年 3 月 　　　　　　　　　　　　　
广 西 林 业 科 学
Guangxi Forestry Science
　　　　　　　　　　　　　　　Vol.40　No.1
Mar.2011
繁体系 , 无性系苗木的推广已经产生了巨大的社会
和经济效益。在进行杂交实验时 , 杂交亲本的选择
也是杂交育种工作中的首要任务 , 既要考虑表型性
状 , 也要尽可能避免杂交不育和杂合位点的散失等
问题。近年来 , ITS分子标记技术已经被广泛应用
于辅助杂交育种和苗木的标准化以及品种的苗期鉴
定方面[ 3-5] 。本研究在前期杂交育种和良种选育
工作的基础上 , 利用 ITS 序列分析技术对桉树无
性系与亲本及其它近缘种进行差异性位点分析 , 同
时 , 进行了桉树不同种类的亲缘关系分析 , 为进一
步进行杂交育种的亲本选择提供技术指导。
1　材料和方法
1.1　植物材料
试验所用的材料为广西林业科学研究院近年来
培育的广林巨尾桉 9号 、 广林巨尾桉 5号 、 广林尾
叶桉 4号的无性系组培苗 , 以及作为育种计划的巨
桉 、 尾叶桉和一些近缘种类 (表 1)。
1.2　DNA 提取
实验地采集新鲜叶片 , 硅胶彻底干燥 , 称取
0.1g 干叶 , 用 Fastprep (Bio101 , USA)粉碎 ,
CTAB法提取每个样本总 DNA[ 6] , 用 1.0%的琼脂
糖电泳检测 DNA 质量 , DNA的纯度和浓度通过紫
外吸收法测定 。
1.3　I TS 区的序列扩增 、 纯化和测序
ITS序列采用双引物扩增的方法得到 。聚合酶
链式反应 (PCR)在 GeneAmp PCR System 9700
PCR仪 (Perkin-Elmer USA)上进行 , 反应体系为
50 μL , 内含 dNTP (0.5 mmol/L), Mg 2+ (2
mmol/L), Taq DNA 聚合酶 (2.5U), 引物各为
10 pmol。PCR程序为:①90℃预变性 1 min;②
94℃变性 1 min , 55℃退火 20 s , 72℃延伸 50 s ,
共 2 个循环;③94℃变性 20 s , 55℃退火 20 s ,
72℃延伸 50 s , 共 38 个循环;④保持 72℃4 min。
PCR 的引 物为:P1:5 -AGAAG TCGTAA-
CAAGG T TTCCGATGG-3 ;P4:5 -TCCTC-
CTCCGTCTATTGATATGC-3 。I TS 扩增产物经
上海生工公司 UN IQ-10 纯化试剂盒进行纯化后 ,
送浙江大学植物研究所 Megabase1000 测序仪直接
测序 , 为保证所测序列的准确性 , 分别对每一样品
的 ITS 序列进行正 、反向测序。
表 1　供试桉树无性系及其近缘种类
无性系和种类 种名或植株代码 采集地点或 GeneBank 号码
广林 9 号组培苗 GL9 (Eucalyptus grandis×E.urophylla) 广西林科院桉树种质栽培基地
广林 5 号组培苗 GL5 (Eucalyptus grandis×E.urophylla) 广西林科院桉树种质栽培基地
广林 4 号组培苗 GL4 (Eucalyptus urophylla) 广西林科院桉树种质栽培基地
巨尾桉实生苗群体 GU (Eucalypt us grandis×E.urophylla) 广西林科院桉树种质栽培基地
尾叶桉实生苗群体 UR (E.urophylla) 广西林科院桉树种质栽培基地
巨桉 E.grandis 广西东门林场试验地
细叶桉 E. tereticornis 广西东门林场试验地
赤桉 E. camaldulensis 广西东门林场试验地
柠檬桉 E. citriodora 广西东门林场试验地
窿缘桉 E. exserta 广西东门林场试验地
圆角桉 E. teleticornis 广西东门林场试验地
粗皮桉 E.pellita AF390491
蓝桉 E.globulus AY615675
雪桉 E.paucif lora AF058489
外类
群伞房桉属 (Corymbia) C.ex imia AF390464
C. calophylla AF390460
杯果木属 (Angophora) A.euryphylla AF390448
Allosyncarpia A. ternate AF058453
1.4　数据的统计分析方法
本研究所测得的 ITS 序列采用 Sequencher
(4.0.5版)和 Clustal X(1.5b)进行排序 , Mac-
Clade 4.0进行差异位点的比对和分析。经手工适
当调整后利用 PAUP 4.0b8软件对序列进行统计及
分支分析。在分析中 , 缺隙 (gap)作为缺失
(missing)状态处理 , 最简约一致树 (consensus
t ree)采用 Heurist ic search寻找 , 并用 boo tst rap检
5第 1 期　　　　　　刘海龙 , 王以红 , 吴幼媚 , 等:桉树无性系与亲本及桉属其它种遗传关系分析
验系统树各分枝的内部支持率 (1 000 次重复)。
为了确定无性系之间以及与其它桉属 (Eucalyp-
tus)种类之间的亲缘关系 , 以伞房桉属 (Corym-
bia)和杯果木属 (Angophora)以及 Allosyncar-
pia 的 4个种作为外类群构建系统发育的有根树 。
2　结果与分析
2.1　无性系与巨尾桉 、 尾叶桉实生苗之间特异性
序列位点差异分析
3个无性系与巨尾桉 、 尾叶桉实生苗之间在
ITS 的序列长度上有一定的差异 , 3 个无性系
GL4 、 GL5和G L9号的 ITS的序列长度分别为671
bp 、 677 bp和 678 bp。巨尾桉和尾叶桉实生苗的
ITS的序列长度为 633 bp , 3个无性系比近缘种的
ITS长 38 ～ 45 bp。因此 , 通过 I TS 引物的扩增电
泳图可以将它们区分 。
2.2　种间亲缘关系分析
对桉属的 11个种和 3个无性系的 I TS 序列进
行了比对分析 。桉属 11个种和 3个无性系 ITS 的
总变异位点为 243 , 信息位点为 142个 。为了确定
桉属种间的亲缘关系 , 我们构建了桉属种间系统发
育关系的树状图 (图 1)。将缺隙 (gap)作为缺失
(missing)处理时 , 排列后的序列经 PAUP 软件分
析得到样本间的相对遗传距离和绝对遗传距离 (核
苷酸差异数) (数据略)。Bootstrap分析所获得的
严格一致树各分支的支持率如图 2所示 , 分支图中
各分支均得到较高的支持 , 置信度最低的为 50%,
最高的达 100%。3个无性系之间构成一组得到很
高的支持率 (BS =100%)。柠檬桉 、 粗皮桉与尾
叶桉构成一亚组 (BS=50%), 巨桉 、窿缘桉与杂
交种巨尾桉构成一亚组 (BS=79%), 这 2个亚组
再与赤桉 、圆角桉构成了一大组 (BS=60%)。蓝
桉与雪桉以及 3个无性系与桉属其他种类之间有较
远的亲缘关系 。
图 1　以伞房桉属和杯果木属的 4 个种为外类群 , 基于 ITS 序列分析构建桉属种间的最简约系统树
6 广 西 林 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　　　　第 40 卷
3　讨论
杂交育种方法是选择适当的亲本进行交配或结
合 , 将优良性状组合于杂交系统中 , 通过多代选
择 、 品种比较和鉴定 , 创造新品种的育种方法[ 7] 。
在杂交育种过程中既要考虑优良性状的组合 ,
也要分析种间的亲缘关系 , 种间亲缘关系远往往导
致杂交不亲合的现象。本研究的 I TS 分析表明 ,
柠檬桉 、粗皮桉以及尾叶桉之间有较近的亲缘关
系 , 可以作为进一步杂交育种的亲本组合。由于柠
檬桉引种的时间比较长 , 有很强的适应性 , 但柠檬
桉无性繁殖很困难 , 而尾叶桉的无性繁殖比较容
易。因此 , 通过柠檬桉与尾叶桉的杂交 , 有望能育
成适应性强 , 并能通过无性繁殖的方式达到林业产
业化过程中所需要的标准化苗木。巨桉与窿缘桉以
及圆角桉与赤桉之间有较近的亲缘关系 , 也可以作
为杂交育种的亲本组合。
本研究所鉴定的 3个无性系的 ITS 序列在功
能区 5.8S 基因片段与其它的桉属种类有较大分化 ,
属于桉属的一种假基因。该研究结果表明 , 我国在
引入桉树种类的过程中 , 有些种源可能还不是很清
楚 , 由于桉树为异花传粉的植物 , 不同种类的混种
常能导致种间多次自然杂交 , 同时人为对变异植株
进行了定向选择 , 这些因素都有可能导致培育的优
良无性系 ITS 与其亲本以及近缘种类之间出现显
著地分化 。
纵上所述 , 为了进一步规范桉树林业产业化过
程中苗木的标准化问题以及加快桉树的杂交育种计
划 , 对我国引入的桉树种源和种间遗传关系的调查
与研究亟待进行。
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