全 文 ：华西药学杂志
W C J P S　2007, 22(5):481 ～ 483 　　
基金项目:国家自然科学基金 (批准号:30472153)
作者简介:肖蔚(1982 -),女 ,正攻读生药学专业的硕士学位。
*通讯作者(Correspondent author), E -m ail:zhanghhx@ vip. sina. com
*研究论文*
沙棘属植物的 ISSR - PCR反应体系的建立
肖　蔚 , 张　浩* , 陈　雏 , 阿呷尔布
(四川大学华西药学院 ,四川 成都 610041)
摘要:目的　建立沙棘的简单重复序列区间聚合酶链反应( ISSR -PCR)优化反应体系 。方法　对影响 ISSR - PCR反应的各
因子 , 如模板 DNA用量 、TaqDNA聚合酶浓度 、镁离子浓度 、 dNTP浓度等进行单因素梯度实验。 结果　筛选出了优化的反应
条件。结论　建立的反应体系多态性高 ,系统稳定 , 可应用于沙棘属植物遗传多样性研究和亲缘关系分析。
关键词:沙棘;简单重复序列区间;反应体系;单因素梯度实验;优化
中图分类号:R28 文献标识码:A 文章编号:1006 -0103(2007)05 - 0481 -03
E stablishm ent and optmi um of ISSR - PCR reaction system ofH ippophae rhamnoides L.
XIAO Wei, ZHANG H ao* , CHEN Chu , A Ga - e r - bu
(West China S chool of Pharmacy, S ichuan University, Chengdu 610041, China)
Abstrac t:OBJECTIVE　To e stablish the optim ized inter - sim ple sequence repeat PCR( ISSR - PCR) reaction system ofHippophae
rhamnoides L. METHODS　The influentia l factors of ISSR -PCR am plification, such as tem plate DNA dosage, Taq DNA po lyme rase
concentra tion, Mg2+ concen tra tion, and dNTP concentration w ere ana ly zed based on sing le fac to r g radient te sts when they w ere applied
toH ippophae L. RESULTS　Each fac to rw as optim ized and de te rm ined. CONCLUSION　The established system proves app licab le
w ith high po lymo rph ism and good reproducibility, which could serve the study on genetic dive rsity and the ana ly sis abou t g en tic re la-
tionships o fH ippophae rhamnoides L.
K ey words:H ippophae rham noides L. ;Inter-sim ple sequence repea t;Reaction sy stem;Indiv idua l fac to r eva lution;Optimum
CLC num ber:R28 Docum ent code:A A rticle ID:1006 -0103(2007)05 - 0481 - 03
　　沙棘属 H ippophae L.植物是胡颓子科 E laeag-
naceae的落叶灌木或小乔木 ,主要分布于亚欧大陆 ,
是具有生态价值和经济价值的植物类群。沙棘系藏
族 、蒙古族习用药材 ,具有祛痰 、利肺 、化湿 、壮阳 、升
阴的作用。青藏高原作为沙棘属植物类群起源 、分
化的中心 ,不仅分布有该属的原始类群中国沙棘 、柳
叶沙棘 ,而且也有分化较晚 、较为进化的 5种沙棘集
中分布地区 。由于沙棘属植物的种内变异多样 ,种
间形状交错 ,在类群划分和中间关系研究等方面仍
存在许多疑问。加之 ,卧龙沙棘 、棱果沙棘 、理塘沙
棘和密毛肋果沙棘等几个种或亚种种群数量少 ,分
布面积小 ,分布区域狭窄 ,资源量十分有限 ,是中国
特有的珍稀类群 [ 1] 。因此 ,了解沙棘属植物进化生
物学特征 ,阐释其物种间遗传演化关系具有非常重
要的意义。
简单重复序列区间聚合酶链反应 ( ISSR -
PCR)扩增多态 DNA分析是建立在 PCR反应基础
上的一种分子生物学技术 ,具有重复性高 、原理简
单 、易操作等优点 ,已广泛用于品种鉴定 、种质资
源和遗传多样性的研究。但其扩增结果往往受多
个因素的影响。为确保 ISSR分析的特异性和可重
复性 ,特对 5个重要因素 (模板 DNA用量 、引物浓
度 、TaqDNA聚合酶用量 、 dNTP浓度 、Mg2+浓度 )
进行单因素梯度实验 ,以建立沙棘属植物的 ISSR
最佳反应体系。
1　实验部分
1.1　试剂和仪器
实验所用的植株幼叶采集于青藏高原沙棘属植
物不同类群的原生地域 ,样品用变色硅胶迅速干燥 ,
带回后放入冰箱保存 (表 1)。 ISSR引物参照哥伦
比亚大学公布的第九套引物序列 ,从中筛选出条带
清晰 、多态性高 、重复性稳定的 12条引物 ,实验选择
UBC807,引物由英骏生物技术有限公司合成;Taq
聚合酶 、dNTPs、分子量 Marker(宝生物工程有限公
司)。 PCR扩增仪 (B IORAD公司 );电泳仪 DYY -
2C 、紫外分析仪WD - 9403C(北京六一仪器厂 );紫
外分光光度计 UV - 2000(尤尼柯公司 )。
DOI牶牨牥牣牨牫牫牱牭牤j牣cnki牣wcjps牣牪牥牥牱牣牥牭牣牥牥牬
表 1　实验材料和采集地点
Table 1　 Experim enta lma terials and their collection sites
No. Species or sub species Collection si tes
1 H ippophae rhamno ides ssp. sinensis S ichu an Songpan
2 H. rhamnoid es ssp.wolongen sis S ichu anM aoxian
3 H. gon iocarpa ssp. litangensis S ichu an Li tang
4 H. rhamnoid es ssp.yunnanensis S ichu anK angd ing
5 H. gyan tsensis X izang Lasa
6 H. gon iocarpa ssp. gon ioca rpa S ichu an Songpan
7 H. tibetana S ichu an Li tang
8 H. neurocarpa ssp. neuroca rpa S ichu an Songpan
9 H. neurocarpa ssp. stella topilosa S ichu an Li tang
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA的提取　每个来源沙棘取 5份
的不同种源样本 ,将不同基源的各样本混合 ,液氮粉
碎 , 用改良的 CTAB法 [ 2]提取混合基因组 DNA ,并
溶于 TE缓冲液后低温贮存。 1.2%琼脂糖检测
DNA的存在及降解 ,紫外分光光度计测定其浓度。
1.2.2　 ISSR初始反应体系与退火温度的确定　 IS-
SR - PCR体系的初始扩增体系设定为:10 μl的反
应体系含 1μl PCR反应缓冲液 、3mmo l L- 1MgC l2 、
300μmo l L- 1 dNTPs、0.25 μmol L -1 p rime r、10 ng
DNA template及 1U Taq DNA po lyme rase。 94℃预
变性 1.5 m in。然后进入下列循环 , 94℃变性 45 s,
退火 45 s,延伸 1.5m in,共 45个循环 。循环结束后
72℃延伸 7m in[ 3] 。在 45℃ ～ 59℃间设置退火温度
梯度 ,进行引物的最适退火温度测定 。
1.2.3　PCR的单因素梯度实验　对模板 DNA浓
度 、引物浓度 、dNTP浓度 、Mg2 +浓度和 Taq DNA聚
合酶浓度进行单因素梯度试验 (表 2)。
表 2　单一因素的梯度实验
Table 2　Sing le factor gradient tests
Factors Concen tration grad ien ts
Tem plate DNA /ng (10μl)-1 5 10 30 50 100 150 200
Prim er /μmo l L- 1 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0.75 1.50
Taq DNA polym erase /U 0. 5 0. 8 1. 0 - - - -
M g2+ /mm ol L- 1 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3.0 3.5
dNTP /μm ol L- 1 50 100 150 200 250 300 350
1.2.4　优化扩增体系验证　在上述实验结果的基
础上 ,用 807引物对 5组混合样品进行 ISSR - PCR
扩增 ,以此对优化体系进行验证 。
1.3　结果　
1.3.1　退火温度　退火温度极大地影响着 ISSR反
应时引物与 DNA模板的特异性结合 。不同的引物
有不同的退火温度。对引物 UBC807进行退火温度
的测定 , 53.3℃时可扩增出清晰的带形;56.9℃及更
高的温度时条带依然清晰 ,但 PCR产物的丰度下
降 。所以将退火温度定为 53℃。
1.3.2　模板 DNA浓度　PCR反应中 ,当模板 DNA
浓度过低时 ,与引物的结合机率低 ,扩增产物不稳定
或无扩增产物;当 DNA浓度过高时 ,模板 DNA分子
之间的高结合率也会抑制引物和模板的结合机率;此
外 ,在模板 DNA中可能含有抑制 TaqDNA酶活性的
物质 ,抑制物的浓度会随模板 DNA浓度的提高而增
加 ,从而影响 PCR,甚至不能扩增。结果表明 ,在 10
μl体系中 ,沙棘模板 DNA浓度在 5 ng时扩增条带
少 ,不够清晰且不稳定;10 ～ 50 ng时 , ISSR条带明亮 、
清晰且稳定 ,此梯度内结果无明显差异;但大于 100 ng
时条带减少且亮度变暗;200 ng时无扩增产物 。因
此 ,将实验的模板 DNA浓度控制在 10 ～ 50 ng μl- 1。
1.3.3　引物的浓度 　当引物浓度过低时 , 模板
DNA与引物的结合机率减少 ,导致扩增产物量减
少;引物浓度过高 ,易引起碱基错配和产生非特异性
扩增 ,还易形成引物二聚体 。当引物浓度在 0.1 ～
0.2 μmo l L -1时 ,未扩增出任何条带;在 0.3、0.4 、
0.5 μmo l L -1时 , PCR结果无明显差异 ,均有清晰稳
定的条带;在引物浓度大于 0.75 μmol L -1时 ,扩增
条带清晰度下降 ,背景弥散增加 ,扩增片段变小。因
此 ,引物浓度选择 0.4 μmol L -1。
1.3.4　TaqDNA聚合酶用量　Taq酶浓度过低不能
有效地扩增 ,太高时则产生非特异性的扩增并加大实
验成本。 10 μl体系中 ,确定 Taq酶用量为 0.8U。
1.3.5　Mg2+浓度　 Mg2+在 PCR反应中是维持酶
活性的重要因子。Mg2+为 0.5mmol L- 1时 ,无扩增
条带;1.5 ～ 2.5 mmo l L - 1内 ,条带基本不变且清晰
稳定 。在 3.0、3.5 mmo l L -1水平时 ,条带略有减
少 ,同时清晰度明显下降 。因此 ,确定 Mg2+浓度为
2.0 mmo l L - 1。
1.3.6　dNTP浓度　4×dNTP是 PCR反应的原料 ,
其浓度过低时 ,导致扩增产率低下 ,过高则产生不稳
定的非特异性扩增。 dNTP在 50 μmo l L- 1时 ,条带
少且模糊;100 ～ 150 μmo l L -1扩增出的条带清晰稳
定 ,但亮度和条带数目都略少于 200、250 μmo l L - 1
时的扩增产物;为 300 μmo l L - 1时 ,条带清晰但弥
散背景强;在 350 μmo l L -1时 ,条带模糊。所以 ,
dNTP选择为 225 μmo l L -1的适宜浓度。
1.3.7　将上述反应体系应用于 5个沙棘混合样品
的 ISSR -PCR扩增 ,产生的 ISSR标记位点清晰 ,多
态性高 ,反应系统稳定(图 1)。
2　讨论　
PCR反应的影响因素较多 ,进行单因素梯度实
验 ,可简易而有效地帮助我们得到优化的反应体系。
通过实验 ,得到了各因素的适宜浓度范围 ,再取中间
值作为最终的实验结果 。考虑到不同模板 DNA中
482 　 华 西 药 学 杂 志　　　 第 22卷
华西药学杂志
W C J P S　2007, 22(5):483 ～ 486 　　
图 1　引物 807对 5个混合样品的扩增结果
F ig 1　 ISSR profiles o f5 m ix ed samp les, obta ined by em ploy ing op-
tim a l system(P rim er 807)
1. H. rham noid es;2. H. n eu rocarpa;3. H. gon ioca rpa;4. H. tibetana;
5. H. gyan tsensis;M. DNA m olecu lar w eightm arker
所含杂质程度的不同 ,在确定沙棘模板 DNA用量时
仅确定适宜浓度范围而未取其中间值 。考虑到经济
因素 ,将 Taq聚合酶适宜浓度范围内的最小值选作
优化结果 。文中实验以沙棘基因组 DNA为材料 ,建
立了重复性好 、分辨率高的 ISSR - PCR反应体系。
在选定的优化条件下 ,对同一株中国沙棘植株 DNA
分别进行了 3次 ISSR分析 ,结果可靠 ,带型稳定。
参考文献:
[ 1] 　 陈学林 , 马瑞君, 孙坤 , 等. 中国沙棘属种质资源及其生境
类型的研究 [ J] . 西北植物学报 , 2003, 23(3):451 - 455.
[ 2] 　 李宗菊 , 熊丽 , 桂敏 , 等. 非洲菊基因组 DNA提取及 ISSR -
PCR扩增模板浓度优化 [ J] . 云南植物研究 , 2004, 26(4):
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[ 3] 　 田春杰. 中国沙棘 、云南沙棘和江孜沙棘居群的化学成分与
遗传多样性分析 [ D] . 复旦大学学位论文 , 2003.
收稿日期:2007 - 03
作者简介:李延芳(1975 -), 女 , 博士 , 讲师 , 从事天然药物活性成分的研究工作。 E -m ail:lyf471@yahoo. com. cn
黄花败酱中三萜皂苷类成分的分离鉴定
李延芳 1 ,楼凤昌 2
(1.四川大学化学工程学院 ,四川 成都 610065;2. 中国药科大学天然药物化学教研室 , 江苏 南京 210038)
摘要:目的　研究黄花败酱中的化学成分。方法　将黄花败酱全草的乙醇提取物经大孔树脂、硅胶 、ODS柱分离得到 6个化合
物 ,通过(1H、13CNMR、ESI -MS等分析和化学方法进行结构鉴定。结果　6个化合物分别被鉴定为 3 -O -β -D -吡喃木糖 -
(1→3) -α- L -吡喃鼠李糖 -(1→2) -α- L -吡喃阿拉伯糖 -常春藤皂苷元 -28 -O -β -D -吡喃葡萄糖(6→1) -β -D -
吡喃葡萄糖 -(4→1) -α- L -吡喃鼠李糖酯苷(Ⅰ)、3 -O -β -D -α- L -吡喃鼠李糖 -(1→2) -α- L -吡喃阿拉伯糖 -常春
藤皂苷元 -28 -O -β -D -吡喃葡萄糖(6→1) -β -D -吡喃葡萄糖 -(4→1) -α- L -吡喃鼠李糖酯苷 (Ⅱ)、齐墩果酸 - 3 -
α-L -吡喃阿拉伯糖 -(2→ 1) -α- L -吡喃鼠李糖 - (3→ 1) -O - β - D -吡喃木糖苷(Ⅲ)、 3 -O - β - D -吡喃木糖 -
(1→3) -α- L -吡喃鼠李糖 -(1→2) -α- L -吡喃阿拉伯糖 -齐墩果酸 - 28 -O -β -D -吡喃葡萄糖酯苷 (Ⅳ)、齐墩果酸 -
3 -O -β -D -吡喃木糖 -(2→1) -α-L -吡喃鼠李糖苷(Ⅴ)、常春藤皂苷元 - 3 -O -α- L -吡喃阿拉伯糖 -(2→1) -α-
L -吡喃鼠李糖苷 (Ⅵ )。结论　化合物Ⅳ为一个新的天然产物 , 化合物Ⅰ和Ⅲ为首次从该植物中分离得到。
关键词:三萜皂苷;黄花败酱;败酱科;分离;鉴别
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1006 -0103(2007)05 - 0483 -04
Isolation and identification of triterpenoid sapon ins from Patrin ia scabiosaefo lia F isch
LI Yan - fang
1 , LOU Feng - chang 2
(1. D epartm en t of Pharm aceutics and B ioengineering , Sichuan University, Chengdu 610065, China;2. Departm ent of NaturalM ed icinal
Chem istry, Ch ina Pharmaceutica lUniversity, Nanjing 210038, China )
Abstrac t:OBJECTIVE　 To investigate the chem ica l constituents o f thew ho le p lant ofPa trin ia scabiosaefolia F isch. METHODS　
Co lum n chrom atography ( inc luding D101 m acroporous resin, silica ge l and ODS) w as used to separa te the chem ica1 constituents in the
e thano l extract o f thew ho le plan.t The constituent structu res w ere eluc ida ted by ESI -MS, NMR (1D and 2D) spectro scop ic ana lysis
and hydro ly sis m e thods. RESULTS　 S ix com poundsw e re iso lated and identified a s prosapogenin CP3(Ⅰ ), siebo ldianasideA (Ⅱ ),
hede rasaponin C (Ⅲ ), 3 -O -β -D - xy lopy ranosy l(1→3) -α- L - rhamnopy rano sy l(1→ 2) -α-L - arabinopyranosy l o leanolic
acid 28 -O -β - D - g lucopy rano sy l este r (Ⅳ), g iganteaside D (Ⅴ) and sap indoside A (Ⅵ ), respec tive ly. CONCLUSION　
Com poundⅣ is a new natura l produc.t CompoundsⅠ and Ⅲ we re iso lated from this plan t for the first tim e.
K ey words:T rite rpenoid saponins;Patrinia scabiosaefolia;Valer ianaceae;Iso la tion;Identifica tion