全 文 ：药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2016，23(2):121 ～ 123
收稿日期:2015-09-03 修回日期:2015-02-06
基金项目:国家自然科学基金项目(No． 81260677)，云南省教育厅重点项目(No． 2012Z118) ，云南省教育厅项目(No． KY1214206551)。
作者简介:李水仙(1987 －)，女，云南昆明人，助教，研究方向为药用植物的种质资源评价，E-mail:lsx5289@ 163. com。
* 通讯作者:夏从龙(1975-)，男，云南丽江人，教授，主要从事生药的研究及开发工作，E-mail:long7484@ 126. com。
椭圆叶花锚遗传多样性的 ISSＲ分析
李水仙1，陈丽元2，夏从龙2*
(1. 大理学院 基础医学院，云南 大理 371000;2. 大理学院 药学与化学学院，云南 大理 671000)
摘 要 研究不同野生居群藏药“蒂达”主要基原植物椭圆叶花锚的遗传多样性。对 17 个野生居群的椭圆
叶花锚及其近缘种样本进行 ISSＲ-PCＲ扩增，用 POPGENE 1. 32 软件分析并计算 Neis遗传距离，用 NTSYS软件分
析遗传距离及相似系数，UPGMA方法聚类，构建亲缘关系系统图。从 30 条 ISSＲ 引物中筛选出 11 个用于多态性
分析，11 条引物共检测到 97 个位点，多态性位点百分率为 100%。遗传相似系数变化范围 0. 299 4 ～ 0. 991 2。聚
类结果显示，来源于同一地区不同居群的椭圆叶花锚亲缘关系较近，并与其近缘种具有显著差异。本实验从分子
水平为椭圆叶花锚及其近缘种药用植物的鉴定和开发提供了遗传基础。
关键词 椭圆叶花锚;藏药;蒂达;野生居群;简单重复序列区间;遗传多样性
中图分类号 S567 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2016)02-0121-03
椭圆叶花锚(Halenia elliptica D. Don)是龙胆科花锚属
植物，以干燥地上部分入药，味苦，性寒，具有清热祛湿，疏
肝利胆等功效，为藏药“蒂达”的主要基原植物［1-3］，收载于
《卫生部药品标准·藏药(第一册)》、《藏药标准》、《青海省
中药材标准》中。蒙、僳僳、佤、普米等民族药中也在使
用［4］。椭圆叶花锚主产于青藏高原，分布较广，在藏、滇、川
等省区皆产［5］。目前已有使用该药用植物的蒙花锚肝宁
片、乙肝健片、二十五味獐牙菜丸等治疗肝胆疾病的准字号
成药上市销售，资源需求量较大［6］。由于多年的过度采挖，
椭圆叶花锚于 2001 年被西藏红十字会与瑞士红十字会制
定的《濒危藏药物种名录》列为三级濒危藏药［7］，加之“蒂
达”品种繁多，基原复杂，民间出现多种混淆品，应用较为混
乱，极大的限制了该类药材的进一步开发利用。目前，对椭
圆叶花锚的研究主要集中在化学成分研究、有效成分的含
量测定及药理作用研究，尚未见有关椭圆叶花锚遗传多样
性方面的研究报道。
简单重复序列区间(Inter simple sequence repeat，ISSＲ)
是 Zietkiewicz等［8］于 1994 年提出的一种以 PCＲ为基础的
分子标记技术，集 ＲAPD、SSＲ 技术的优点于一身，具有简
便、快速、重复性强［9-10］等特点，广泛应用于药用植物鉴
定、近缘物种进化关系、中药质量标准化和辅助育种等领
域［11-12］。本研究采用 ISSＲ 分子标记对“蒂达”主要基原
植物椭圆叶花锚及其近缘种进行了遗传多样性分析，从
分子水平为椭圆叶花锚及其近缘种药用植物的鉴定和
开发提供遗传基础，为藏药“蒂达”的正本清源提供理论
依据。
1 材料和方法
1. 1 供试材料
供试材料均为自采，由大理学院药学与化学学院夏从
龙教授鉴定，见表 1。选取生长健壮、无病虫害的健康植
株，采集当年萌发的幼嫩叶片，硅胶干燥后置于低温干燥处
保存备用。
2 × mix(Tian Gen)，DNA Marker(Tian Gen) ，引物参照
加拿大哥伦比亚大学 UBC公司 2006 年公布的 ISSＲ引物序
列，由上海生工合成，其他试剂均为国产分析纯。
Tab 1 Origins of samples
No． Chinese name Latin name Collected place
1 ～ 13
14 ～ 15
16 ～ 17
椭圆叶花锚
青叶胆
紫红獐牙菜
Halenia elliptica
Swertia mileensis
Swertia puricea
Dali bai autonomous prefecture of Yunnan province
Honghe Hani and Yi Autonomous prefecture of Yunnan province
Dali bai Autonomous Prefecture of Yannan province
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药 物 生 物 技 术 第 23 卷第 2 期
1. 2 试剂
Applied Biosystem 2720型 PCＲ 仪(美国应用生物系统
公司)，GBOX HＲ化学发光凝胶成像系统(英国 Syngene 公
司)，DYY-BC型电泳系统(北京市六一仪器厂)，离心机(德
国 Eppendorf)。
2 方法
2. 1 基因组 DNA提取
采用 CTAB法提取样品总 DNA。用 1%琼脂糖凝胶电
泳法检验 DNA质量，紫外分光光度计检测 DNA质量浓度，
稀释至 50 ng /μL备用。
2. 2 ISSＲ-PCＲ反应体系
在 Applied Biosystem 2720型 PCＲ 仪上扩增，反应体系
为 25 μL，包括:Mg2 + 2. 5 mmol /L，dNTP 0. 2 mmol /L，Taq
DNA聚合酶 1. 0 U，引物 1. 0 μmol /L，DNA模板 50 ng，10 ×
Buffer 2. 5 μL，超纯水补至 25 μL。扩增程序:94 ℃预变性
5 min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，共循
环 35 次，然后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保温。
2. 3 扩增产物的检测
将 PCＲ产物在含有溴化乙锭(EtBr)染料染色的 1. 5%
琼脂糖凝胶中电泳 1. 5 h，电泳结束后在凝胶成像系统中照
相保存。
2. 4 数据统计与分析
在同一引物、同一位点根据扩增产物有条带的记为
“1”、无条带记为“0”，得到二元资料，形成 0 /1 矩阵，用
POPGENE 1. 32 软件进行分析，计算 Nei s 遗传距离，采用
NTSYS 2. 10e软件进行聚类分析，构建聚类图。
3 结果与分析
3. 1 引物筛选
从 30 条加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的 ISSＲ 引
物序列进行筛选，从中筛选出 11 条扩增条带清晰、多态性
好，重复性好的引物，计算多态位点百分率(PPL)结果见
表 2。
Tab 2 Sequences of 8 primers used in ISSＲ analysis and their amplification products
Primes Sequence Annealing temperature / ℃ Total bands number Polymorphic bands PPL /%
UBC 807 (AG)8T 52. 2 7 7 100
UBC 817 (CA)8A 54. 8 10 10 100
UBC 825 (AC)8T 51. 9 11 11 100
UBC 827 (AC)8G 49. 5 10 10 100
UBC 828 (TG)8A 52. 3 5 5 100
UBC 836 (AG)8YA 49. 4 11 11 100
UBC 840 (GA)8YT 52. 7 9 9 100
UBC 842 (GA)8YG 54. 9 10 10 100
UBC 855 (AC)8YT 50. 7 7 7 100
UBC 857 (AC)8YG 54. 4 8 8 100
UBC 873 (GACA)4 54. 4 9 9 100
3. 2 ISSＲ-PCＲ扩增结果
用筛选出的 11 条引物对 17 份材料进行扩增，共扩增
出 97 条条带，均具有多态性，多态性位点百分率为 100%，
每个引物扩增出的 DNA条带数为 5 ～ 11 条，平均为 8. 8 条
(表 2)，这些 DNA片段大小主要集中在 300 ～1 500 bp(图 1)。
扩增条带数最多的是 UBC825 和 UBC836，达 11 条，扩增条
带数最少的是 UBC828，为 5 条。所有引物多态性百分比均
为 100%，表明 ISSＲ能够揭示材料间的多态性，且经过标记
谱带的分析，可用于鉴别本文供试品。
3. 3 聚类分析
从聚类图中可以看出，在距离线约 0. 71 处，可将供试
的 17 份材料分成 3 大类(图 2)。第一类包括 1 ～ 13 号材
料，在距离线约 0. 85 处形成 3 个亚类(A、B、C)，A 亚类包
括 1 ～ 5 号，B亚类包括 6 ～ 8 号，C 亚类包括 9 ～ 13 号。第
二类包括 14 ～ 15 号样品，第三类包括 16 ～ 17 号样品。根
据遗传相似性，4 号样品和 5 号样品的亲缘关系最近，遗传
相似性为 0. 991 2;5 号和 15 号样品的亲缘关系最远，遗传
相似性为 0. 299 4。
Fig 1 Electrophoresis products of ISSＲ primer UBC842
221
李水仙，等:椭圆叶花锚遗传多样性的 ISSＲ分析
Fig 2 Drendrogram of UPGMA cluster
analysis based on ISSＲ
4 讨论
对所收集材料中存在的遗传多样性进行评估是有效
地利用和保护种质资源的关键环节，分子标记技术的发展
将会对种质资源的评价起到极大的推动作用。ISSＲ 标记
具有程序简单、操作快速、成本低等优点，因而已被广泛地
应用于植物遗传多样性研究中。本研究利用 11 条引物对
17 份材料进行扩增，共扩增出 97 条条带，其中多态性的
条带数为 97 条，多态性位点百分率为 100%，具有较高的
多态性，这种多态性将为椭圆叶花锚及其近缘种药用植物
种质资源的保存、鉴定、适应性评价以及生态型研究奠定
可靠、稳定的基因基础。
聚类分析结果显示，椭圆叶花锚种内遗传相似系数为
0. 732 ～ 1. 000，表明其种内遗传差异性较小，亲缘关系较
近，且呈现一定的地理相关性。而椭圆叶花锚与其近缘种
青叶胆、紫红獐牙菜的遗传相似系数为 0. 299 ～ 0. 526，表明
种间的遗传差异性较大，亲缘关系较远。同时，数据还表明
椭圆叶花锚种群内部可见丰富的遗传多样性，这可能是由
于环境条件的改变使物种在长期适应环境的过程中发生了
不同物种性状间的交叉。从遗传学的角度来看，这种遗传
多样性意味着比较高的适应能力，蕴涵着较大的进化潜能
以及比较丰富的育种和遗传改良能力，这为今后的栽培育
种提供了依据。另外，本实验通过 ISSＲ-PCＲ扩增产生了较
多的多态性谱带，利用这些谱带可将“蒂达”主要基原植物
椭圆叶花锚及其近缘种青叶胆和紫红獐芽菜从分子水平上
进行鉴别，为藏药“蒂达”的正本清源提供理论依据。
参 考 文 献
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Analysis of Genetic Diversity in Halenia elliptica by ISSＲ
LI Shui-xian1，CHEN Li-yuan2，XIA Cong-long2*
(1． Department of Basic Medical Sciences，Dali University，Dali 671000，China;2． School of pharmacy，Dali
University，Dali 671000，China)
Abstract To investigate the genetic diversity for germplasm resources of Halenia elliptica，an important source of the Tibetan medicine
“Dida”in different wild populations． ISSＲ amplification was used to analyze the genetic diversity of Halenia elliptica from seventeen
wild populations． The Neis genetic distance was analyzed by POPGENE 1． 32． To make up the systematic diagram of genetic relation-
ship by NTSYS software，cluster by UPGMA method，and establish the dendrogram． Eight ISSＲ primers were selected respectively from
30 ISSＲ primers． 11 primers produced 97 sites，and the average percentage of polymorphic bands was 100% ． Genetic similarity coeffi-
cient changed from 0． 732 to 1． 000． By cluster analysis，it shows that different populations of the medicinal plants in Halenia elliptica
from the same region are in the same group and demonstrates that there are significant differences between its counterfeit species in the
tested materials． This study will provide the foundation for identification and development of medicinal plants in Halenia elliptica．
Key words Halenia elliptica，Tibetan medicine，Dida，Wild populations，Inter simple sequence repeat (ISSＲ)，Genetic diversity
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