全 文 :西北林学院学报 2016,31(3):155~159
Journal of Northwest Forestry University
doi:10.3969/j.issn.1001-7461.2016.03.26
24份杜鹃属植物的ISSR分子鉴定
收稿日期:2015-11-29 修回日期:2016-01-17
基金项目:广西壮族自治区直属公益性科研院所基本科研业务费专项(桂热研201412)。
作者简介:罗 清,女,硕士,助理研究员,研究方向:植物种质资源收集、育种与栽培。E-mail:lqlq522@163.com
*通信作者:池昭锦,男,工程师,研究方向:热带作物栽培。E-mail:973919489@qq.com
罗 清,卢业飞,於艳萍,毛立彦,严 霖,池昭锦*
(广西壮族自治区 亚热带作物研究所,广西 南宁530001)
摘 要:采用ISSR分子标记对24份杜鹃属植物进行亲缘关系分析,7个ISSR引物共扩增出92
条谱带,其中89条为多态性谱带,多态性比率达96.7%。利用NTSYS-pc2.10e软件计算24份杜
鹃属植物间的遗传相似系数,变化范围在0.456 5~0.782 6之间,平均相似系数为0.613 4。通过
UPGMA聚类分析发现,24份杜鹃属植物被划分为3大类,聚类结果与地理分布存在一定的相关
性,其中第2类与形态学分类基本吻合,表明24份杜鹃属植物的ISSR扩增图谱差异较大,易于区
分,可用于杜鹃属植物的鉴定。
关键词:ISSR;杜鹃属;亲缘关系;鉴定
中图分类号:S722.33 文献标志码:A 文章编号:1001-7461(2016)03-0155-05
Identification of 24 Rhododendron Plants by ISSR Molecular Markers
LUO Qing,LU Ye-fei,YU Yan-ping,MAO Li-yan,YAN Lin,CHI Zhao-jin*
(Guangxi Subtropical Crops Research Institute,Nanning,Guangxi 530001,China)
Abstract:ISSR molecular marker was used to study the genetic relationships of 24samples of Rhododen-
dronplants,a total of 92bands were amplified by 7ISSR primers,89of which were polymorphic ones,ac-
counting for 96.7%of the total.The genetic similarity coefficients varied from 0.456 5to 0.782 6with an
average of 0.613 4,computed with software NTSYSpc2.10e.According to the UPGMA method,24 Rhodo-
dendron samples could be divided into three groups,clustering result with geographical distribution had
certain relevance,and the second group was in accordance with the basic morphological classification.The
result confirmed that 24 Rhododendronplants were easily identified owning to distinct diverse ISSR poly-
morphic bands,so this may be used for the identification of the Rhododendronplants.
Key words:ISSR;Rhododendron;genetic relationship;identification
杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花亚科(Rhododen-
droideae)杜鹃属(Rhododendron)植物约有960种,
欧洲、亚洲及北美洲分布广泛,我国主要分布在西南
和华南地区,约占世界种类的3/5[1]。杜鹃属植物
花色多样、艳丽迷人、千姿百态,具有非常高的观赏
价值,在我国已成为重要的园艺品种,也是我国十大
名花之一,广泛应用于家庭盆栽和园林绿化。
ISSR(inter-simple sequence repeat)简单重复
序列扩增,具有多态性高、精确度高、检测方便、快速
高效等优点[2-5],现已被广泛运用于亲缘关系分析、
物种进化和植物种质资源品种鉴别等研究[6-9]。
杜鹃属植物被全世界各国爱好者所青睐,目前
为止通过原种及后代反复杂交已有近万个园艺品
种,20世纪初我国分类学家开始进行杜鹃属植物研
究,由于种类繁多,每个学者所青睐的分类系统不
同,导致许多同名异物、同物异名的现象时常出现,
单从形态学对其进行鉴定已很难区分,随着分子生
物学的飞速发展,分子标记技术已广泛应用于杜鹃
属植物的遗传多样性分析和亲缘关系[10-13],大部分
学者只针对某个亚属或全部栽培种或全部原生种进
行研究,本研究利用ISSR分子标记技术对12份原
生种和12份栽培种杜鹃属植物(包括5个亚属)进
行鉴定,探讨其亲缘关系,以期对种类繁多的杜鹃属
植物的鉴定提供更准确、更快捷的方法,为杜鹃属植
物精确分类、杂交育种和基因工程等提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
24份杜鹃属植物(表1)分别引自广西、云南、贵
州以及浙江,种植于广西亚热带作物研究所试验基
地。采集新鲜嫩叶置于冰盒带回实验室立刻提取。
表1 供试杜鹃品种
Table 1 Names of Rhododendronvarieties
序号 种、品种 拉丁学名 来源
1 锈叶杜鹃 Rhododendron siderophyllum 贵州黔西
2 问客杜鹃 Rhododendron ambiguum 贵州黔西
3 迷人杜鹃 Rhododendron agastum 贵州黔西
4 羊踯躅 Rhododendron molle 云南昆明
5 喜鹊登枝 Rhododendron‘Xique Dengzhi’ 浙江金华
6 富士 Rhododendron‘Fushi’ 浙江金华
7 若姪子 Rhododendron‘Ruo Zhizi’ 浙江金华
8 南希.玛丽 Rhododendron‘Nanxi Mali’ 浙江金华
9 凤冠 Rhododendron‘Fengguan’ 浙江金华
10 母亲节 Rhododendron‘Mu Qinjie’ 浙江金华
11 孩儿面 Rhododendron‘Hai Ermian’ 浙江金华
12 丹霞 Rhododendron‘Danxiao’ 浙江金华
13 春晓6号 Rhododendron‘Chunxiao 6Hao’ 浙江金华
14 如意 Rhododendron‘Ruyi’ 浙江金华
15 盛春4号 Rhododendron‘Shengchun 4Hao’ 浙江金华
16 常春2号 Rhododendron‘Changchun 2Hao’ 浙江金华
17 长蕊杜鹃 Rhododendron stamineum 桂林猫儿山
18 腺萼马银花 Rhododendron bachii 桂林猫儿山
19 广福杜鹃 Rhododendron kwangfuense 桂林花坪
20 毛棉杜鹃 Rhododendron moulmainense 桂林花坪
21 华丽杜鹃 Rhododendron farrera 桂林花坪
22 马银花 Rhododendron ovatum 桂林花坪
23 广西杜鹃 Rhododendron kwangsiense 桂林花坪
24 桂海杜鹃 Rhododendron guihainianum 金秀大瑶山
1.2 DNA提取
采用Solar Technologier Inc公司生产的植物
基因组DNA提取试剂盒抽提24份供试材料基因
组DNA,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光
度计检测提取DNA的质量与浓度(图1),并最终稀
释成20ng·μL
-1的浓度,-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
ISSR引物序列参照加拿大哥伦比亚UBC公司
公布的序列,上海生工生物工程技术服务公司合成。
ISSR-PCR优化体系为20μL 反应液,包括1.0
μLDNA,1.0μLprimer,10.5μL2×Taq PCR Mas-
ter Mix,7.5μLddH2O。其中,2×Taq PCR Master
Mix购自天根生化科技(北京)有限公司。ISSR-
PCR扩增程序为94℃预变性4min;94℃变性40s,
52℃复性40s,72℃延伸1min,共28个循环;最后
72℃延伸7min,于4℃保存。ISSR-PCR扩增产物
利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,检测结果
采用自动凝胶成像系统拍照保存。
1.4 数据处理
采用人工读数,有带记“1”,无带记“0”,建立24
份杜鹃属植物的ISSR识别卡(表2)。利用软件
NTSYS-pc2.10e对原始数据进行分析,计算供试材
料间的遗传相似系数,并进行 UPGMA聚类分析,
构建24份杜鹃属植物的树状聚类图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选和多态性分析
从100条ISSR引物中筛选出7条谱带清晰、
多态性好的引物对24份供试材料进行PCR扩增
(图2)。7条引物共扩增出92条谱带,其中多态性
谱带89条,多态性比率达到96.7%,每条引物扩增
的多态性谱带在9~15条之间,平均为12.7条,扩
增产物长度范围在200~2 000bp之间。7条引物
中4条引物扩增的多态性比率为100%,其余3条
引物扩增的多态性比率均在90%以上(表3),筛选
出的7条引物符合分子标记对扩增带的要求,ISSR
标记检测杜鹃属植物间亲缘关系在分子水平上的多
态性是比较丰富的。
2.2 聚类分析
24份杜鹃属植物材料的遗传相似系数在
0.456 5~0.782 6之间,平均相似性系数0.613 4。
在杜鹃栽培种中,亲缘关系最近的是富士和若姪子,
遗传相似系数为0.782 6;遗传距离最大的是喜鹊登
枝与常春2号,遗传相似系数仅为0.521 7。杜鹃野
生种中,长蕊杜鹃与毛棉杜鹃遗传相似系数最大,为
0.771 7;广福杜鹃与马银花杜鹃遗传距离最大,遗
传相似系数为0.554 3。而栽培品种常春2号与野
生种广福杜鹃亲缘关系最远,遗传相似系数也最小,
仅为0.456 5。为确定24份杜鹃属植物之间的亲缘
关系,利用UPGMA法进行聚类分析,按照遗传相
似系数构建亲缘关系树状图(图3)可知,在遗传相
似性系数为0.58水平处羊踯躅和常春2号与其他
品种分开单独聚为1类,可能原因为供试品种中只
有羊踯躅的花为金黄色,在我国羊踯躅亚属有且只
有1个种,而常春2号较其他栽培品种不同为多季
花。其余22个品种在遗传相似性系数为0.61水平
处继续被划分为2个类群:第1类群中,锈叶杜鹃、
问客杜鹃、迷人杜鹃及几个栽培品种聚为1类,说明
该11个栽培品种的亲本与杜鹃亚属的亲缘关系较
551第3期 罗 清 等:24份杜鹃属植物的ISSR分子鉴定
近,可能为杜鹃亚属植物的杂交种;而常绿杜鹃亚
属、马银花亚属及映山红亚属则聚为第2类群。第
2类群中,所有杜鹃的叶都是革质,在遗传相似系数
为0.63时分为2类,花色为淡紫色的马银花与广西
杜鹃被分为1类,其余淡粉色至白色的分为1类,聚
类结果与形态学分类基本相吻合。
图1 杜鹃基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 Result of agarose gel electrophoresis of genomic DNA from of Rhododendronplants
表2 24个杜鹃品种的ISSR识别卡(UBC826)
Table 2 Recognition cards based on ISSR marker amplified from 24varieties of Rhododendron(UBC826)
序号 品种 识别卡号 序号 品种 识别卡号
1 锈叶杜鹃 0000111011 13 春晓6号 0110101000
2 问客杜鹃 0001010110 14 如意 0100101000
3 迷人杜鹃 0011001011 15 盛春4号 0001101111
4 羊踯躅 1111101000 16 常春2号 0011001011
5 喜鹊登枝 0110110011 17 长蕊杜鹃 1010011110
6 富士 0010110000 18 腺萼马银花 1010011111
7 若姪子 0010110011 19 广福杜鹃 1000111111
8 南希.玛丽 0010110011 20 毛棉杜鹃 1110011111
9 凤冠 0010010111 21 华丽杜鹃 0010110100
10 母亲节 0000010111 22 马银花 0111010111
11 孩儿面 0110110011 23 广西杜鹃 0111010111
12 丹霞 0000001111 24 桂海杜鹃 1101110111
图2 引物UBC848对24个品种的扩增结果
Fig.2 ISSR patterns of 24varieties amplified by primer UBC848
表3 筛选的引物序列及多态性比较
Table 3 Sequences of primers and comparisons of polymorphism
引物代码 引物序列 多态性条带数 总条带数 多态百分比/%
UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 9 10 90.0
UBC827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 12 13 92.3
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 15 15 100.0
UBC836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 14 15 93.3
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 13 13 100.0
UBC847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 13 13 100.0
UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 13 13 100.0
总数 89 92 —
平均 12.7 13.1 96.7
651 西北林学院学报 31卷
图3 基于ISSR的杜鹃品种UPGMA聚类图
Fig.3 UPGMA cluster diagram of 24 Rhododendronvarieties based on ISSR
3 结论与讨论
分子标记技术可以快速准确的对植物材料进行
鉴别,夏蜡梅、牡丹、蝴蝶兰、万寿菊属、鸢尾属及石
斛属等花卉都已经成功的运用分子标记进行品种鉴
定[14-18]。在杜鹃种质资源上,赵喜华[19]、M.J.
Iqbal[20]及N.Kobayashi[21]等成功运用RAPD标记
在分子水平上鉴定出品种,用 AFLP标记[22]、用
SSR标记都分别对杜鹃的遗传关系进行分析[23]。
赵凯[24]、彭婵[25]和陈春福[26]等对杜鹃属不同品种
采用ISSR分子标记技术,对供试材料进行了分子
鉴别。本研究中,24份杜鹃属植物的ISSR扩增可
以得到清晰的谱带,多态性比率达到97.8%,7条引
物能够较好地将供试材料区分开,表现出很高的鉴
定效率。
用AFLP分子标记对杜鹃品种进行研究,聚类
结果把栽培种与中国野生种明显分开[22],本研究聚
类结果与汪琼[22]研究结果相似。供试材料的亲缘
关系与引种的地理位置有关,不同地方引种的植物
大致被聚为1类,聚类结果可能与所处的环境及经
纬度相关,说明种源地对亲缘关系的远近有一定的
影响,这与张肖娟[27]的研究结果一致。
24份供试材料聚类分为3大类,11个栽培种与
杜鹃亚属品种划分为第1类,常绿杜鹃亚属、马银花
亚属及映山红亚属的几个品种划分为第2类,1个
栽培种与羊踯躅亚属品种划分为1类,其中第2类
与传统形态学分类基本一致。从引种地分析,聚类
结果与地理分布存在一定的相关性。基因型到表型
的实现过程受到环境因素和遗传因素的双重影
响[28],杜鹃属植物在长期进化过程中基因交流频
繁,且属异花授粉植物,只靠形态学手段很难区分现
有品种,利用ISSR标记构建杜鹃属植物的DNA指
纹图谱,将可以作为品种鉴定的有效手段,当然,分
子标记方法的评价结果容易受到样本大小与代表
性、不同引物与引物数量的影响,完全取代形态学方
法是不科学的。因此,综合分子标记技术与形态学
进行分析,可以合理、快速、精确地对杜鹃属植物进
行鉴定和分类。
参考文献:
[1] 李光照.中国广西杜鹃花[M].上海:上海科学技术出版社,
2008:1-6.
[2] 陈少瑜,张雨,陈霞,等.27份核桃种质资源亲缘关系的ISSR
分析[J].西北林学院学报,2012,27(4):108-112.
CHEN S Y,ZHANG Y,CHEN X,et al.Genetic relationship of
27walnut germplasm resources based on ISSR markers[J].
Journal of Northwest Forestry University,2012,27(4):108-
112.(in Chinese)
[3] 李薇,王永进,樊军锋,等.美洲黑杨新无性系的ISSR鉴别及
SCAR标记转化[J].西北林学院学报,2014,29(4):98-102.
LI W,WANG Y J,FAN J F,et al.ISSR identification and
transformation of SCAR marker of three new clones of Popu-
lus deltoids[J].Journal of Northwest Forestry University,
2014,29(4):98-102.(in Chinese)
[4] 代惠萍,赵桦,吴三桥,等.秦巴山区油茶品种遗传多样性的IS-
SR分析[J].西北林学院学报,2014,29(2):107-111.
DAI H P,ZHAO H,WU S Q,et al.ISSR analysis of genetic
diversity of Camellia oleiferain Qinba Mountains[J].Journal
of Northwest Forestry University,2014,29(2):107-111.(in
Chinese)
751第3期 罗 清 等:24份杜鹃属植物的ISSR分子鉴定
[5] 谈探,金则新,李钧敏,等.濒危植物夏蜡梅遗传分化研究[J].
西北林学院学报,2008,23(2):77-82.
TAN T,JIN Z X,LI J M,et al.Genetic differentiation of Caly-
canthus chinensis an endangered plant[J].Journal of Northwest
Forestry University,2008,23(2):77-82.(in Chinese)
[6] 金则新,李钧敏.濒危植物长叶榧ISSR-PCR反应体系的建立
[J].西北林学院学报,2006,21(5):94-97.
JIN Z X,LI J M.Establishment of ISSR-PCR reaction system
of endangered plant Torreyajackii[J].Journal of Northwest
Forestry University,2006,21(5):94-97.(in Chinese)
[7] 刘丽丽,金则新,李建辉,等.东南石栎ISSR-PCR反应体系的
优化[J].西北林学院学报,2008,23(5):65-69.
LIU L L,JIN Z X,LI J H,et al.Optimization of ISSR-PCR re-
action system of Lithocarpus harlandii[J].Journal of North-
west Forestry University,2008,23(5):65-69.(in Chinese)
[8] 刘兴菊,汤新彩,梁海永,等.枣树ISSR反应体系的建立及优
化[J].西北林学院学报,2007,22(5):62-65.
LIU X J,TANG X C,LIANG H Y,et al.Establishment and
optimization of an ISSR reaction system for Chinese date(Ziz-
iphus jujuba)cultivars[J].Journal of Northwest Forestry U-
niversity,2007,22(5):62-65.(in Chinese)
[9] 顾婧婧,金则新,李钧敏,等.乌药ISSR扩增条件的优化[J].西
北林学院学报,2008,23(6):94-97.
GU J J,JIN Z X,LI J M,et al.Optimization of the ISSR condi-
tions in Lindera aggregata[J].Journal of Northwest Forestry
University,2008,23(6):94-97.(in Chinese)
[10] 刘旭颖,沈向群,张艳红,等.9种耐寒杜鹃花亲缘关系ISSR
分析[J].西北农业学报,2010,19(7):89-92.
LIU X U,SHEN X Q,ZHANG Y H,et al.Genetic relation-
ship of nine hardy rhododendrons by ISSR marker[J].Acta
Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica,2010,19(7):89-92.
(in Chinese)
[11] 郑宇,何天友,陈凌艳,等.比利时杜鹃栽培品种(系)的ISSR
分析[J].福建农林大学学报:自然科学版,2011,40(3):271-
275.
ZHENG Y,HE T Y,CHEN L Y,et al.ISSR analysis on the
cultivars of Rhododendron hybridum[J].Journal of Fujian
Agriculture and Forestry University:Natural Science Edition,
2011,40(3):271-275.(in Chinese)
[12] 周兰英.杜鹃属植物亲缘关系及遗传多样性研究[D].成都:
四川农业大学,2008.
[13] 刘雁飞.长白山牛皮杜鹃的遗传多样性与分子亲缘地理学研
究[D].长春:吉林大学,2013.
[14] 曾丽,赵梁军,孙佳,等.万寿菊属品种资源遗传关系的ISSR
分析[J].中国农业科学,2010,43(1):215-222.
ZENG L,ZHAO L J,SUN J,et al.Analysis of genetic relatedness
of genetic resources of tagetes as revealed by ISSR[J].Scientia
Agricultura Sinica,2010,43(1):215-222.(in Chinese)
[15] 张敏,黄苏珍.鸢尾属种质资源的ISSR分析[J].南京农业大
学学报,2008,31(4):43-48.
ZHANG M,HUANG S Z.Analysis of Iris L.germplasm
based on ISSR markers[J].Journal of Nanjing Agricultural
University,2008,31(4):43-48.(in Chinese)
[16] 石颜通,周波,张秀新,等.牡丹89个不同种源品种遗传多样
性和亲缘关系分析[J].园艺学报,2012,39(12):2499-2506.
SHI Y T,ZHOU B,ZHANG X X,et al.Assessment of genet-
ic diversity and relationship of 89tree peony cultivars from
different provenances[J].Acta Horticulturae Sinica,2012,39
(12):2499-2506.(in Chinese)
[17] 李敏,王尧峰,明凤.用ISSR分子标记技术分析16个蝴蝶兰
品种的亲缘关系研究[J].中国农业科技导报,2010,12(1):
60-65.
LI M,WANG Y F,MING F.Studies on genetic relationship
analysis of 16 Phalaenopsis hybrid cultivars by ISSR molecu-
lar marker technology[J].Journal of Agricultural Science and
Technology,2010,12(1):60-65.(in Chinese)
[18] 孔琼,袁盛勇,薛春丽,等.云南野生石斛ISSR-PCR分析[J].
西南农业学报,2015,28(3):1242-1245.
KONG Q,YUAN S Y,XUE C L,et al.ISSR-PCR analysis of
wild species of Dendrobiumin Yunnan[J].Southwest China
Journal of Agricultural Science,2015,28(3):1242-1245.(in
Chinese)
[19] 赵喜华.杜鹃属植物RAPD分类研究及nrDNA ITS区序列
分析研究[D].南昌:江西师范大学,2005.
[20] IQBAL M J,PADEN D W,RAYBURN A L,et al.Assess-
ment of genetic relationships among Rhododendron species,
varieties and hybrids by RAPD analysis[J].Scientia Horticul-
turae,1995,63(3/4):215-223.
[21] KOBAYASHI N,TAKEUCHI R,HANDA T,et al.Cultivar
identification of evergreen azalea with RAPD Method[J].
Journal of the Japanese Society for Horticultural Science,
1995,64(3):611-616.
[22] 汪琼,姚青菊,徐增莱,等.基于ISSR和RAPD标记的4个夏蜡
梅种群的遗传多样性研究[J].广西植物,2013,33(1):30-34.
WANG Q,YAO Q J,XU Z L,et al.Genetic diversity of four
populations of Calycanthus chinensis based on ISSR and
RAPD makers[J].Guihaia,2013,33(1):30-34.(in Chinese)
[23] 周泓.杜鹃花品种资源多样性研究及品种分类体系构建[D].
杭州:浙江大学,2012.
[24] 赵凯,王德元,张文娟,等.都支杜鹃遗传多样性的ISSR分析
[J].植物分类与资源学报,2013,35(5):578-584.
ZHAO K,WANG D Y,ZHANG W J,et al.Genetic diversity
of Rododendron shanii based on ISSR analysis[J].Plant Di-
versity and Resources,2013,35(5):578-584.(in Chinese)
[25] 彭婵,张新叶,杨彦伶,等.湖北麻城杜鹃古群落遗传多样性研
究[J].湖北林业科技,2010(4):26-30.
PENG C,ZHANG X Y,YANG Y L,et al.Study on the ge-
netic diversity of ancient community of Rhododendron simsii
Planch.from Macheng of Hubei[J].Hubei Forestry Science
and Technology,2010(4):26-30.(in Chinese)
[26] 陈春福.福建杜鹃花属若干种类的离体繁殖与保存及其ISSR
分析[D].福州:福建农林大学,2012.
[27] 张肖娟,孙振元.地锦属野生种及栽培品种的ISSR分析鉴定
[J].北京林业大学学报,2011,33(6):177-180.
ZHANG X J,SUN Z Y.ISSR analysis of Parthenocissus spp.
and cultivars[J].Journal of Beijing Forestry University,
2011,33(6):177-180.(in Chinese)
[28] 刘祖洞,乔守怡,吴燕华,等.遗传学[M].北京:高等教育出版
社,2013:53-57.
851 西北林学院学报 31卷