全 文 ：第 22卷 第 1期
2009年 3月　
聊城大学学报 (自然科学版 )
Journal of Liaocheng Univ ersi ty( Nat . Sci. )
Vol. 22 No. 1
　 Mar. 2009
利用 RAPD标记技术对刺槐属 (Robinia )
种间亲缘关系的分析①
柳晨意 1)　黄　勇 2)
( 1)聊城大学 农学院 ,山东 聊城 252059; 2)聊城大学 生命科学学院 ,山东 聊城 252059)
摘　要　用随机扩增多态性 DNA( RAPD)技术对刺槐属 ( Robinia )内 5种植物进行基因组 DNA多
态性分析 .共选用 22个 10 bp随机引物扩增出 212个 DNA片段 ,进行种间遗传关系分析 .片段大小
在 100～ 2 200 bp之间 ,其中多态性谱带为 183条 ,多态率为 86. 3% ;利用 U PGMA进行遗传距离
计算的结果表明 ,刺槐、毛刺槐和香花槐分属刺槐属的三个种 ,红花刺槐和龙槐是刺槐的变型 .首
次在 DN A水平上证明香花槐为刺槐属的一个独立种 ,且与毛刺槐的亲缘关系较近 .为刺槐属植物
亲缘关系和系统分类建立了新的分子学证据 .
关键词　 RAPD,刺槐属 (Robinia ) ,分类 ,亲缘关系
中图分类号　 Q949. 751. 9　　文献标识码　 A　　文章编号　 1672-6634( 2009) 01-0068-03
0　引言
刺槐原产北美洲 ,属豆科刺槐属植物 ,我国于 19世纪末从欧洲引入 .其后又相继引进了几种树形及花
色不同的刺槐属植物 ,以丰富园林绿化树种 .但在命名及分类地位的确定上仍较混乱 .
随机扩增多态性 ( random ampli fied po lymo rphic DN As, RAPD)技术作为一种快速确定基因差异的
分子标记方法 ,已广泛应用于群体遗传学 [1. 2 ] . Ngezahayo, Frederic等曾应用其研究过香花槐组培植株的
染色体变异 [3 ] ,而未有应用其进行种间亲缘关系的研究 .本实验分析了 5种刺槐属植物 ,以确定它们之间
的遗传差异和种间亲缘关系 ,为刺槐属植物系统分类学研究提供了分子生物学依据与参考 .
1　材料与方法
1. 1　试验材料
山东刺槐属 5种植物: ( 1)刺槐 ( Robinia pseudoacacia L . ) [4. 5 ]; ( 2) 曲枝刺槐 (龙槐 ) ( R. pseudoacacia
L. f . tortuosa ) ; ( 3)香花槐 ( Robinia×ambigua′Idahoensis′) ; 4.红花刺槐 ( R. pseudoacacia L. f. decaisneana
( Carr. )V oss. )
[6 ]
; ( 5)毛刺槐 ( R. hispida L. ) .以上材料除红花刺槐采自济南外 ,其余四种均采自山东聊
城市 .
1. 2　总 DNA提取与浓度的测定
参照范国强的 CT AB法 [7 ]提取总 DNA,并作适当改进 .用 1%
的琼脂糖凝胶对其进行电泳 ,经 EB(溴化乙锭 )染色后 ,在紫外检
测仪上观察其纯度并判别 DNA分子的大小及一致性 ,见图 1.
1. 3　引物筛选
参阅国内外有关研究文献 ,参照北京赛百盛 SBS公司的三个 图 1　 5种植物 DNA电泳图
① 收稿日期: 2008-10-15
通讯作者: 黄勇 , huangy@ lcu. edu. cn.
系列共 60个引物序列 ,每个引物
的长度是 10个核苷酸 .扩增刺槐
DNA样品 ,筛选出扩增性强、重
复性好、多态性高的 22个引物
(见表 1) ,用于全部刺槐属植物
DNA样品的扩增 .
1. 4　 PCR扩增及产物的鉴定
在 T1 Thermocycler扩增仪
(德国 Biometra公司生产 )上进
行 RAPD-PCR扩增 ,每 20μL反
应体系中含 50 ngDN A模板 ,引
物 ( 10mM ) 1. 6μL, dN T P
( 10mM ) 0. 5μL (上海生工产
品 ) , 10× Taq buf fer 2 μL,
TaqDN A聚合酶 ( 2. 5 U /μL) 0. 5
μL ( T IANGEN 产品 ) , ddH2O
13. 4μL.扩增程序为: 94℃加热
3 min,使模板 DNA变性 ,然后进
入下列温度循环: 94 ℃变性
45 s、 34℃退火 45 s、 72℃延伸
表 1　 22个随机引物序列
引物名称
Name of primers
序列 5′-3′
Sequences 5′-3′
扩增带数
No. of amplifi ed band
多态性数
No. of polymorphic band
A01 CAGGCCCT TC 9 6
A04 AATCGGGCTG 9 8
A07 GAAACGGGTG 12 12
A08 GT GACGTAGG 7 7
A13 CAGCACCCAC 8 6
A14 T CTG TGCTGG 10 8
A18 AGG TGACCGT 9 8
B10 CTGCTGGGAC 12 10
B11 GT AGACCCG T 12 12
B13 T TCCCCCGCT 12 12
B16 TT TGCCCGGA 8 7
B18 CCACAGCAGT 5 3
C01 T TCGAGCCAG 10 10
C06 GAACGGACTC 16 15
C07 GTCCCGACGA 8 7
C08 TGGACCGGTG 12 10
C09 CT CACCGTCC 13 11
C11 AAAGCTGCGG 11 8
C12 TGT CATCCCC 6 4
C16 CACACTCCAG 7 5
C18 TGAGTGGG TG 9 8
C20 ACT TCGCCAC 8 6
1 min,共计 40个循环 .循环结束后在 72℃延伸 5 min,以保证 DNA延伸彻底 . PCR扩增反应结束后 ,采用
1× TAE电泳缓冲液 ,在 1. 4%的琼脂糖凝胶中 (含 EB 0. 1μg· mL- 1 )电泳分离扩增产物 ,同时 ,在适当的
位置上加上一个已知分子量的 DNA标准样品 ( DL2000 Marker购自 TIAN GEN公司 ) ,电泳结束后在自
动凝胶成像系统 (美国 Alpha Inno tech公司生产 )下观察照相 .
1. 5　数据统计与分析
电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板 DNA互补的一对结合位点 ,可记为一个分子标记 ,根据
分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置 ,估计扩增产物的分子量大小 ,有带的记为 1,无带的记为 0,形
成 0, 1矩阵图输入计算机 .采用 N TSYSpc2. 10e软件分析了刺槐属的 RAPD扩增数据 ,得到种间的相似度
系数矩阵 ,根据 UPGMA方法构建聚类树状图 ,见图 3.
图 2　引物 C6、 C7、 C11的扩增产生的 RAPD图谱 ;　　　　图 3　基于 RAPD标记分析刺槐属
M , DN A标准分子量 DL2 000　　 　种间亲缘关系的聚类图
69　第 1期　　 　柳晨意等: 利用 RAPD标记技术对刺槐属 (Robinia)种间亲缘关系的分析　 　　
2　结果与分析
2. 1　 DNA多态性分析
从 60个随机引物中筛选出了 22个引物 ,对刺槐属种间 5个样本的 DNA进行扩增 ,共得到 212条 DNA
扩增带 ,最少的在引物 B18获得 5条带 ,最多的在引物 C6获得 16条带 ,平均每个引物产生 9. 6条带 ;其中
183条带表现为多态性 ,占总带数的 86. 3% ,各引物扩增带及多态性带数见表 1.数扩增片段长度为 100～
2 200 bp.结果显示 ,刺槐属植物表现了丰富的 DN A多态性 ,且分别在 15、 6、 11、 9、 23个位点显示出各自的
特征性标记 .如刺槐在 C6 390 bp,龙槐在 C7 340 bp,香花槐在 C6 680 bp,红花刺槐在 C6 500 bp,毛刺槐在
C11 530 bp均得到了自身特征性标记 ,见图 2.
2. 2　刺槐属遗传变异的分析
根据图 3,在 0. 58的相似度系数上 5种刺槐属植物分为三个类群 ,刺槐、龙槐、红花刺槐为一类 ,香花
槐、毛刺槐各一类 .
3　讨论
应用 RAPD标记技术对刺槐、毛刺槐亲缘关系的分析结果与传统的形态分类结果一致 ,证明了 RAPD
种间分析的可靠性 .红花刺槐和龙槐与刺槐型态差别较小 ,分别只在花色和树形上发生了一定的变异 ,
RAPD指纹图谱中相似度较高聚为一类 ,说明三者属同一个种 ,红花刺槐和龙槐是刺槐的变型 .香花槐原
产西班牙 ,花紫红色 ,花型较大 ,小花数较少 ,托叶刺长 2～ 3 mm ,枝无硬刚毛 ,与刺槐、毛刺槐的差异均较
大 .本试验的 RAPD指纹图谱中 ,香花槐呈现出多处特征性标记 ,并单独聚为一类 ,明显地与其它种区分
开来 ,在 DNA水平上的分子证据显示了香花槐为刺槐属的一个独立种 .
有资料显示香花槐可能是开白花的刺槐和开红花的毛刺槐的杂交种 [8 ] ,较好地结合了刺槐的乔木性
状和毛刺槐的红花特性 ,但也有人认为它是刺槐与粘刺槐 (Robinia viscosa )的杂交种 .经过大量形态学特
征观察 ,结合分子生物学研究 ,认为香花槐与毛刺槐相似度较高 ,亲缘关系更近 ,支持香花槐是刺槐和毛刺
槐的杂交种的意见 .
由于香花槐和红花刺槐花色相似 ,异物同名、同物异名现象较严重 ,国内对此研究较少 ,没见到将二者
明确区分的文献资料 ,以至在国内文献引用及苗木市场上 ,常将红花刺槐与香花槐混淆 ,造成不必要的麻
烦 .本文明确了二者在分子水平上的差异 ,澄清了二者的拉丁学名 ,提供了系统分类的证据 ,为今后的研究
及园林应用提供了可靠的依据 .
参 考 文 献
[1 ]　 Lynch M , Mil ligan B G. Analysis of population geneticst ructu re wi th RAPD markers [ J]. Mol Ecol , 1994, 3: 91～ 99.
[2 ]　 Wolfe A, Liston A. Cont ributions of PCR-based m ethods to plant sys tematics and evolu tionary biolog y [M ] . In: Sol tis D E, Sol tis P S.
& Doyle J J ( eds ) M olecular Sys tematics of Plants II. Kluw er Academic Publish ers , Bos ton, Dord rech t, Lond on, 1998.
[ 3 ]　 Ngezahayo Frederic, Guo Wan-li, Gong Lei , et al. Genomic Variat ion in Microp ropagated Robinia ambig ua′idahoensis′Revealed by
RAPD Markers [ J] . Hor tScience, 2006, 41( 6): 1 466～ 1 468.
[4 ]　山东树木志编写组 ,山东树木志 [M ] .济南:山东科学技术出版社 , 1984.
[5 ]　陈汉斌 ,郑亦津 ,李法曾 .山东植物志 (下卷 ) [M ] .青岛:青岛出版社 , 1997.
[6 ]　范国强 ,李　锋 ,赵振利 ,等 .悬铃木叶片 DNA提取方法研究 [ J ].河南农业大学学报 , 2004, 38( 1): 68～ 72.
[7 ]　郑万钧 .中国树木志 (第 2卷 ) [M ] .北京:林业出版社 , 1985.
[8 ]　 Guo Wan-li , Li Yi-dan, Gong Lei, et al. Ef ficient micropropagation of Robin ia ambig ua v ar. idahoensis ( Idaho Locus t) and detection of
genomic variation b y IS SR markers [ J] . Plant Cell , Tis su e and Organ Culture, 2006, 84: 343～ 351.
(下转第 74页 )
70 　 　聊 城 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　 　第 22卷　
On Agriculture Environment of Sand Chamber Section in
Yellow River Irrigation Area
LI Qing-chao
( School of Envi rom ent and Planning , Liaoch eng Univ ersi ty, Liaoch eng 252059, China)
Abstract　 Acco rding to envi ronment status of sand chamber section in Yellow River i rrig ation area,
to table a propo sal of envi ronment t rea tment. In general, sediment div ersion result s in a lot of problems
( such as increase o f sandy w asteland ) , w hich w ould influence on the development of the ir rig ation
system. The measures of the comprehensiv e harness in the head area of the i rrigation system w ere
analy zed in this paper, w hich included w arping , improvement of the sandy w asteland and the
development of the economic fo rest.
Key words　 Yellow River i rrig ation area, sand chamber section, envi ronment , t rea tment
　　 (上接第 53页 )
Study on the Interaction between Ceftriaxone and DNA
by Molecular Spectroscopy
ZHANG Ai-mei
1)　 JIA Li-ping2)　 HUANG Peng1)
( 1) School of Ch emis t ry and Chemical Engineering, Liaocheng Universi ty, Liaoch eng 252059, China;
　 2) Sch ool of Materials Science and Engineering, Liaoch eng Universi ty, Liaoch eng 252059, China)
Abstract　 The interactions of cef triaxone ( CTRX) and ct-DN A have been studied by f luorescence
spect ro scopy using ethidium bromide ( EB) as a f luorescence probe in Tris-HCl buffer solution ( pH
7. 4 ) . The mechanism o f the interactions betw een CTRX and ct-DN A was also investiga ted by
f luorescence spectrum, absorption spectrum , scatchard equation, circula r dichroism spectrum, hea t
denatura tion etc. The experimental resul ts show ed that the interaction belong s to mixed model, the
intercalation and g roove binding a re the tw o major modes in this system. The average binding constants
w ere determined as 6. 3× 104 L· mo l- 1 a t 25℃ .
Key words　 fluo resce spect rum , ul trav ile absorption spectrum , ci rcular dich roism spect rum , DN A,
ceft riaxone, ethidium bromide
　　 (上接第 70页 )
Analysis of Genetic Relationship of Robinia
among Species Using RAPD Marker
LIU Chen-yi
1)　 HUANG Yong2)
( 1) Ag ricul tural School , Liaoch eng Univ ersi ty, Liaoch eng 252059, China;
　 2) School of Life Science, Liaoch eng Univ ersi ty, Liaoch eng 252059, China)
Abstract　 Random Amplified Polymorphic DN As tech nique was used to carry on the genome DNA
polymo rphism analy sis among 5 kind o f Robinia species. 212 loci in total w ere amplified by using 22
random primers ca rring on the inter-species g enetic af fini ty analy sis ranging f rom 100 to 2 200bp w ere
amplified, include 183 po lymo rphic bands for 86. 3% . Acco rding to g enetic distance cacula tion by
U PGM A. The resul t show s that the black locust , the w oo l locust and idaho locust belong to three species
o f the Robinia , the saf flow er locust and dragon locust are black locust s v ariant. Proves that the idaho
lo cust are Robinia independent kind in the DN A level for the fi rst time, and the w oo l locust tree s g enetic
af fini ty is near. Have established the new molecula r evidence for the Robinia plant sibship and the sy stem
classi fica tion.
Key words　 RAPD, Robinia, tax onomy , g enetic rela tionship
74 　 　聊 城 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )　 　第 22卷