全 文 ：广州中 医学院学报1 993年第 10 卷第 3期 14 3
俨任吐昌. 跪易. 口回 . . 暇甩圃药理研究 晋` ~ ~ ~二 J红豆杉属植物组织和细胞培养研究
中药化学教研室 陈 佃
提要 : 本文报导在美国从普度 大学校园的红豆衫属 ( Ta x’ u s) 植物 的嫩针叶和嫩 茎枝诱导 出庞伤组织
( Ca l tu s) 和建立 悬 浮细胞培养 . 魔伤组 织和 细胞培养最好的培养基是B ` l和 M S 一 T, 在培养基中补 加
还原试 剂和 酚类结合的化合物可抑制愈 伤组织 变黑 , 细胞培养色变深 以及接着产生生长减退的现 象 , 为 紫
衫醉 ( T a x ol ) 及其类 似物 的生物 合成提供重要的物质基础 .
主题词 : 杭种瘤药 , 植物性 @ 红豆衫属 @ 紫衫醉 /生物合成 @ 葱伤组 织
@ 悬浮细胞培养
紫杉醇 ( T a x ol ) 是 一种新的抗癌 药 ,
它是由美国国立癌症研究院首先开发的 , 目
前已经被美国食品和药物 管 理 局 ( F D A )
批准作 为治疗卵巢癌的新药 〔’ 〕 。
紫杉醇 ( T a x OI ) 目前是从太平洋紫 杉
植物树皮中分离提取出来的一种 带 紫 杉 烷
( T a x a n e ) 环的 ,不同于已知现有抗癌药的
化学结构的化合物 , 它的结构特点是具有一
个四元环紫杉烷和在 C : : 位上连有 N一苯酞
基一刀一苯基异丝氨酸侧链 ( 图 1 ) 。 实验证
明 : 紫杉醇 ( T a x ol ) 对体外培养多种 癌细
胞均有明显的抑制生长作用 ; 进一步评价证
明 : T a x 0 1是很有希望成为抗肿瘤特性的抗
g K B 细胞和白血病细胞的药物 。 因此在 1 9 7 7
年 aT x ol 被推为候选药物供临床试用 〔` ] , 然
而 aT x ol 因在太平洋紫杉树皮中含量很低而
被限制使用 , 致使临床试用推迟好几年 , 一
直到 1 9 7 9年 T a x ol 具有独特的抗癌作 用 机
理被发现之后 , 才重新对 T a x ol 研 究 感 兴
趣 。 它的作用机理是对微管蛋白有促进聚合
作用 , 它是唯一的促进微管聚合 , 抑制微管
蛋白解聚的植物药 。 美国 、 加拿大等世界各
国正在加紧研究 。 第一期临床试验结果证 明
对进行性卵巢癌 、 移位的乳腺癌有很好的治
疗效果 , 目前第二期 、 第三期临床试验正在
美 、 欧进行 。 但由于红豆杉属植物是 生长很
慢的裸子植物 , 紫杉醇在植物树皮中含量很
低 ( < 0 . 01 肠千重 ) , 一方面紫杉醇及其类
似物也都有存在于植物 的其他部位如细枝 、
针叶 、 树枝 、 木材 、 根部和实生苗等 , 这 些
收 稿 日期 : 1 9 9 3年 9 月 2 5 日 .
都能作为紫杉醇及其类似物可采用的自然资
源 `” 一 ’ “ ’ , 另一方面紫杉醇虽然半合成方法 已
完成 , 但全合成还未完成 , 体外细胞培养方
法产生紫杉醇也 已有研究 , 但仅有少量有关
红豆杉属的个别品种的组织和细 胞 培 养 的
报导 。
本文是用普度大学咬园里的红豆 杉属植
物的嫩针叶及嫩茎枝在全合成培养基上已诱
导出赢伤组织 , 继而建立悬浮细胞培养 , 并
提供固定的细胞培养方法 , 取得 了阶段性成
果 , 为进一步刺激和诱导细胞产生二次代谢
产物 ( 紫杉醇及其类似物 ) 打下 重 要 的 基
础 ,初步试验表明 , 加入一定的诱导剂之后 ,
细胞培养能生物 合成相当含量的紫杉醇及其
类似物 。
材 料 和 方 法
植物材料采用普度大学校园里 18 种红豆
杉属植物的外植体 , 做为实验材料 ,主要是嫩
针叶和嫩茎枝 , 先经过 70 肠乙醇表面消毒 ,
图 l 紫杉醇的结构式
DOI : 10. 13359 /j . cnki . gzxbtcm. 1993. 03. 008
然后用 l 肠次氯酸钠消毒 , 以后用消毒 过 的
重蒸水冲洗干净 , 切去外植体的两头 , 平放
在已消毒好的塑料培养皿的培养基上 , 所有
的操作均在通风柜里进行 , 然后放在有光的
培养室里 29 ℃下培养 , l ~ 2周后 , 生长出愿
伤组织即转移到新的培养基上而 转 入 暗 房
6 ℃下培养 , 经过 3~ 4周后 , 应将痣伤组织
转入新的培养基上继续培养 。
悬浮细胞培养建立在针叶和茎枝诱导出
的瘪伤组织上 , 以它为接种体 , 其重量是以
放在三角烧瓶中液体培养基的 1/ 3 ( W /V ) ,
保持在 1 10 印m 旋转摇床上 , 并于黑暗中2 6 ℃
条件下培养 , 细胞从愿伤组织上放人液体培
养基中 , 再繁殖生长 7 到 10 天后 , 必须转移
到新培养基中 , 并把针叶 、 茎枝残渣弃除 。
培养基及培养条件 : 开始时 , 把消毒好
的嫩针叶及嫩茎枝的外植体都放在不同浓度
生长激素的 G a m b or g B 。 和 M 3 培养基 上
培养 , 如表 l 。 试验结果表明 : 最好的培养基
是 B 。一 互和 M S一 T , 它们都含有蔗糖 3 . 0肠
(W / V )
, 脂琼 0 . 8一 0 . 9肠 (W /V ) , 2 . 4一 D
Zm g / L 和蔡乙酸 ( N A A ) l m g / L , 在 B 。一
l 和 M S一 T 培养基中加入一些还原剂 , 使
外植体产生和释放出酚类氧化作用减少到最
少的程度 , 所有的试验均使用塑料 已经消毒
的培养皿并用透明胶 纸 封 口 , 培 养 14 到 30
天 , 常规是两个月之内转移到新培养基内 ,
放在 29 ℃暗房里 , 培养基配制均用重蒸水 ,并
用 5 0 01 / L N a O H和 l m ol / L H C I调至 I迁1 5 . 7
一 6 . 0 ,后消毒灭菌于 1 . 工k g / e m Z i 2 1 oC , 2 0
分钟 , 每个处理用 20 一 30 个外 植体分配到两
个培养皿中 , 每个品种 5 ~ 10 个培养皿 , 一
般培养 2 8天后就将葱伤组织转入液液培养 ,
2 个月后癫伤组织也可收获并提取紫杉醇及
其紫杉烷类化合物供 H P L C 分析 。
细胞培养是将瘪伤组织经过 l ~ 2个月固
体培养后 , 就将癫伤组织转人悬浮细胞培养 ,
细胞培养装在有 5 0 m l 和 i o o m l 或 3 0 0m l 液
体培养基于 2 5 o m l 和 5 0 0m l 或 i 0 0 0m l 三角
烧瓶中 , 保持于 1 1 0印m 摇床上 , 26 ℃暗房
中进行培养 。
每个品种的细胞培养已迸行了诱导试验
和提取分离二次代谢产物并 H P L C 分析 , 此
将另文叙述之 。
给 果
从红豆杉属植物的外植体嫩针叶和嫩茎
枝所产生的癫伤组织 , 生长最好的培养基是
民一 l 和 M S一 T 。 凉伤组织开始生长在 切割
嫩针叶和茎枝的两头 , 以后惫伤组织长满了
整个外植体。 第一周培养在光照的条件下培
养 , 产生的癫伤组织是淡绿色 , 松散的 ; 约
1一 2周后转移到暗房下培养 , 癫伤组织是淡
附表 红豆杉属施伤组织培养基种类的筛迭
激素的浓度 ( m g /L )培 养基种类 生长情 况
2
,
4 一 D 蔡 乙酸 激动素
B
S一 I
B S一 I
B 。一 l
B 。一 U
B S一 V
B S一班
M S一K
M S一 T
M S一U
M S一V
M S一W
2
1 0
2
十
十 + 十
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十 + +
+ +
+ +
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广 州中医学院学报 1993年第10 卷第 3 期
黄色 、 松散的 。 喻伤组织从外植体诱发币长
最快是在开始培养3一4周里 , 并稳定于很慢
的生长率 , 如果不再次转移到新培养基中培
养 , 疮伤组织在 2 个月后变黑 , 甚至死亡 。
所以 , 至少每 15 ~ 30 天需要转移 , 进行再培
养 。 实际上红豆杉植物各种外植体除 了生长
缓慢外 , 还常见到组织培养时间长 些 会 变
黑 。 这过程可能是 由外植体产生酚类化合物
及其氧化作用的结果 , 常见再次培养出现生
长减退的现象 , 但又不能消除它 , 经过多次
试验对疮伤组织变黑的残存部分转移到加入
抗氧化和与酚类结合化合物的培养基中 , 变
黑 的现象得到改善。
建立了悬浮细胞培养 , 愈伤组织在固体
培养 l 一 2 周后就转移到液体培养基中进行
悬浮细胞培养 , 已建立的悬浮细胞培养的有
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一 O一 , T b九v . (认弓侧如沁 h .
一 一三 ` 一 2 50 1
2 8 0 1
, 2 8 0 2
,
T
.
b r e v i fo l i a ( u p j o h n )
,
17 6
,
17 3
,
16 7和 T . b er v . 等均在 B 。一 l 培
养基生长良好 , 虽然生长率相当慢 , 特别是
T
.
b r e v
. 细胞 , 在 B 。一 l 生长比在 M S一 T培
养基快 , 但容易变棕红 , 加人 各 种 还原试
剂 , 可提供保持细胞不变棕色现象的条件 ,
已试验的还原剂包括 D T T ( D it ih ot 址 ie t ol ) ,
G S H ( G I毗 at h i o n e ) , 维生素 C ( A s e o r b i e
ac i d ) 和维生素 E 等 , 愈伤组织和细胞培养
均得到改善 。 结果发现 B 。一 l 再加上还原剂
对大多数细胞株生长 良好 ( 见图 2和图 3 ) 。
T
.
b r e v
.
( u P jo h几 ) , 2 8 0 1 , T . b r e v .
1 67 等 已完成了一些诱导试验 ( E il cl t缸沁 n
e x P e r im e n t )
, 加入 的诱导剂 ( E l i e i t o r )
如V . D一 2 7 7 (V e r t i e i l l i a m d a h l i a e 2 7 7 ) ,
M e th y l一 j as m o n a 七e ( M e 一 ja ) 以及其他真
菌提取物等 , 有关二次代谢产物的诱导方面逮在进一步培养研究中 , 后将另文报导 。
( 作者 住 美 国普度大学药学院 药化和生
药学留学期间得到 P et e1’ H ie n st ie n 教 授的
指导 , 片寺此致谢 。 )
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图 2 红豆杉属细胞培养生长曲线
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三二牛己 {己丰如口李典井夯止二竺 4 6 b 1 0 1艺 1 4 1七 J S 己O
培养天数
图3 T . b r e v i f o l i a 细胞培养天数
参 考 文 献
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2 7 7D
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18 69~ 18 7 1
〔16〕G . F e t 一 N e ot
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15 7 2 ~ 157 5
1 98 2 , 60
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e l l C u l t u r e o f T ax u
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D e Par t m e nt o f P hy t
o c h e而 st r y
A b s t r a e t
执 t h i s P ap e r , t h e e a l l u s w a s in d u e e d b y y o u n g n e e d l e s a n d y o u gn s t e m s
o f T a x u s at P u r d u e U川 v e r s i t y C a m P u s . A n d t h e e e l l S u sP眺 i o n e u lt u r e
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S一 l 即d M S一 T m e d i u rL n . T h e e u l t u r e m e d l u m w as
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a g e爪 5 an d P h e on l i-c b in d i gn e o m P 0 u n ds t o i n h ib i t
e a l l u s d a r k e n i n g a n d s u b s eg
u e n t g r o w t h
r e d u e t i o n
.
T h e s e r e s u l t s P r vo i de d an
im P o r t a n t b a s i s fo r t h e b i o s y n t h e s i s o f T a x o l a n d r e lat e d T a x a n e
.
K e y w o r d :s A入皿 N E O P L乃 S T IC A G E到丁 S , P H Y 丁C G E N了C
@ T A X U S
@ T A X O L/ ib 淡 y .n
@ C A L L U S
@ S U S P E N S IO N C E L L C U L T U R E
( 上接 1 3 4页 )
A S tud y
o n I n t e l l i g e n e e S t a t u s o f M i n im a l
B r a加 D y s f u n e t i o n C h i l d r e n
A b s t r a e t
I n t h i s P aP e
r , t h e 迈 t e l l ig e且 e e s t at u s o f rn i n i m a l b r a i n 即 s fu n e七i o n (M B D )
e h i l dr e n w e
r e s加 dj e d . T h e in t e l l ig e n e e w e r e d e t e r m in e d i n 1 12 M B D C h i l dr en
b y w e e h s l e
r i n et l l ig en
e e s e a le fo r e h i l dr e -n R ve i s e d (W I S C
一 R )
.
T h e 此 s u l七
s h o w e d th舫 ( 1) T h e i n t e l l ig e n e e o f M B D C h i l dr e n 15 l o w e r t h an t h缸 o f
h e a lt h y e h U dl e n
.
P a r : o f t l: e m ( 6
.
2 5肠 ) a er l卿 er t h a n th e Iow e s t Ii m认 o f
n o r m a l v a lu e ( IQ
= 7 0 )
.
(2 ) In 七e l l ig e n e e de f e e七 o f M B D e h l d r e n a fe e t
s m a i n ly
t h e g e en
r a l e a P a b i l i t y w h i e h 1
5 e l o s e ly r e l a t e d 七。 七h e e du e就 lon a l e f fe e七. T h i s
e aP ab i l i t y 1
5 m e a s u r e d o b j e e t iv e l y b y t h e s P e e
e h s e a l e o f 、姐 S C 一 R . T h e I Q o f
s P e e e h s e al e
e a n b e u s e d as a d lag n o s七i e e r i t e r i o n o f M B D
.
T ak in g 8 8
a s t h e
id a g on
s it e s t a n d a r d o f t h at IQ
, 七h e m i s s e 小 id a g on s i s r歌 e 15 0
.
2 0 , t h e m i s
-
d i a g n os i s r at e 0
.
1 9 an d t h
e d i ag n o s七i e e任 i c ie n e y 0
.
8 0
.
( 3 ) T h e IQ o f M B D
e h i ld r e n d o e s n o t in e r e as e w it h t h e a g e
, s h o w in g t h a t M B D e a n
o 七 b e e u r e d
s P on t an
e o u s l y w h en t h
e i r a g e s in e r e a s e
.
K e y w o r d匆 B R IA N D Y S F U N C IT O N , M NI 工M A L
工N T E L L IG E N C E
C H IL D