全 文 ：果 树 学 报 2008,25(3):396～399
JournalofFruitScience
叶绿体DNA分析技术及其在栗属植物中的应用
曹庆芹 1,甄 贞 2,姜 洁 1,刘玉芬 1,冯永庆 2,秦 岭 2*
(1北京农学院生物技术系,2北京农学院植物科学技术系,北京 102206)
摘 要:被子植物叶绿体DNA母性遗传,有独立的进化路线,基于叶绿体 DNA的分析技术在分子系统学、资源多样
性评价、杂种鉴定等方面具有重要作用。栗属植物资源丰富,分布广泛。概述了叶绿体DNA分析技术在栗属植物中
的研究进展,阐述了包括 PCR-RFLP、DNA杂交、叶绿体 SSR标记技术和叶绿体基因区段测序分析技术在内的分子
标记技术的原理、特点及其在栗属植物中的应用。并对今后如何开发叶绿体 DNA标记用于栗属植物的研究进行了
展望。
关键词:栗属植物;分子标记;叶绿体SSR标记;PCR-RFLP标记;叶绿体基因区段测序分析技术
中图分类号:S664.2 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)03-396-04
ChloroplastDNAanalysistechnologyanditsapplicationinCastanea
CAOQing-qin1,ZHENZhen2,JIANGJie1,LIUYu-fen1,FENGYong-qing2,QINLing2*
(1DepartmentofBiotechnology,2DepartmentofPlantScienceandTechnology,BeijingAgriculturalColege,Beijing102206China)
Abstract:ChloroplastDNAistransmitedthroughmotherparentandholdindependentevolutionway.Analysistechniques
basedonthechloroplastDNAareimportanceformolecularphylogeny,evaluationofresourcegeneticdiversity,hybrididen-
tificationandsoon.Castaneaplantsareofhighgeneticdiversityandwidedistribution.Thetheory,featureandapplicationof
severalchloroplastDNAanalysistechniquesincludingPCR-RFLP,DNAhybridization,chloroplastSSRtechnologyand
chloroplastgenesequencinganalysisingenusCastaneaaresummarizedinthisarticle.HowtodevelopchloroplastDNA
markerssuitableforCastaneaplantsarealsodiscussed.
Keywords:CastaneaL.;Molecularmarker;ChloroplastSSR;PCR-RFLP;Chloroplastgenesequencinganalysis
收稿日期:2007-06-06 接受日期:2008-02-29
基金项目:北京市优秀人才项目(20042D0502101);北京市教委项目(KM200810020007);北京市属市管高校人才强教计划项目
作者简介:曹庆芹,女,博士,讲师。Tel:010-80799294,E-mail:caoqingqin@sina.com.cn
>通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:010-80799126,E-mail:qinlingbac@126.com
壳斗科栗属[Castanea(Tourn.)L.]植物广泛分布
于欧洲、亚洲及北美大陆的温带区域,是世界上重要
的果树作物之一。栗属植物种类和类型繁多,John-
son[1]把栗属划分为 7个种:板栗(C.molissimaBl.)、
茅栗(C.seguiniDode.)、锥栗[C.henryi(Skan)Re-
hder&Wilson]、日本栗(C.crenataSieb.&Zucc.)、欧
洲栗 (C.sativaMil.)、美洲栗 [C.dentate(Marsh.)
Brokh]、榛果栗(C.pumilaMil.)。分布在亚洲的有4
个种,即日本和朝鲜半岛的日本栗以及我国的特有
种—板栗、茅栗和锥栗。我国是栗属植物遗传多样性
中心,而中国板栗是栗属资源的原生种[2-3],分布地域
广,对栗疫病具有极强的抗性。欧洲栗仅分布于欧
洲,东土耳其为其次生起源和遗传多样性中心[4]。美
洲栗和榛果栗分布于北美洲。近年来,随着分子标记
技术的迅速发展和广泛应用,利用叶绿体DNA分析
技术研究栗属资源取得了重要进展。作者介绍了叶
绿体基因组的结构特点、几种叶绿体DNA标记技术
的原理及其在栗属植物中的应用进展,为进一步保
护和持续利用栗属植物资源提供借鉴。
1 叶绿体基因组序列的特点
叶绿体 DNA(chloroplastDNA,cpDNA)是 1962
年在藻类中发现的,大多数植物的cpDNA为闭环双
链DNA,原核生物型,大小为120~220kb。含有2个
长约22~25kb的反向重复序列 (Invertedrepeatse-
quence,IR)、大单拷贝区(Largesingle-copyregion,
LSC)和小单拷贝区(Smalsingle-copyregion,SSC)。
近年来许多植物分子系统学和遗传分析研究都基于
对cpDNA的比较分析,是因为叶绿体基因组序列有
如下的特点和优点:第一,cpDNA分子量小,多拷贝
和结构简单,有利于对叶绿体基因组进行分析。第
二,与含有较多重复序列的核基因组和频繁发生重
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.03.021
排事件的线粒体基因组不同,叶绿体基因相当保守,
突变类型主要表现为点突变、碱基插入或缺失,进化
速率平均每年每个位点约为0.2~1.0×10-9,仅为核基
因的1/3[5-6]。叶绿体非编码区DNA进化速率普遍高
于编码区序列,可分别适用于不同分类水平的系统
演化。第三,cpDNA单性遗传,有独立的进化路线,
不依赖于其它任何数据即可构建分子系统树,可为
从历史和系统发育的角度解释生物多样性提供可靠
和准确的信息。
2 cpDNA的PCR-RFLP分析技术
在细胞质基因组分析中,基于 PCR的 RFLP分
析方法比RFLP技术揭示的多态性更丰富,结论更
可靠[7]。因此,cpDNA的PCR-RFLP分析已成为目前
叶绿体DNA系统学研究中使用最为广泛的技术,也
是遗传多样性研究、物种鉴别、杂种鉴定等研究领域
的有力工具[8]。PCR-RFLP主要用于碱基变异分析与
比较,首先利用叶绿体保守引物扩增特异区段,然后
利用某种限制性内切酶酶切处理。单碱基突变或序
列重排的发生,可使某种限制性内切酶酶切位点增
加,减少或消失,导致限制性酶切片段长度发生改
变,产生了限制性片段长度多态性。
PCR-RFLP分析中,最关键的是叶绿体引物的
开发和选择,现已有大批叶绿体 PCR引物相继报
道[9-11],其中部分引物跨物种使用成功,从而发展成
为通用引物(universalprimer),通用引物的使用对于
研究遗传背景不清的叶绿体 DNA提供了极大的便
利。
在山毛榉科植物中,Magni等[12]对Quercusrubra
的 cpDNA的多样性进行 PCR-RFLP分析,并同其
它山毛榉科植物进行比较,结果表明,3个拥有共
同生活史的品种间存在很大差异。Vetori等[13]对意
大利山毛榉 (Fagussylvatica)居群的 cpDNA进行
PCR-RFLP分析,结果表明,在山毛榉 cpDNA中有
一个显著突变标记,可用于对意大利的山毛榉自然
群体进行细分,并且研究证明意大利南部的山毛榉
群体变异度最高。在栗属植物中,Fineschi等[14]对38
个欧洲栗居群进行了叶绿体的 PCR-RFLP分析,检
测到11种类型的叶绿体单倍型(haplotype),而且证
明cpDNA的遗传多样性与地区性关系并不密切,这
些欧洲栗居群呈现出的种内多态性可能是受到几千
年来人类活动的影响产生的。
3 DNA杂交技术
叶绿体DNA杂交技术是指利用限制性内切酶
消化总DNA,凝胶电泳后分离的DNA片段转移到
尼龙膜上,利用同位素或生物素标记探针(异源的或
同源的叶绿体基因片段)进行杂交,最后比较杂交谱
带的差异,可以利用这一技术研究植物类群间的亲
缘关系、遗传多样性、分类和系统进化。它依据的原
理是不同来源的基因片段部分同源,通过变性解链
后互补的DNA重新复性,成为异源双链的过程。在
这一标记技术中为了取得比较理想的实验结果,往
往使用同位素标记探针,而且需要提取大量的总
DNA,实验周期长;再者由于叶绿体基因高度保守,
不易发生基因重排等原因,利用大的同源片段杂交
在较低的分类学层次上很难检测到变异类型,因此
限制了这一技术在栗属植物中的应用。迄今还未发
现利用异源的叶绿体探针研究栗属资源的报道。
4 cpSSR技术
叶绿体SSR (ChloroplastSimpleSequenceRe-
peat,cpSSR)标记是近年来新发展起来的一种分子
标记,最先由Powel等[15]提出,并在松树中筛选出了
第1批cpSSR引物。CpSSR的原理与核基因组SSR
相同,都是以简单重复序列作模体,根据模体两端的
保守序列设计引物进行扩增,因简单序列的重复数
的不同而表现出多态性。叶绿体基因组中的微卫星
序列可以作为一种通用标记来估计植物种群的遗传
结构、遗传资源多样性以及研究质体的遗传方式。由
于cpSSR标记技术同时具有 SSR标记的优点又兼
顾叶绿体基因组的特点,操作简便,多态性揭示能力
强,安全可靠等而被广泛应用。
cpSSR标记技术近几年发展很快,已开发出多
套适用于双子叶植物和单子叶植物的 cpSSR引
物[16-18],并用于柑橘[19]、水稻[20]、猕猴桃[18,21]、李[22]、梨[23]
和欧洲冷杉[24]、橡树[25]等木本植物和大田作物的相关
研究中,发现种内水平存在较多变异,居群内最大可
以达到122个单倍型[24]。但来自cpSSR序列间以及
侧翼序列的遗传信息非常有限,仅在水稻中有所报
道[20]。叶绿体通用引物应用范围相对狭窄,仅局限在
单子叶植物或双子叶植物内,在筛选合适的叶绿体
通用引物时需要考虑引物的来源。
Sebastiani等[26]报道了一批山毛榉科叶绿体SSR
引物,证明了山毛榉科植物的3个主要种(Castanea
sativa,Fagussylvatica和Quercuspetraea)的叶绿体
DNA中存在单一和二核苷酸的微卫星序列,并在种
内水平上发现了叶绿体微卫星位点的变异,一些自
3期 曹庆芹等:叶绿体DNA分析技术及其在栗属植物中的应用 397
果 树 学 报 25卷
然居群内存在2或3个变异类型。甄贞等[27]对栗属
植物 cpSSR标记体系进行了优化,从拟南芥、烟草
等双子叶植物中筛选出具有多态性的叶绿体 SSR
引物,用于研究栗属植物资源遗传多样性,结果发现
板栗资源种内变异水平较高。
5 cpDNA基因区段测序分析技术
目前,一些叶绿体基因编码区或基因间隔区的
顺序分析常用于不同分类水平的系统重建工作。叶
绿体基因的编码区和非编码区序列进化速率相差较
大,适于不同分类阶段的系统发育研究[28]。编码区的
核苷酸与基因功能直接相关,自然选择压力较大,因
而碱基替代速率相对较低,适用于科目等较高阶元。
cpDNA非编码区(包括内含子和基因间区)在功能
上的限制较少,与编码区相比,非编码区进化速率更
快,积累了更多点突变或插入/缺失突变,提供更多
的信息位点[6,29]。目前,rbcL、matK等cpDNA基因广
泛应用于不同科目的系统发育研究中,而 trnD-T,
trnT-L,trnL-F等非编码区常应用于种属间或种内
等较低分类阶元的系统学研究。
叶绿体基因区段的测序分析技术在山毛榉科
植物中应用广泛[30],在栗属植物中也有一定的研究。
Kamiya等[31]对TrigonobalanusverticilatacpDNA的2
个编码区序列(rbcL和 MatK)和 3个非编码区序列
(atpB-rbcLspacer,trnLintron和 trnL-trnFspacer)
进行分析,结果表明,Trigonobalanusverticilata与栗
属植物的亲缘关系最近,应该是一种远古的栗属植
物。在栗属植物中,Frascaria等[32]对欧洲栗 cpDNA
编码区的 rbcL基因进行研究,rbcL基因编码 1,5-
二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基,位于植物
cpDNA的大单拷贝区,长约1400bp。结果表明,山
毛榉科家族 rbcL基因的进化速率比其它被子植物
要低很多,这样进化较慢的cpDNA序列常被广泛应
用于较远类群的系统学研究。编码转运RNA的trnL
基因位于 cpDNA的大单拷贝区,长约 390～615bp
的内含子将trnL基因分隔为两部分,与trnL基因间
隔(长160～440bp)不远处为trnF基因。这2个非编
码区序列能提供更多的信息位点,因此常被结合在
一起测序分析。trnT和 trnL基因相邻,基因间区
600～1400bp,这一间隔区在cpDNA中属于分子进
化速率较快的非编码区序列,常用于低分类水平上
的研究。Lang等[33]对栗属植物叶绿体的trnT-L-F进
行测序分析,结果表明非编码序列区域富含AT,日
本栗是栗属植物最基本的分化枝,中国的3个种作
为一个单元分枝,美洲栗与欧洲栗各为一个分枝,但
两者差异不大;基于叶绿体DNA的系统学分析也表
现出与形态特征不一致的地方。
6 展 望
在以上介绍的 4种叶绿体 DNA分析技术中,
cpSSR技术由于操作简便、易于检测分析、成本低廉
等优点,较其它3种叶绿体技术方法有着更为明显
的优势,应用前景广阔。筛选有多态性的引物位点是
叶绿体SSR技术最核心的环节,可通过2种主要的
途径获取叶绿体SSR引物。首先,可以根据已知的
叶绿体基因组序列利用软件寻找微卫星位点设计新
的SSR引物[34],并进行进一步的筛选工作。其次,可
以借鉴已公开发表的叶绿体微卫星引物。
目前关于栗属植物叶绿体基因组的研究取得了
一些进展,但鉴于使用材料有限,基因分析位点单
一,对于反映栗属植物系统演化和资源评价的真实
情况所揭示出的信息位点还不够充分,进一步研究
栗属植物的演化和遗传多样性水平还需要提供更为
广泛、详尽的胞质DNA的证据。值得注意的是,只有
将叶绿体 DNA分子标记所揭示的信息与核基因组
信息和线粒体基因组信息结合起来,统一分析,才能
更接近系统发育过程中真实的演化历程[6]。
参考文献 References:
[1]JOHNSONGP.RevisionofCastaneasect.Balanocastanon(Fa-
gaceae)[J].JArnoldArbor,1988,69(1):25-49.
[2]HUANGHong-wen.ReviewofcurentresearchoftheworldCas-
taneaspeciesandimportanceofgermplasmconservationofChina
nativeCastaneaspecies[J].JournalofWuhanBotanicalResearch,
1998,16(2):171-176.
黄宏文.从世界栗属植物研究的现状看中国栗属资源的保护重
要性[J].武汉植物学研究,1998,16(2):171-176.
[3]HUANGH,DANEF,NORTONJD.AlozymediversityinChinese,
SuguinandAmericanchestnut(Castaneaspp.)[J].TheorApplGenet,
1994,88:981-985.
[4]VILLANIF,PIGLIUCCI,BENEDETTELLIS.Geneticdiferentia-
tionamongTurkishchestnut(CastaneasativaMil.)populations[J].
Heredity,1991,86:131-136.
[5]WOLFEKH,LIWH,SHARPPM.Ratesofnucleotidesubstitu-
tionvarygreatlyamongplantmitochondrial,chloroplast,andnu-
clearDNAs[J].ProcNatlAcadSci,1989,29:208-211.
[6]TIANXin,LIDe-zhu.ApplicationofDNAsequencesinplantphylo-
geneticstudy[J].ActaBotanicaYunnanica,2002,24(2):170-184.
田欣,李德铢.DNA序列在植物系统学研究中的应用[J].云南植
物研究,2002,24(2):170-184.
[7]BESNARDG,BERVILL$A.OnthecholoroplastDNAvariationsin
theolive(OleaeuropaeaL.)complex:comparisonofRFLPandPCR
polymorphisms[J].TheorApplGenet,2002,104:1157-1163.
[8]PARANIM,RAJESHK,LAKSHMIM.Speciesidentificationinsev-
398
3期 曹庆芹等:叶绿体DNA分析技术及其在栗属植物中的应用
ensmalmiletspeciesusingpolymerasechainreactionrestriction
fragmentlengthpolymorphismoftrnS-psbCgeneregion[J].Genome,
2001,44:495-499.
[9]AL-JANABISM,MCCLELLANDM,PETERSENC,SOBRALB
WS.PhylogeneticanalysisoforganelarDNAsequencesintheAn-
dropogoneae:Saccharinea[J].TheoApplGenet,1994,88:933-944.
[10]TABERLETP,GIELLYL,PAUTOG,BOUVETJ.Universalprimers
foramplificationofthreenon-codingregionsofchloroplastDNA[J].
PlantMolBiol,1991,17:1105-1109.
[11]DEMESUREB,SODIZN,PETITRJ.Asetofuniversalprimersfor
amplificationofpolymorphicnon-codingregionsofmitochondrial
andcpDNAinplants[J].MolEcol,1995,4:129-131.
[12]MAGNICR,DUCOUSSOA,CARONH,PETITRJ,KREMERA.
ChloroplastDNAvariationofQuercusrubraL.inNorthAmericaand
comparisonwithotherFagaceae[J].MolEcol,2005,14(2):513-24.
[13]VETTORIC,VENDRAMINGG,ANZIDEIM,PASTORELLIR,
PAFFETTID,GIANNINIR.Geographicdistributionofchloroplast
variationinItalianpopulationsofbeech(FagussylvaticaL.)[J].The-
orApplGenet,2004,109(1):1-9.
[14]FINESCHIS,TAURCHINID,VILLANIF,VENDRAMINGG.
ChloroplastDNApolymorphismrevealslitlegeographicalBlackwel
Science,LtdstructureinCastaneasativaMil.(Fagaceae)through-
outsouthernEuropeancountries[J].MolEcol,2000,9:1495-1503.
[15]POWELLW,MORGANTEM,ANDREC.Hypervariablemicrosatel-
litesprovideageneralsourceofpolymorphicDNAmarkersforthe
chloroplastgenome[J].CurBiol,1995(5):1023-1029.
[16]BRYANGJ,McnicolJ,RAMSAYG,MEYERRC,JONGWSD.
Polymorphicsimplesequencerepeatmarkersinchloroplastgenomes
ofSolanaceousplants[J].TheorApplGenet,1999,99:859-867.
[17]ISHIT,MccouchSR.Microsatelitesandmicrosyntenyinthe
chloroplastgenomesofOryzaandeightotherGramineaespecies[J].
TheorApplGenet,2000,100:1257-1266.
[18]WEISINGK,GARDNERRC.ASetofconservedPCRprimersfor
theanalysisofsimplesequencerepeatpolymorphismsinchloroplast
genomesofdicotyledonousangiosperms[J].Genome,1999,42:9-19.
[19]CHENGYJ,DEVICENTEMC,MENGHJ,GUOWW,TAON
G,DENGXX.AsetofprimersforanalyzingchloroplastDNAdi-
versityinCitrusandrelatedgenera[J].TreePhysiology,2005,25(6):
661-672.
[20]NISHIKAWAT,VAUGHANDA,KADOWAKIK.Phylogenetic
analysisofOryzaspecies,basedonsimplesequencerepeatsand
theirflankingnucleotidesequencesfromthemitochondrialand
chloroplastgenomes[J].TheorApplGenet,2005,110:696-705.
[21]ZHANGTian,LIZuo-zhou,LIUYa-ling,JIANGZheng-wang,
HUANGHong-wen.Geneticdiversity,geneintrogressionandho-
moplasyinsympatricpopulationsofthegenusActinidiaasrevealed
bychloroplastmicrosatelitemarkers[J].BiodiversityScience,2007,
15(1):1-22.
张田,李作洲,刘亚令,姜正旺,黄宏文.猕猴桃属植物的 cpSSR
遗传多样性及其同域分布物种的杂交渐渗与同塑 [J].生物多样
性,2007,15(1):1-22.
[22]DECROOCQV,HAGENLS,FAVE,MG,EYQUARDJP,PIER-
RONNETA.MicrosatelitemarkersinthehexaploidPrunusdomes-
ticaspeciesandparentagelineageofthreeEuropeanplumcultivars
usingnuclearandchloroplastsimple-sequencerepeats[J].Molecular
Breeding,2004,13(2):135-142.
[23]KATAYAMAH,ADACHIS,YAMAMOTOT,UEMATSUC.Awide
rangeofgeneticdiversityinpear(Pyrusussuriensisvar.aromatica)
geneticresourcesfromIwate,JapanrevealedbySSRandchloroplast
DNAmarkers[J].GeneticResourcesandCropEvolution,2007,54(7):
1573-1585.
[24]PARDUCCIL,SZMIDTAE,MADAGHIELEA,ANZIDEIM,VEN-
DRAMIN G G.Geneticvariationatchloroplastmicrosatelites
(cpSSRs)inAbiesnebrodensis(Lojac.)mateiandthreeneighbor-
ingAbiesspecies[J].TheorApplGenet,2001,102:733-740.
[25]DEGUILLOUXMF,PEMONGEMH,BERTELL,KREMERA,
PETITRJ.Checkingthegeographicaloriginofoakwood:molecular
andstatisticaltools[J].MolEcol,2003,12(6):1629-1636.
[26]SEBASTIANIF,CARNEVALEGG,VENDRAMIN.Anewsetof
mono-anddinucleotidechloroplastmicrosatelitesinFagaceae[J].
MolecularEcologyNotes,2004,4:259-261.
[27]ZHENZhen,CAOQing-qin,YANGKai,SHENYuan-yue,QIN
Ling.TheestablishmentofcpSSRmarkertechnologyandoptimiza-
tionofitsreactionsystemingenusCastanea[J].JournalofFruitSci-
ence,2007,24(4):557-560.
甄贞,曹庆芹,杨凯,沈元月,秦岭.栗属植物 cpSSR标记技术的
建立与体系优化研究[J].果树学报,2007,24(4):557-560.
[28]YANAn,ZHUDeng-yun.Theapplicationofchloroplastgenomein
thestudiesofsystmaticsandbioengineering[J].JournalofCelBiol-
ogy,2004,26(2):153-156.
燕安,朱登云.叶绿体基因组在系统发育学及基因工程领域的
应用[J].细胞生物学杂志,2004,26(2):153-156.
[29]DOWNIESR,KATZ-DOWNIEDS,WATSONMF.Aphylogeny
ofthefloweringplantfamilyApiaceaebasedonchloroplastDNA
rpl16andrpoC1intronsequencestowardsasupragenericclassifica-
tionofsubfamilyApioideae[J].AmerJBot,2000,87:273-292.
[30]KANNOM,YOKOYAMAJ,SUYAMAY,OHYAMAM,ITOHT,
SUZUKIM.Geographicaldistributionoftwohaplotypesofchloro-
plastDNAinfouroakspecies(Quercus)inJapan[J].JapanPlantRes,
2004,117(4):311-317.
[31]KAMIYAK,HARADAK,CLYDEMM,MOHAMEDAL.Genetic
variationofTrigonobalanusverticilata,aprimitivespeciesofFa-
gaceae,inMalaysiarevealedbychloroplastsequencesandAFLP
markers[J].GenesGenetSyst,2002,77(3):177-186.
[32]FRASCARIAN,MAGGIAL,MICHAUDM,BOUSQUETJ.TherbcL
genesequencefromchestnutindicatesaslowrateofevolutioninthe
Fagaceae[J].Genome,1993,36(4):668-671.
[33]LANGP,DANEF,THOMASL,KUBISIAK.PhylogenyofCastanea
(Fagaceae)basedonchloroplasttrnT-L-Fsequencedata[J].TreeGe-
netics&Genomes,2006,2(3):132-139.
[34]WANGHua-kun,QIAOYu-shan,LOUXiao-ming,XUEHua-bai,
ZHANGZhen.Distributionofmicrosatelitefromcompletesequence
ofArabidopsisthalianachloroplastDNA[J].ChineseJournalofBio-
chemistryandMolecularBiology,2006,22(10):845-850.
王化坤,乔玉山,娄晓鸣,薛华柏,章镇.拟南芥叶绿体 DNA全
序列微卫星分布规律的分析[J].中国生物化学与分子生物学报,
2006,22(10):845-850.
399