全 文 ：世界科学技术—中医药现代化★专题讨论之一：中药资源与鉴定
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2013-05-24
修回日期：2013-06-04
＊ 海口市科技工业信息局重点科技项目（2011—0036）：黎药的 DNA条形码研究，负责人：唐历波。
＊＊ 通讯作者：唐历波，副教授，主要研究方向：植物资源学。
木麻黄属的DNA条形码鉴定研究＊
□唐历波＊＊ 李 栎（海南医学院理学院 海口 570204）
秦明艳（海南省药品检验所 海口 571109）
林维健（海南医学院理学院 海口 570204）
欧武英（海口市人民医院 海口 570201）
摘 要：为验证 DNA 条形码序列在物种鉴定方面及物种的系统发育方面的广适性，本研究以黎
药植物木麻黄为研究对象，收集木麻黄及其近缘种和混伪品 22 份样本，采用 4 对引物（ITS，ITS2，
trnH-psbA，rbcL）分别进行 PCR 扩增，产物进行双向测序。利用 CodonCode Aligner 软件进行序列的拼
接，采用 MEGA5.1 进行数据的处理。结果表明，利用 ITS/ITS2 可以区分木麻黄与其近缘种以及混伪
品，样品的 psbA-trnH，rbcL 和 ITS/ITS2 4 个序列中，ITS/ITS2 序列具有明显的 DNA gap。基于 ITS/
ITS2 序列构建的 NJ 树结果表明，木麻黄属所有样品聚为一类，呈现明显的单系性，与其亲缘关系较
近的是藤黄科。因此，ITS/ITS2 序列可以准确鉴定黎药的基原植物。并能从分子水平揭示木麻黄的系
统演化规律。
关键词：木麻黄 ITS/ITS2 物种鉴定 系统发育
doi: 10.11842/wst.2013.03.011 中图分类号：R282.5 文献标识码：A
木麻黄（Casuarina equisetifolia Linn.）是一种重
要的黎药植物，黎药名雅担风，具有温寒行气，止咳
化痰的功效。黎族人用枝叶煎汤内服治疗疝气、慢
性咳嗽。目前开发出来的产品有木麻黄浸膏，复方
木麻黄片。海南野生的木麻黄有两个种，分别是细
枝木麻黄（C. cunninghamiana Miq.） 和木麻黄（C.
equisetifolia Linn.）。而作为黎药使用的是木麻黄，其
混伪品包括木麻黄的近缘种、裸子植物中的马尾松
（Pinus massoniana）、肯氏南洋杉（Araucaria cunning－
hamii）、南亚松（Pinus finlaysoniana），桃金娘科的岗
松（Baeckea frutescens）。
其次，木麻黄的分类地位一直存在争议，被子
植物起源的假花学说认为，木麻黄是由裸子植物的
麻黄类直接演化而来的，故认为其分类地位应该列
入到裸子植物中 [1]；而真花学说认为木麻黄的花的
结构虽然也是柔荑花序、单性花，但认为是由金缕
梅亚纲次生演化的结果，与裸子植物有很大的差
异。因此将木麻黄归类为被子植物，单独一个木麻
黄科 [2]。为此，我们开展了针对木麻黄及其混伪品的
DNA 条形码鉴定研究，探索在分子水平上进行黎药
的标准化鉴定，并通过与相关科属的分子比对，探
索木麻黄的分类地位及其系统演化规律。
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DNA 条形编码 [3,4]或称 DNA 条形码技术（DNA
barcoding）是利用标准的、具有足够变异的、易扩增
且相对较短的 DNA 片段在物种种内的特异性和种
间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，
它可以对物种进行快速的自动鉴定。理想的 DNA
条形码应该具备以下几个标准 [5,6]：种间具有明显的
遗传变异和分化，并且种内具有足够小的变异片
段；具有足够短的 DNA 片段，而且易于 DNA 提取和
PCR 扩增；在保守区域中设计通用引物较容易；利
用 DNA 条形码技术对物种的快速自动鉴定，从而
克服传统分类学研究方法的诸多缺陷已成为国内
外研究的热点。2003 年，Herbert[7]研究发现利用线粒
体细胞色素 C 氧化酶亚基Ⅰ （Mitochondrial cy－
tochrome c oxidase subunit I, COI）基因一段长度为
648 bp 的片段能够在 DNA 水平上成功的区分物种 ,
并且认为利用 COI 基因从分子演化的角度, 将提供
快速、简便、可信的分类方法。
一、材料与方法
1. 材 料
下列材料于 2012 年 11 月采集自海南儋州两
院、兴隆、海南医学院校内、乐东、火山口以及尖峰
岭 8 个地区，代表海南的东部、西部 、南部、北部和
中部 5 个生态系统群，每个居群随机抽取若干株，
每株采集健康无病斑叶片 2 片，硅胶干燥带回实
验室进一步分析。标本由中国热带作物研究院品
质资源研究所王祝年研究员鉴定，凭证标本和数字
影像信息保存于海南医学院理学院药用植物标本
室。各类植物标本编号及从 GenBank 下载序列详见
表 1。
表 1 样品来源
序号 标本号 样品名 所属科 样品拉丁名
1 HPS-200MT03 细枝木麻黄 木麻黄科 Casuarina cunninghamiana
2 HPS-200MT04 细枝木麻黄 木麻黄科 Casuarina cunninghamiana
3 HPS-200MT06 木麻黄 木麻黄科 Casuarina equisetifolia
4 HPS-200MT02 木麻黄 木麻黄科 Casuarina equisetifolia
5 HPS-200A002 木麻黄 木麻黄科 Casuarina equisetifolia
6 HPS_069_MT03 侧柏 柏科 Biota orientalis
7 HPS_069_MT02 侧柏 柏科 Biota orientalis
8 HPS_067_MT01 肯氏南洋杉 南洋杉科 Araucaria cunninghamii
9 HPS_067_MT02 肯氏南洋杉 南洋杉科 Araucaria cunninghamii
10 HPS_073_MT01 南亚松 松科 Pinus finlaysoniana
11 HPS_073_MT02 南亚松 松科 Pinus finlaysoniana
12 HPS_065_MT01 刺柏 柏科 Juniperus formosana
13 HPS_065_MT02 刺柏 柏科 Juniperus formosana
14 HPS_085_MT01 桂木（大叶胭脂） 桑科 Artocarpus nitidus Trec. subsp. lingnanensis
16 HPS_085_MT03 桂木（大叶胭脂） 桑科 Artocarpus nitidus Trec. subsp. lingnanensis
17 HPS-A001MT01 马尾松 松科 Pinus massoniana
18 HPS-A001MT02 马尾松 松科 Pinus massoniana
19 HPS_219_MT01 见血封喉 桑科 Antiaris toxicaria Lesch
20 HPS_219_MT02 见血封喉 桑科 Antiaris toxicaria Lesch
21 HPS_156_MT01 红厚壳 藤黄科 Calophyllum inophyllumLinn
22 HPS_156_MT02 红厚壳 藤黄科 Calophyllum inophyllum
23 HPS_156_MTAB 红厚壳 藤黄科 Calophyllum inophyllum
24 HM116956 粉绿美丽柏 柏科 Callitris glauca
25 AY864057 木麻黄 木麻黄科 Casuarina equisetifolia subsp. equisetifolia
26 HM116957 蓝枝木麻黄 木麻黄科 Casuarina pauper
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2. 方 法
（1）DNA 提取操作步骤。
叶片样品为硅胶干燥后称取 10 ~15 mg，采
用 DNA 球磨仪（Retsch MM300,Genman）研磨 30 s
（2 000 rpm），茎枝样品剪碎用液氮研磨后，使
用 DNA 提取试剂盒 （Tiangen biotech Co . ,China）
提取总 DNA [ 8 ]，PCR 扩增引物及扩增条件参考文
献 [ 9 ~ 12 ]。
（2）PCR 反应体系及其扩增程序。
PCR 扩增体系为 25 μL，包括 MgCl2 2 μL（25
mmol·L-1），dNTP 2 μL（2.5 mmol），PCR 缓冲液 2.5
μL（10 ×），引物各 1.0 μL（2.5 μmol）（Sangon Co.,
China）, 聚合酶 1.0 U（Biocolor BioScience&Technol－
ogy Co., China），总 DNA 1 μL（约 30 ng）。琼脂糖
电泳检测，选出条带清晰且仅有单独条带的样品
送样至上海美吉生物医药科技有限公司进行双向
测序。
（3）数据处理方法。
测序返回的峰图文件采用 CodonCode Aligner
V3.7.1（CodonCode Co., USA）进行正反向校对拼接，
去除低质量序列及引物区。然后 , 将所
有序列用软件 MEGA5.0（Molecular evo－
lutionary genetics analysis） 分析比对 [13],
并基于 K2P 模型进行遗传距离等分析 ,
用邻接（NJ）法构建系统聚类树 , 利用
Bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支
持率。ITS 序列采用基于隐马尔可夫模型
的 HMMer 注释方法去除两端 5.8S 和
28S区段即可获得 ITS2 间隔区序列[14]。
二、结果与分析
1. PCR 扩增效率和测序成功率
从图 1 可以清楚的看出，采用 4 对
引物扩增后，分析其效率，可以清楚的
看出 ITS2 的 PCR 扩增后无论是效率还
是测序成功率或是序列获得率均是最
高，分别为 97.1%、96.9%和 93.5%（如
图 1），该结果数据与文献 [15,16]所获的结
果类似。
采用 ITS2 进行 PCR 扩增后，在
400~600 bp 之间看到有一条明显的条
带，如图 2 所示。
2. 木麻黄种间种内变异位点分析
在 Meyer 等 [17]对 DNA 条形码序列变异分析方
法的基础上, 通过分析“种间最小变异”（Minimum
interspecific distance）以及对应种内最大变异（Coa－
lescent depth）。对实验获得的木麻黄及 GenBank 下
载的木麻黄属中的其他种不同 DNA 条形码候选序
列的种内变异、种间变异、种间最小变异和种内最
大变异进行分析。结果表明（表 2）, rbcL 序列的种
间变异最大，其次是 psbA-trnH 和 ITS2 序列，ITS 序
列种间变异最小。最小种间距离是 rbcL 最大，ITS
最小，达到 0.008 9。而各序列的种内变异是 rbcL 最
大，ITS 与 ITS2 序列种内变异接近为 0。种内最大变
异中，rbcL 序列和 psbA-trnH 较大，均超过其最小种
间距离，说明其种内种间距离有重叠。因此 rbcL 和
psbA-trnH 作为条形码难以区分木麻黄不同的种。
相反，ITS 和 ITS2 种内最大距离均小于最小种间距
离，具有明显的 DNA gap，从实际鉴定结果来看，利
用 ITS 序列，在 GenBank 搜索比对后，与木麻黄（Ca－
suarina equisetifolia）相近，利用 ITS2 序列比对，在
（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）网站
图 1 PCR 扩增效率、测序成功率及序列获得率
图 2 ITS2 序列 PCR 扩增结果
注：M:Marker，15: 阴性对照（CK），其他序号与表 1的序号相对应。
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
ITS2 psbA-trnH rbcL ITS
PCR扩增效率
测序成功率
序列获得率
2 000 bp
1 000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
200 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
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进行序列的注释，去除 5.8S 和 28S 两端序列，获得
ITS2 序列，比对后与木麻黄序列完全吻合，与形态
学指标鉴定相符。因此，可利用 ITS/ITS2 序列进行
木麻黄种源的鉴定。
3. 木麻黄及其同科属近缘种 NJ 聚类分析
利用 ITS/ITS2 序列分别构建木麻黄及其近缘
种及混伪品的 NJ 树（图 3 和图 4）结果表明木麻黄
与其近缘种单独聚为一支，值得注意的是，在基于
ITS2 序列木麻黄聚类分析中，出现了从 GenBank 下
载的序列 HM116956 澳洲柏树（Callitris glauca），位
点变异分析表明，所测木麻黄样本与 Callitris glau－
ca 仅有 5 个位点的差异，分别是第 1，387，388，389
位点缺少碱基，67 bp 处有一个碱基转换。但聚类
分析表明木麻黄应归结到被子植物的分支中。如
图 3 所示。
基于 ITS 序列构建了木麻黄及其它与木麻黄
有着在形态学分类方面类似其他科属的 NJ 聚类树
（如图 4 所示），可以看出木麻黄 3 个种及从 Gen－
表 2 4 个序列的种内种间变异
Sequence characteristics ITS ITS2 rbcL psbA-trnH
Length range/bp 543~803 222~241 567~1400 338~396
GC content/% 64.6 70.1 43.0 28.8
Average inter-specific distance 0.012 3±0.007 4 0.212 6±0.034 0 0.331 4±0.032 5 0.222 2±0.024 2
Average theta prime 0.012 5±0.008 1 0.083 1±0.014 4 0.350 9±0.034 5 0.222 2±0.024 2
Average Smallest inter-specific distance 0.008 9±0.006 1 0.077 9±0.013 3 0.199 2±0.019 6 0.021 5±0.008 5
Average intra-specific distance 0.009 3±0.004 0 0.001 5±0.001 5 0.394 7±0.040 8 0.272 8±0.028 9
Coalescent depth 0.009 5±0.006 2 0.000 9±0.000 9 0.39 4±0.037 8 0.363 8±0.038 5
Average maximum intra-specific distance 0.006 3±0.010 0 0.000 9±0.000 9 0.562 7±0.053 9 0.546 0±0.058 0
图 3 基于 ITS2 序列构建的木麻黄属及其混伪品 NJ 树
注：自引导值（1 000次重复）≥50%。
Casuarina equisetifolia 200 A002
Casuarina equisetifolia 200 MTO2
Casuarina cunninghamiana 200 MTO4
Casuarina cunninghamiana 200 MTO6
Casuarina equisetifolia 200 MTO3
Callitris glauca HM116956
Casuarina pauper HM116957
Casuarina equisetifolia subsp. equisetifolia AY864057
Cratoxaylum ligustrinum 205 MT01
Calophyllum inophyllum 156 MT01
Calophyllum inophyllum 156 MT02
Baeckea frutescens 121 MT01
Baeckea frutescens 121 MT02
Artocarpus nitidus Trec. subsp. lingnanensis 085MT03
Pinus finlaysoniana 073 MT01
Pinus massoniana A001 MT01
Biota orientalis 069 MT02
Biota orientalis 069 MT03
Juniperus formosana 065 MT01
Juniperus formosana 065 MT02
Araucaria cunninghamii 067 MT02
50
100
96 52
100
100
100
100
100
67
400
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图
4
基
于
IT
S
条
形
码
序
列
构
建
的
木
麻
黄
属
及
其
混
伪
品
NJ
树
表
3
木
麻
黄
属
IT
S
序
列
种
间
及
种
内
变
异
位
点
分
析
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0
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5
bp
57
6
bp
57
8
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58
3
bp
73
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3
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Bank 下载的近缘种都是聚为一支，呈现明显的单系
性。NJ 聚类树结构与 ITS2 类似。而在变异位点分析
中，基于 ITS 序列比对中，来源于海南的细枝木麻黄
（Casuarina cunninghamiana Miq.）与木麻黄（Casuari－
na equisetifolia Linn.）。分别有 10 个及 4 个位点变
异，而木麻黄本身也有 2 个单倍型。从表 3 结果可
知，基于 ITS 序列可以将细枝木麻黄（Casuarina
cunninghamiana Miq.）与木麻黄（Casuarina equisetifo－
lia Linn.）区分开，而基于 ITS2 比对结果表明，木麻
黄与其近缘种序列较为相似。
三、讨 论
1. 木麻黄 DNA 条形码鉴定的准确性
从以上变异位点分析以及 NJ 树聚类分析均表
明，利用 ITS/ITS2 条形码序列能够准确鉴定木麻黄
属的几个种。同时，与木麻黄形态学类似的混伪品
如桃金娘科岗松，裸子植物的南亚松等，由于属于
科等级上差异，反映在 ITS2 序列方面有很大的差
异，因此利用 ITS/ITS2 很容易将木麻黄与其混伪品
区分开来，但具体到属内几个近缘种，利用 ITS2 区
分近缘种效率较低，而利用 ITS 序列作为补充，可准
确鉴定属内几个近缘种。其原因可能源于 ITS2 序列
较短，近缘种间分化程度低，导致 ITS2 序列重叠相
似，但从另一个侧面也可以反映出木麻黄属内的种
的分化并不充分。尤其值得注意的是，本研究获得的
木麻黄 ITS2 序列与澳洲柏树（Callitris glauca）序列
相似，仅有五个碱基的差异，如果从 GenBank下载的
数据真实可靠，可以推测木麻黄源于裸子植物澳洲
柏树（Callitris glauca）或者说与其有相同的起源。
2. 木麻黄的分类地位
目前国内对木麻黄科植物的研究 , 主要集中于
引种栽培以及沿海混交林的改造、营养元素的动态
特性 [18]等方面。也对小枝提取物进行分离鉴定及化
感作用进行探讨。在共生菌 Frankia[19]的研究方面，
主要是进行分离、培养筛选、菌对宿主的侵染率和
抗逆性等。近年来，也进行了抑青枯菌生长的实验。
而较少从分子水平上 [20,21]对木麻黄科植物进行分类
地位研究。目前分类学研究认为，由于木麻黄科植
物的花结构为单性花，种子结构分析表明，木麻黄
应来源于金缕梅亚纲。本研究以 4 对通用引物进行
扩增，并基于 ITS/ITS2 构建 NJ 树，Casuarina 属几个
种单独为一支，而 Pinus finlaysoniana、Pinus massoniana、
Juniperus formosana、Araucaria cunninghami、Biota ori－
entalis（植物名称见表 1）几个物种则聚在一起，为一
支旁系，自引导值为 99%，遗传距离分析表明，木麻
黄属与藤黄科的红厚壳平均 K2P 距离为 0.117 5±
0.024 7，而与裸子植物的 Pinus 属平均 K2P 距离为
0.302 4±0.045 4。NJ 树结果分析表明与木麻黄比较
接近的是藤黄科的红厚壳及黄牛木。因此，序列比
对结果支持将木麻黄科归属于被子植物，而与裸子
植物亲缘关系较远，无论是 ITS 序列还是 ITS2 序
列，NJ 树分析都得到相同的结论，说明可利用 ITS/
ITS2 标准条形码进行植物的系统发育及分子进化
的研究。
参考文献
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（责任编辑：李沙沙 张志华，责任译审：陈士林）
DNA Barcoding the Plant of the Casuarina
Tang Libo1, Li Li1, Qin Mingyan2, Lin Weijian1, Ou Wuying3
(1. Hainan Medical College Science Department Plant & Animal Staffroom, Haikou 570204, China;
2. Hainan Drug Inspective Institute, Haikou 571109, China;
3. Haikou Peoples Hospital, Haikou 570201, China)
Abstract: In this research, Casuarina eguisetifolia Linn was used to verify the broadly suitability of DNA bar-
codes in identification of Li -medicine plants and systematic development of species. The genomic DNA of 22
samples collected C. eguisetifolia and its adulterants were amplified by 4 pairs of primers respectively (ITS (inter-
nal transcribed spacer), ITS2 (internal transcribed spacer 2), trnH-psbA, rbcL) and sequenced bi-directionally.
Obtained sequences were assembled using CodonCode Aligner. The dates were analysised using MEGA5.1 in ac -
cordance with the kimura 2-parameter (K2P) model. The neighbor-joining (NJ) phylogenetic trees were construct -
ed. Our study demonstrated the efficacy of ITS/ITS2 to distinguish between C. eguisetifolia and other adulterants
species at the molecular level. Comparative to the primer of trnH-psbA and rbcL, there was a obviously DNA
gap. The NJ trees showed that the several species of Casuarina can be classified to same types to show a obvi-
ously monophyly, which the nearest family was Guttiferae. Therefore, ITS/ITS2 regions can accurately distinguish
the original plant of Li-medicine. The systematic evolution of Casuarina can be verified in the molecular level.
Keywords: Casuarina equisetifolia, ITS/ITS2, species identification, systematic evolution
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