全 文 ：第 27卷　第 2期 　　　　　　　　　　　　　　西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　 Vo.l 27　No. 2
　 2007年 4月 　　　　　　　　　　 JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY COLLEGE　　　　　 Apr. 2007　
*　收稿日期:2007 - 03 - 13
作者简介:陈剑英(1974 -),男 ,云南永胜人,工程师 ,主要从事林木种苗科技信息管理工作.
油杉属植物过氧化物同工酶研究*
陈剑英
(云南省林木种苗工作总站 ,云南 昆明 650215)
摘要:用 D isc聚丙酰胺凝胶电泳分析了油杉属 8个种的过氧化物同工酶.结果表明:属内种间
具有明显的酶谱差异 ,每个种都有其特征酶谱.用数量分类中的系统聚类方法对油杉属 8个种
酶谱的相似程度进行了研究 ,结果把 8个种分为 3个类群 , 6个种 ,归并了 2个种. 其中:油杉 、
江南油杉为一类群 ,铁坚油杉 、黄枝油杉为一类群 ,云南油杉 、旱地油杉为一类群 ,铁坚油杉与
青岩油杉归并为同一物种 ,云南油杉与蓑衣油杉归并为同一物种 ,推断旱地油杉为云南油杉的
生态变种 ,从分子水平上论证了油杉属各种间的亲缘关系.
关键词:油杉属;同工酶;亲缘关系
中图分类号:S791. 150. 4　　文献标识码:A　　文章编号:1003 - 7179(2007)02 -0046 -04
　　油杉属 (Keteleeria Ca rr. )植物是裸子植物中
较原始的类群 ,是我国秦岭以南广大地区重要的
乡土造林 、园林绿化树种 ,在我国计有 11种 2变
种 [ 1 - 6] .该属植物种间在叶形 、球果种鳞 、苞鳞 、种
子形态上由于分化不太强烈 ,各个性状表现出多
型特点 ,植物种种间界限很不明显 ,从形态特征上
区别物种分类难度大 [ 7] ,给生产 、科研中种质交流
带来困难.
同工酶受基因控制 ,在一定程度上反映生物
的系统发育 ,其与蛋白质相似 ,在进化中具有一定
的保守性 ,可用以对不同分类群的不同植物间进
行比较 ,为分类提供证据 [ 8] . 同工酶已成功地运用
于松科 、柏木属 、竹亚科的分类 [ 9 -11] .本研究应用
同工酶分析技术 ,对油杉属 8个种进行过氧化物
同工酶测定分析 ,以期比较种间 、种内差异 ,分析
属内各种间的亲缘关系 ,为综合的系统分类分析
提供资料.
1　材料与方法
1. 1　试验材料
分别从云南 、贵州 、广西等地野生或人工栽培
的油杉植株上采集成熟叶片作为试材. 试材名称
及对应的采集地信息见表 1.
1. 2　方法
按 Davis法 , 采用聚丙酰胺凝胶盘状电泳
(disc-electrophoresis).每一试材重复电泳 3次.
1. 2. 1　酶液制备　油杉属树种试材 ,分别称取 4 g
鲜 、净叶 ,切碎置预冷研钵中 ,加入 10mL的 pH 6. 7
Tris-HC l缓冲液(加少许石英砂),研成匀浆 ,用 4层
细纱布过滤 ,滤液经 10 000 r /m in下离心 15m in后 ,
取上清液置 - 12℃ ～ - 16℃冰箱中保存 ,备用.
表 1　同工酶分析的油杉属植物名录
树种号 中文名 拉丁学名 材料来源
1 油　杉 K. fortune iCa rr. 广西百色地区林科所
2 江南油杉 K. cyc lolepis F lous. 云南富宁县皈朝镇
孟村龙山土地庙前
3 黄枝油杉 K. calcarea Cheng e t L. K. Fu 云南中国科学院昆
明植物研究所
4 青岩油杉 K. dav idiana va r. chien - peii
Cheng e t L. K. F u
贵州青岩
5 铁坚油杉 K. dav idiana Beissn. 云南中国科学院昆
明植物研究所
6 云南油杉 K. evelynianaM as.t 云南中国科学院昆
明植物研究所
7 蓑衣油杉 K. evelyniana var. pendula Hsueh 云南华宁县公园
8 旱地油杉 K. xeroph ila Hsueh e t S. H. Huo 云南新平县水塘乡
1. 2. 2　同工酶测定　采用 D isc聚丙酰胺凝胶电
泳系统(在冰箱 4℃下).浓缩胶浓度 4%, pH 6. 7;
分离胶浓度 7. 5%, pH 8. 9;0. 05mo l /L Tris -甘氨
酸电泳缓冲液 , pH 8. 3,上样量 60μL;溴粉兰作前
沿指示.起始电流 12mA ,电压 100V ,待样品进入
分离胶(约 1 h)后变为电流 24mA ,电压 200V. 电
泳后 ,用改良的醋酸 -联苯胺染色 ,酶谱呈现清晰
颜色后 ,倾去色液 ,冲洗固定. 分别记载每一树种
的酶带数目 ,测算 R f. 最后 ,拍片保存 ,并绘制油杉
各种酶谱带图.
1. 2. 3　酶谱分析方法
(1)应用胡志昂 [ 8]和 Vaughan[ 12]提出的酶谱
相似性系数法 ,计算酶谱相似性系数 s,分析树种
种间相似度 ,分析种间亲缘关系.
s= 相同的同工酶带数两个比较种同工酶带平均数 ×100%
(2)应用最短距离法 ,计算种间欧氏距离 D ij
(即种间相似度)进行物种聚类分析 [ 13 -14] ,建立树
状图.
D ij =1
N
∑N
k=1(X ik -X jk )2
式中:D ij为 i, j类树种相似度;X ik为第 i类树种第 k
条酶带的迁移率 (R f)值;X jk为第 j类树种第 k条酶
带的迁移率 (R f)值;N为酶带总条数.
树种之间距离越小 ,相似度越大;反之 ,树种
之间距离越大 ,相似度越小.
2　结果与分析
2. 1　过氧化物同工酶电泳结果
通过聚丙酰胺凝胶盘状电泳 ,油杉属 8个种
的过氧化物同工酶共有 6种酶谱 (见图 1 ).其中
铁坚油杉与青岩油杉 ,云南油杉与蓑衣油杉的酶
谱完全相同 ,各记为 1种酶谱.
依据酶带迁移率 (R f)(见表 2)将同工酶划分
为 3个区:
A区:慢速带区 ,R f为 0. 00 ～ 0. 41;
B区:中速带区;R f为 0. 45 ～ 0. 53;
C区:快速带区;R f为 0. 60以上.
A区酶带染色快 ,共有 2条酶带;B区酶带染
色次之 ,共有 4条酶带;C区酶带染色最慢 ,共有 5
条酶带.各种间在酶带的数量 、相对迁移率 (R f)上
有着较大的差异.从酶带数量上看:最多的是油杉
和黄枝油杉 ,都有 6条酶带;最少的是旱地油杉 ,
仅 3条酶带;其余一般为 4 ～ 5条带. 从酶带的 R f
值上反映出 ,油杉属植物含有 1条 B区共有带 —
b3带;油杉 、江南油杉 、黄枝油杉 、青岩油杉和铁坚
油杉 5个种均有 3条共同的酶带 ,即 a1 , b2 , b3带.
依据油杉属植物过氧化物同工酶相同或相似 R f
值的多少 ,大致可以将油杉属植物划分为 3种类
群:(1)油杉 、江南油杉类群;(2)铁坚油杉 、青岩
油杉 、黄枝油杉类群;(3)云南油杉 、蓑衣油杉 、旱
地油杉类群. 3组类群酶带间最明显的差异在 C
区 ,各个酶带(c1 ～ c4)相互交错.
表 2　油杉属植物过氧化物同工酶 R f值
树
种
号
树种名
酶带 R f值
a1 a2 b1 b2 b3 b4 c1 c2 c3 c4 c5
1 油　杉 0. 39 0. 00 0. 45 0. 47 0. 50 0. 00 0. 59 0. 00 0. 63 0. 00 0. 00
2 江南油杉 0. 39 0. 00 0. 00 0. 47 0. 50 0. 00 0. 59 0. 00 0. 63 0. 00 0. 00
3 黄枝油杉 0. 39 0. 41 0. 00 0. 47 0. 50 0. 00 0. 00 0. 61 0. 00 0. 65 0. 00
4 青岩油杉 0. 39 0. 00 0. 00 0. 47 0. 50 0. 00 0. 00 0. 61 0. 00 0. 65 0. 00
5 铁坚油杉 0. 39 0. 00 0. 00 0. 47 0. 50 0. 00 0. 00 0. 61 0. 00 0. 65 0. 00
6 云南油杉 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 50 0. 53 0. 00 0. 00 0. 00 0. 65 0. 67
7 蓑衣油杉 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 50 0. 53 0. 00 0. 00 0. 00 0. 65 0. 67
8 旱地油杉 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 50 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00 0. 65 0. 67
2. 2　同工酶酶谱分析
2. 2. 1　酶谱相似性系数法分析　依据酶谱相似
性系数 (s)结果(见表 3),进一步分析油杉属 8种
种间相似度 ,分析种间亲缘关系.
油杉类群:两个种具 A区的前端 1条带 a1
带;B区的 b1 , b2 , b3带;C区 c1 , c3带.而油杉与江
南油杉仅 b1带有差异 , 2个种种间的相似度 (s)为
90. 9%(表 3).
铁坚油杉类群:3个种酶带几乎完全吻合 ,有
A区全部带 , B区后端 b2 , b3带 , C区中端 c2 , c4
带.其中铁坚油杉与青岩油杉两种酶带完全相同 ,
仅为带的窄宽度 、颜色深浅不一而已 (相似度
100%),故可以推断这 2种为同一类群 ,建议将其
合并. 另外 ,黄枝油杉与铁坚油杉种仅在 A区的酶
带中有差异(a2带),相似度也为 90. 9%.
云南油杉类群:3个种的酶谱差异不大 ,有 B
区后端 b3 , b4带 , C区后端 c3 , c4带. 其中:云南油
杉 、蓑衣油杉多了 1条特征酶带 b4带 ,旱地油杉无
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该带 ,且云南油杉与蓑衣油杉相似度也为 100%,
建议合并为同一种云南油杉 ,这与荷兰中央大学
系统植物研究所著名分类学者 A FARJON的研究
结果[ 13]完全一致. 旱地油杉与云南油杉相似度为
85. 7%,且旱地油杉为云南特有种 ,是在云南新平
干热河谷特殊地带分布的种类 ,因此 ,推断旱地油
杉是云南油杉的生态变种.
表 3　油杉属植物相似系数(s)
树种名 油杉 江南油杉黄枝油杉青岩油杉铁坚油杉云南油杉蓑衣油杉旱地油杉
油　杉 90. 9 50. 0 54. 5 54. 5 20. 0 20. 0 22. 2
江南油杉 54. 5 60. 0 60. 0 22. 2 22. 2 25. 0
黄枝油杉 90. 9 90. 9 40. 0 40. 0 44. 4
青岩油杉 100. 0 44. 4 44. 4 50. 0
铁坚油杉 44. 4 44. 4 50. 0
云南油杉 100. 0 85. 7
蓑衣油杉 85. 7
旱地油杉
2. 2. 2　最短距离法聚类　聚类结果见图 2. 当树状
图截集 λ(种间最短距离)=0. 08时 ,油杉属 8个种
分为 3类:Ⅰ(油杉 、江南油杉 ),Ⅱ(黄枝油杉 、青岩油
杉 、铁坚油杉 ), Ⅲ (云南油杉 、蓑衣油杉 、旱地油
杉).Ⅱ类中铁坚油杉与青岩油杉距离为 0. 00, Ⅲ类
中云南油杉与蓑衣油杉距离为 0. 00,说明树种间相
似度为 100%,应分别归并为同一物种.
3　讨　论
3. 1　油杉属植物过氧化物同工酶谱与种间亲缘关系
油杉属是松科的一个少种属. 该属在我国共
12种 2变种 ,从本次 D isc聚丙酰胺凝胶电泳试验
分析的油杉属 8种植物的过氧化物同工酶酶谱来
看 ,它们明显划分为 3个不同类群 ,且各个种种间
的亲缘关系在此也可以得到印证:其中油杉 、江南
油杉 2个种亲缘关系极近 ,是 1个自然的类群;铁
坚油杉 、黄枝油杉 、青岩油杉及云南油杉 、旱地油
杉 、蓑衣油杉为另外 2种类群. 而依聚类结果 , 3种
类群中铁坚油杉类群与云南油杉类群之间酶谱相
似系数高 (44. 4%),最短距离法聚类图 (图 2 )上
被聚为另一大类群 ,油杉类群与它们的相似系数
很低被聚为另一类. 若划定树状图截集 λ值为
0.08,则这 8个树种仍可以分成三大类群. 铁坚油
杉类群中铁坚油杉与青岩油杉距离为 0. 00,相似
度为 100%,故将它们归并为同一物种:铁坚油杉.
同理 ,云南油杉与蓑衣油杉也应归并 ,仅保留云南
油杉 1种;另外 ,旱地油杉与云南油杉的关系颇为
近缘 (相似系数为 85. 7%),加之其为云南新平干
热河谷特殊地带分布的种类 ,因此 ,推断其是云南
油杉的生态变种似乎比较合理. 总之 ,本文按酶谱
相似程度 ,把所研究的国产 8种油杉属植物 ,初步
划分为 3组类群 , 6个种 ,归并了 2种. 至于尚未分
析酶谱的油杉属其他种间的亲缘关系和种群归属
有待进一步研究.
3. 2　聚类方法在同工酶谱定量分析中的价值
本文应用数量分类中的聚类方法对于植物属
内各种间酶谱的相似程度作了定量分析 ,以研究
其亲缘关系.这是一次尝试.由于 1种酶的同工酶
系往往受 1个基因位点的多个等位基因 ,或者多
个位点的等位基因控制 ,故其同工酶谱往往呈现
出若干条酶带 ,有的多过十几条(如过氧化物酶 ).
由同工酶谱中单独的某 1条酶带的有无来比较和
鉴别酶谱之间的异同 ,带有很大的局限性. 而用相
似度 (距离 )进行定量分析则比较全面和准确. 若
进一步按相似度 (距离 )进行聚类 ,那么将如本文
所作的一样 ,能对同工酶的相似或相异谱作出直
观 、定量 、准确的表现和系统 、明确的阐述与解释 ,
并提供更多的信息.
[参　考　文　献 ]
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On Peroxidase Isoenzymes of P lan ts in Genus ofKeteleeria
CHEN Jian - ying
(General S tat ion of Fores t Seed and Seed ling of Yunnan Province, Kunm ing Yunnan 650215, C hina)
Abstract:Perox idase isoenzymes of 8 spec ie s in genus ofKeteleeria we re analyzed by means o fD isc po lyac-
ry lam ide ge l e lectrophoresis. It w as show ed that each species had its specific zymogram and the diffe rences in
zymog ram s among the species we re obvious. The sim ilarity o f zymog ram s o f the 8 speciesw as stud ied by system-
atic clusteringmethod applied to quantitative ana lysis. A ccording to the zymog ram s, the 8 speciesm igh t be clas-
sified into 3 g roups and 6 species, bywhich 2 pairs o f 2 speciesw e reme rged respective ly into 2 species. G roup
Ⅰ includedKeteleeria fortunei andKeteleeria cyclolepis. G roup Ⅱ containedK eteleeria david iana andKeteleeria
calcarea. The th ird group comprisedK eteleeria evelyn iana andKeteleeria xerophila. Itw as proposed tha tK etelee-
ria davidiana var. ch ien -peii shou ld beme rged w ithKeteleeria davidiana , andK eteleeria evelyniana var. pen-
dula should be merged w ithKeteleeria evelyn iana. Itw as deduced thatKeteleeria xerophila m igh t be an ecotype
ofK eteleeria evelyniana. The results from perox idase isoenzyme experimen t ve rified at mo lecular leve l the con-
sanquineous re la tions among the species in genus ofKeteleeria.
Key words:K eteleeria;perox idase isoenzyme;consangu in ity
49第 2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　陈剑英:油杉属植物过氧化物同工酶研究