全 文 ：美味牛肝菌合成漆酶的发酵条件研究
陈今朝1，王剑锋2，王慧超1，谭永忠1
(1．长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100;2．东华理工大学生物系，江西南昌 407000)
摘要 ［目的］研究美味牛肝菌合成漆酶的最适发酵条件。［方法］采用液体深层培养法研究不同碳源、氮源、pH、温度等因素对美味牛
肝菌产酶量的影响。［结果］美味牛肝菌合成漆酶的最适发酵条件为:葡萄糖 2． 0%，牛肉膏 0． 5%，KH2PO4 0． 4%，MgSO4·7H2O 0． 3%，
微量元素溶液8． 0%，维生素 B1 0． 003%，pH 4． 5，温度28 ℃，培养时间为8 d。［结论］在此条件下，漆酶产量最高，为71． 27 U/ml，该研究
为美味牛肝菌漆酶的开发应用提供了科学依据。
关键词 美味牛肝菌;漆酶;液体深层培养
中图分类号 S37 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)11 －06543 －02
Study on Synthesis Conditions of Laccase from Boletus edulis
CHEN Jin-zhao et al (College of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Chongqing 408100)
Abstract ［Objective］The aim was to study the optimum fermentation conditions for the synthesis of laccase from Boletus edulis． ［Method］
By using the submerged culture method，the effect of different carbon source，nitrogen source，pH and temperature on the laccase production
from Boletus edulis． ［Result］The optimum synthesis conditions of laccase from Boletus edulis were as follows:glucose 2． 0%，beef extract
0． 5%，KH2PO4 0． 4%，MgSO4·7H2O 0． 3%，trace element solution 8%，Vitamin B1 0． 003%，pH 4． 5，temperature 28 ℃ and culture
time 8 d． ［Conclusion］Under these conditions，the maximum laccase production was 71． 27 U /ml，the study provided scientific basis for the
development and application of laccase from Boletus edulis．
Key words Boletus edulis;Synthesis of laccase;Submerged culture
基金项目 重庆市教委科研项目(KJ101304)。
作者简介 陈今朝(1964 －) ，男，重庆涪陵人，副教授，硕士，从事食用
菌的教学与研究，E-mail:chenjinzhao@ 126． com。
收稿日期 2011-01-17
漆酶是一种重要的木质纤维降解酶，始见于漆树液中，
后来发现某些高等真菌也能分泌此酶［1］。漆酶主要应用于
工业、农业、医学和环保等领域［2］。当前对漆酶的研究主要
着眼于漆酶高产菌株的筛选、培养条件优化及漆酶理化性质
的研究等［3 －4］。美味牛肝菌(Boletus edulis)合成漆酶的研究
尚未见报道。为此，笔者在以前工作的基础上，对美味牛肝
菌合成漆酶的发酵条件进行了研究，为美味牛肝菌漆酶的开
发应用提供了科学依据［5］。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌种。美味牛肝菌，2008 年 7 月自重庆市彭水县桑
柘镇产新鲜野生美味牛肝菌子实体中分离。
1． 1． 2 培养基。液体种子培养基:马铃薯 200． 0 g，葡萄糖
20． 0 g，酵母膏 5． 0 g，MgSO4·7H2O 3． 0 g，KH2PO4 4． 0 g，维
生素 B1 10． 0 mg，水 1 000 ml
［6］;发酵基础培养基:葡萄糖
20． 0 g，蛋白胨 2． 0 g，MgSO4·7H2O 3． 0 g，KH2PO4 4． 0 g，维
生素 B1 10． 0 mg，NaCl 0． 1 g，CaCl2 10． 0 mg，水1 000 ml;微量
元素溶液参见文献［4］。
1． 2 方法
1． 2． 1 菌种培养、发酵。液体种子培养:将美味牛肝菌菌丝
体接入装有 50 ml 种子培养液的 150 ml 三角瓶中，150
r /min，28 ℃培养 4 d，备用。液体发酵:将种子液以 10%接种
量接入装有 70 ml 发酵培养基的 200 ml 三角瓶中，150
r /min，28 ℃培养 8 d，重复 3次。
1． 2． 2 酶液制备、漆酶产量测定。取 10 ml 发酵液在低温
下 3 000 r /min离心 10 min，除去菌丝体，把上清液作为粗酶
液。将 1． 0 mmol /L 愈创木酚和 50 mmol /L 的琥珀酸(pH
4． 5)配成缓冲液，取 4 ml缓冲液和 1 ml 粗酶液，混匀，30 ℃
恒温水浴反应 30 min，在 465 nm 处测定吸光度，以灭活粗酶
液和缓冲液作为对照，计算酶产量。酶活性单位(IU)定义
为:每分钟氧化 1 μmol愈创木酚所需要的酶量［7］。
1． 2． 3 碳源试验。分别用 2． 0%麦芽糖、蔗糖、淀粉、乳糖
和玉米粉代替基础培养基中的葡萄糖，测定美味牛肝菌在不
同碳源中的酶产量。将 70 ml培养基装入 200 ml三角瓶中，
灭菌，冷却，按 10%接种量接入种子液，150 r /min，28 ℃培养
8 d。发酵液离心，取 1 ml上清液，加入 4 ml含愈创木酚琥珀
酸缓冲液于 30 ℃恒温水浴反应 30 min，在 465 nm处测定吸
光度，以灭活上清液与缓冲液作为对照。每个处理重复 3
次，结果取平均值，并用 LSR法比较不同碳源酶产量的差异
显著性。
1． 2． 4 氮源试验。分别用 0． 2%氯化铵、硫酸铵、尿素、酵
母膏和牛肉膏代替基础培养基中的蛋白胨，测定不同氮源的
酶产量。每个处理重复 3次，方法和结果处理同“1． 2． 3”。
1． 2． 5 pH试验。调节培养基 pH分别为 4． 5、5． 0、5． 5、6． 0、
6． 5和 7． 0，测定不同 pH 的酶产量。每个处理重复 3 次，方
法和结果处理同“1． 2． 3”。
1． 2． 6 温度试验。将接种后的培养基分别置于 22、24、26、
28、30和 32 ℃下培养，测定不同温度下的酶产量。每个处理
重复 3次，方法和结果处理同“1． 2． 3”。
1． 2． 7 数据处理。试验数据用 DPS v7． 05专业版软件进行
计算分析。
2 结果与分析
2． 1 碳源对产酶量的影响 由表1可知，美味牛肝菌在葡萄
糖中的酶产量最大，菌丝球直径大，数量多。可见，漆酶的产量
与菌丝球生长有关，菌丝球多时，酶产量也越大;淀粉的酶产量
最小，菌丝球直径小，数量多;除蔗糖外，葡萄糖与其他碳源的
产酶量均达到了极显著差异，所以葡萄糖为最佳碳源。
2． 2 氮源对产酶量的影响 由表 2 可知，牛肉膏的酶产量
最大，且与蛋白胨、酵母膏均无显著差异;其次是蛋白胨，其
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(11):6543 － 6544 责任编辑 宋平 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.11.208
与酵母膏差异也不显著;以氯化铵为氮源时，菌丝体长势一
般，且与硫酸铵的酶产量无显著差异;尿素的酶产量最低，且
与其他氮源的差异均为极显著。在有机氮源中，菌丝球数量
较多、直径较大，而在无机氮源中则较差，菌丝球数量多、直
径小。因此，牛肉膏为最佳氮源。
表 1 不同碳源对产酶量的影响
Table 1 Effect of carbon sources on the laccase production of Boletus
edulis U/ml
碳源
Carbon sources
菌丝球长势
Mycelial growth vigor
酶产量
Laccase production
葡萄糖 Glucose + + 17． 32 aA
蔗糖 Sucrose + + 16． 57 aA
麦芽糖 Maltose + 13． 56 bB
乳糖 Lactose + 11． 36 cBC
玉米粉 Corn flour + 9． 72 cCD
淀粉 Starch + 7． 56 dD
注:+表示菌丝体生长差;+ +表示菌丝体生长一般;+ + +表示菌丝
体生长旺盛;同列不同大小写字母分别表示差异极显著(P ＜
0． 01)和差异显著(P ＜0． 05)
Note:+ indicated the weak growth of mycelia;+ + indicated the ordina-
ry growth of mycelia;+ + + indicated the vigorous growth of myce-
lia． Different capital and lowercase letters in the same columns indi-
cated extremely significant difference at 0． 01 level and significant
difference at 0． 05 level respectively．
表 2 不同氮源对产酶量的影响
Table 2 Effect of nitrogen sources on the laccase production of Boletus
edulis U/ml
氮源
Nitrogen sources
菌丝球长势
Mycelial growth vigor
酶产量
Laccase production
牛肉膏 Beef extract + + + 25． 16 aA
蛋白胨 Peptone + + + 24． 13 aA
酵母膏 Yeast extract + + + 22． 66 aA
氯化铵 Ammonium chloride + + 17． 32 bB
硫酸铵 Ammonium sulfate + + 14． 78 bB
尿素 Urea + 8． 49 cC
注:+表示菌丝体生长差;+ +表示菌丝体生长一般;+ + +表示菌丝
体生长旺盛;同列不同大小写字母分别表示差异极显著(P ＜
0． 01)和差异显著(P ＜0． 05)
Note:+ indicated the weak growth of mycelia;+ + indicated the ordina-
ry growth of mycelia;+ + + indicated the vigorous growth of myce-
lia． Different capital and lowercase letters in the same columns indi-
cated extremely significant difference at 0． 01 level and significant
difference at 0． 05 level respectively．
2． 3 pH对产酶量的影响 由表 3 可知，pH为 4． 5 时，菌丝
体生长旺盛，菌丝球数量多、直径大、大小均匀，且产酶量大，
与其它 pH的酶产量均达到极显著差异;pH 为 5． 5、5． 0 和
6． 0时，菌丝球生长也较好，但酶产量均少于 pH为 4． 5 的，3
种 pH的酶产量之间达到显著差异;pH为 6． 5 和 7． 0 时，菌
丝球生长较慢，大小不均匀，小菌丝球多，大菌丝球少，酶产
量也低。因此，pH为 4． 5时最佳。
2． 4 温度对产酶量的影响 由表 4 可知，28 ℃下的菌丝体
生长最好，酶产量最大，其次是 26 ℃，2种温度的酶产量之间
达到显著差异。随着温度降低，菌丝体生长缓慢，酶产量也
减少，24和 22 ℃下的酶产量也达到显著差异。可见，从 28
到 22 ℃，菌丝球生长量及酶产量逐渐减少。30和 32 ℃下的
菌丝球酶产量也下降，且二者与其他温度的酶产量均达到了
极显著差异。因此，28 ℃为产酶的最佳温度。
表 3 不同 pH对产酶量的影响
Table 3 Effect of pH on the laccase production of Boletus edulis
U/ml
pH
菌丝球长势
Mycelial growth vigor
酶产量
laccase production
4． 5 + + + 64． 12 aA
5． 5 + + 58． 64 bB
5． 0 + + 55． 28 bcBC
6． 0 + + 53． 34 cC
6． 5 + 48． 41 dD
7． 0 + 47． 72 dD
注:+表示菌丝体生长差;+ +表示菌丝体生长一般;+ + +表示菌丝
体生长旺盛;同列不同大小写字母分别表示差异极显著(P ＜
0． 01)和差异显著(P ＜0． 05)
Note:+ indicated the weak growth of mycelia;+ + indicated the ordina-
ry growth of mycelia;+ + + indicated the vigorous growth of myce-
lia． Different capital and lowercase letters in the same columns indi-
cated extremely significant difference at 0． 01 level and significant
difference at 0． 05 level respectively．
表 4 不同温度对产酶量的影响
Table 4 Effect of temperature on the laccase production of Boletus
edulis U/ml
温度∥℃
Temperature
菌丝球长势
Mycelial growth vigor
酶产量
laccase production
28 + + + 63． 45 aA
26 + + 59． 00 bAB
24 + + 51． 05 cC
22 + + 46． 94 dCD
30 + 36． 47 eE
32 + 27． 34 fF
注:+表示菌丝体生长差;+ +表示菌丝体生长一般;+ + +表示菌丝
体生长旺盛;同列不同大小写字母分别表示差异极显著(P ＜
0． 01)和差异显著(P ＜0． 05)
Note:+ indicated the weak growth of mycelia;+ + indicated the ordina-
ry growth of mycelia;+ + + indicated the vigorous growth of myce-
lia． Different capital and lowercase letters in the same columns indi-
cated extremely significant difference at 0． 01 level and significant
difference at 0． 05 level respectively．
3 小结
(1)美味牛肝菌产漆酶的最适发酵条件为:葡萄糖
2． 0%，牛肉膏 0． 5%，KH2PO4 0． 4%，MgSO4·7H2O 0． 3%，微
量元素溶液8． 0%，维生素 B1 0． 003%，pH 4． 5，温度28 ℃，培
养时间为 8 d。此时菌丝体的生长速度最快，菌丝球数量多、
直径大、大小均匀，且酶产量最高，为 71． 27 U /ml。
(2)美味牛肝菌漆酶产量与菌丝球的生长有密切关系，
菌丝球生长较好时，酶产量也较高，但要进行工业化生产尚
需进一步研究。
参考文献
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