全 文 ：孙建富 ,陈尚珂 ,王爱英 ,等.新疆雪莲 DAD1基因提高烟草的抗旱性与抗盐性 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(4):84-86.
新疆雪莲 DAD1基因提高烟草的抗旱性与抗盐性
孙建富 , 陈尚珂 , 王爱英 , 祝建波
(石河子大学生命科学学院 /石河子大学农业生物技术重点实验室 ,新疆石河子 832003)
　　摘要:利用已构建好的 pCMBIA2301-35S-DAD1植物表达载体 , 利用叶盘法转化烟草获得转基因烟草植株。
在 PEG6000模拟干旱 、盐(NaCl)胁迫条件下 ,对转基因烟草的相对含水量 、脯氨酸 、丙二醛的含量进行测定分析。结
果表明:转基因烟草对干旱 、高盐的耐受性都有一定程度的提高。说明 DAD1衰老调节因子基因可以减缓烟草在逆境
条件下的衰老 ,提高了烟草的抗逆性。
　　关键词:DAD1 基因;转基因烟草;脯氨酸;丙二醛
　　中图分类号:S572.033　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)04-0084-03
收稿日期:2010-10-08
基金项目:国家转基因重大专项(编号:2008ZX08005-004)。
作者简介:孙建富(1985—),男 ,山西闻喜人 ,硕士研究生 , 主要从事
生物化学与分子生物学研究。 E-mail:sjf850319@sina.com。
通信作者:祝建波 , 博士 , 副研究员 ,主要从事植物基因工程研究。
Tel:(0993)2039660;E-mail:zjbshz@ 126.com。
　　程序性细胞死亡 (programmedcelldeath)是一种普遍存
在的 、主动的 、细胞自主控制的机制 ,在生物发育和病理过程
中起着重要作用 [ 1] 。一系列外在和内在的刺激都可以诱发
程序性细胞死亡 。动物形态学和生物化学特征方面的许多研
究表明 ,大部分程序性细胞死亡即是细胞凋亡。目前对动物
细胞凋亡遗传控制的研究主要集中在特定蛋白上 , p53蛋白
促进程序性细胞死亡 ,而 DAD1蛋白 、Bcl-2蛋白等抑制程序
性细胞死亡 。 DAD1是一种内源性细胞凋亡抑制基因 [ 2 ] ,最
早发现于对温度敏感的突变异种仓鼠细胞系 tsBN7中 ,仓鼠
细胞系因为缺失 DAD1蛋白而出现细胞凋亡 。 DAD1可以从
Bcl-2的下游发挥作用或者自主阻断细胞死亡 。人和线虫
DAD1的表达都能够抑制线虫中的一些程序性细胞死亡 。
DAD1是内质网内膜上糖基转移酶复合体的一个重要亚
基 [ 3 ] 。它是糖基转移酶执行功能和维持其结构必需的部分 ,
能维持细胞内正常水平的糖基化 。糖基转移酶催化粗面内质
网腔内甘露糖的寡聚糖转移到初生天冬酰胺酸基上 。 DAD1
蛋白功能异常或表达量过低会严重影响糖基转移酶的功能 ,
使细胞缺乏糖基化的蛋白质而引发细胞凋亡 。在人 、仓鼠 、爪
蟾 、线虫 、家鼠 、苹果 、拟南芥 、文昌鱼等动植物中已经克隆到
DAD1 [ 4 -7] 。
迄今为止 , DAD1基因是已发现的相关基因中最为保守
的基因之一 ,其功能是防止细胞凋亡的发生 [ 8] 。目前 ,在动
植物中均发现了高度同源的 DAD1基因 ,并且在植物中克隆
的 DAD1基因可抑制动物细胞的凋亡基因 ,并且发现其在拟
南芥的所有组织中均有表达 。目前 ,关于雪莲 DAD1基因在
雪莲细胞抗凋亡过程中的作用尚未见报道 。
本研究利用已构建好的天山雪莲 cDNA文库 ,采用通用
引物 M13扩增获得特异性基因序列 ,测序比对后为 DAD1基
因 。通过构建植物表达载体将 DAD1基因通过叶盘转化法转
至 NC89烟草中 ,并对 DAD1基因进行初步功能分析 。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌种 　含有 DAD1的植物表达载体 pCMBIA2301 -
35S-DAD1由陈尚珂构建并通过冻融法转化至根癌农杆菌
GV3101 ,由石河子大学农业生物技术重点实验室保存 。
1.1.2　烟草　烟草品种 NC89。
1.1.3　引物　DAD1上游引物:5′-CCATGGTACGGCCGGGG
ACTGTGATTTG-3′;DAD1下游引物:5′-GGTCACCCGCCAA
CGAATGGTCTAGAAAGCT-3′,由上海生物工程技术服务有限
公司合成 。
1.2　方法
1.2.1　转基因烟草的获得 　利用农杆菌介导通过叶盘法转
化烟草 NC89[9 ] 。
1.2.2　烟草总 DNA的提取　通过 SDS法从烟草叶片中提取
总 DNA[ 10] 。
1.2.3　烟草总 RNA的提取　利用 Trizol法提取转基因烟草
的总 RNA[ 11] 。
1.2.4　DAD1的扩增 　以烟草基因组 DNA为模板 , 利用
DAD1上游和下游引物扩增 DAD1。
1.2.5　PCR反应体系 　10 ×PCRbufer2.0 μL, dNTPs
(各 2.5 mmol/L)0.5μL, MgCl2 (25mmol/L)1.0μL,上 、下游
引物(各 25μmol/L)各 0.5 μL,模板 DNA0.5 μL, TaqDNA
聚合酶(2.5U/μL)0.5 μL,总体系 20.0 μL。反应程序为:
94 ℃预变性 5min;94℃变性 30s, 50℃复性 30s, 72℃延伸
45 s, 30个循环;72℃保温 7 min。 PCR产物用 1%琼脂糖凝
胶电泳 ,结果在 256 bp处出现 DNA片段。
1.3　处理方法
(1)PEG6000模拟干旱处理:将转基因烟草与野生型材
料的长势(高度 、叶片数目等)大致相同的植株分别用 0(对
照)、5%、10%、15%、20%、25% PEG6000处理 , PEG6000全
部用水配制;处理 10 d后开始抗早性指标的测定 ,每处理
3个重复 。(2)NaCl模拟盐胁迫处理:试验设盐分胁迫浓度为
100、200、300mmol/LNaCl和清水 4个处理;处理 10d后开始
抗逆性指标的测定 ,每处理 3个重复 。
1.4　生理指标测定方法
相对含水量的测定见参考文献 [ 12] ;不同处理烟草的脯
—84— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 4期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.04.123
氨酸含量利用茚三酮法测定 [13] ;不同处理烟草的丙二醛含量
利用硫代巴比妥法测定 [ 14 ] 。
2　结果与分析
2.1　转基因烟草的鉴定
当烟草生长成完整植株以后 ,使用 SDS法提取其基因组
DNA,并设计检测引物对其进行 PCR检测 ,以筛选外源基因
整合进入基因组中的烟草植株。 PCR产物经电泳后在 256bp
处出现了特异性条带(图 1),证明目的基因 DAD1已经转化
进入受体烟草植株 。
利用 Trizol试剂提取经过检测为阳性的烟草植株 RNA,
进行 RT-PCR检测 , PCR产物经过电泳以后 ,出现了大小为
256bp的目的条带(图 2),说明目的基因 DAD1在受体烟草
体内得到了转录 。
2.2　转基因烟草的生理指标分析
2.2.1　逆境处理对转 DAD1基因烟草叶片相对含水量的影
响　转基因烟草和野生型烟草经 5%、10%、15%、20%、25%
的 PEG6000模拟干旱胁迫 10 d后 ,测定组织的相对含水量 。
分析发现 ,野生型烟草的相对含水量低于转基因烟草的相对
含水量(图 3)。这说明 ,转 DAD1基因烟草在轻度的干旱胁
迫下具有一定的抗旱能力 。
转基因烟草和野生型烟草经 100、200、300 mmol/LNaCl
胁迫 10 d后 ,测定组织的相对含水量。分析发现 ,野生型烟
草的相对含水量低于转基因烟草的相对含水量(图 4)。这说
明 ,转 DAD1基因烟草在一定程度的盐胁迫下具有一定的抗
逆能力 。
2.2.2　逆境处理对转 DAD1基因烟草 MDA含量的影响　
MDA是膜脂过氧化的产物之一 ,其含量可以表示脂质过氧化
的程度 。经不同浓度 PEG6000处理的野生型烟草和转基因
烟草与对照处理相比 , MDA的含量均有所提高 ,而且野生型
烟草比转基因烟草 MDA含量提高快 ,转基因植株中 MDA含
量在不同浓度 PEG6000的胁迫下上升较为缓慢 (图 5)。野
生型烟草比转基因烟草的 MDA含量增加大 ,说明野生型植
株膜脂的过氧化程度相对较高 。
从图 6中可以看出 ,烟草在不同浓度 NaCl处理下 , MDA
含量变化差别较大 。野生型烟草的 MDA含量相对对照处理
分别提高了 27.3%、100%、136.4%;而转基因烟草 MDA含
量在不同浓度 NaCl处理下变化不大 , 300 mmol/LNaCl处理
下 MDA含量比对照处理只提高了 62.3%。说明转 DAD1基
因烟草的膜脂过氧化受伤程度比野生型烟草低 ,具有一定抗
盐胁迫的能力 。
—85—孙建富等:新疆雪莲 DAD1基因提高烟草的抗旱性与抗盐性
2.2.3　逆境处理对转 DAD1基因烟草组织脯氨酸含量的影
响　脯氨酸是植物细胞中重要而有效的有机渗透调节物质 ,
几乎所有的逆境都会引起植物体内脯氨酸的积累 ,尤其是在
干旱胁迫条件下 ,是衡量植物抗逆性强弱的指标之一 。从图
7中可以看出 ,无胁迫时 ,转基因烟草和野生型烟草中脯氨酸
含量几乎没有差别 。随着 PEG6000浓度的增加 ,野生型烟草
和转基因烟草中的脯氨酸含量都呈上升趋势 , 20%PEG6000
处理上升最快 。 20%PEG6000和 25%PEG6000处理下 ,转基
因烟草中的脯氨酸含量比野生型烟草分别低 21.4%和 22.
5%。说明转 DAD1基因烟草在轻度的干旱胁迫下 ,具有一定
的抗旱能力 。
　　转基因烟草和野生型烟草经 100、200、300 mmol/LNaCl
胁迫 10 d后 ,测定组织的脯氨酸 。分析发现 ,野生型烟草的
脯氨酸含量高于转基因烟草(图 8)。这说明转 DAD1基因烟
草具有一定的抗盐能力 。
3　结论与讨论
3.1　DAD1与植物的抗旱性
植物在干旱条件下 ,形态结构发生变化 ,表现为植物体较
矮小 、根系发达 、叶片细窄或多毛刺 、气孔内陷等 ,且细胞质中
有机物质含量较高 ,细胞水势较低 。同时 ,植物体会发生一些
生理变化 ,积累渗透调节物质是一种普遍的现象 。活性氧的
大量积累能导致蛋白质变性 , DNA碱基突变 ,并可使 Calvin
循环中的一些光激活酶失活 ,从而对植物体产生伤害 。
本研究中 , 野生型及转 DAD1 烟草经 5%、 10%、15%、
20%、25%PEG6000处理 ,转基因烟草 MDA的含量低于野生
型烟草 ,而植株的含水量高于野生烟草 , PRO含量低于野生
型烟草 ,提高了细胞内细胞质的渗透压 ,防止细胞失水 。说明
利用基因工程的手段将 DAD1导入烟草 ,提高了转基因烟草
的抗旱性 ,减轻了干旱对烟草本身的伤害 。
3.2　DAD1与植物的抗盐性
盐渍环境对植物主要产生 2种胁迫:一是高离子浓度造
成的渗透胁迫 ,使植物吸水困难 ,甚至使细胞脱水;二是离子
本身产生的离子毒害 ,影响植物的正常生理代谢 ,盐分胁迫抑
制植物的光合作用 ,并且对植物的呼吸作用有影响 。如今 ,利
用遗传工程培育耐盐品种越来越受到人们的关注 。
本试验中 ,转 DAD1及野生型烟草经过 NaCl处理 ,转基
因烟草 MDA的含量低于野生型烟草 ,含水量高于野生烟草 ,
提高了细胞内细胞质的渗透压 ,防止细胞失水 。说明转
DAD1基因提高了植物的抗盐性 。
综上所述 ,转 DAD1基因烟草在盐 、干旱胁迫中均表现出
了一定的耐受性 ,但是较之特异抗逆性 (如专门抗寒或抗旱
的基因),其效果不是特别明显 。可能是由于 DAD1为防御
细胞凋亡的因子 ,对提高转基因植物的抗逆性有一定作用 ,但
涉及到专一逆境时 ,其抗逆能力不如抗专一逆境的基因明显 。
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