全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 731
新疆雪莲新的内切几丁质酶类冷诱导基因的分离、克隆和测序
李璐 王晓军* 赵安民
中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐830011
提要 通过RT-PCR技术，从经低温驯化的新疆雪莲的叶片中分离克隆了1个新的基因。实验证明，此基因的转录是由
低温诱导激活，且随着雪莲低温驯化时间的推移，转录本的量明显增加。测序结果显示，此基因全长643 bp，编码200
个氨基酸。序列分析发现，此基因属于Ⅱ类内切几丁质酶基因。初步预测此基因的编码产物可能具有抗冻活性。
关键词 新疆雪莲；冷诱导基因；Ⅱ类内切几丁质酶类基因；抗冻活性
Isolation, Molecular-cloning and Sequencing of a New Cold-responsive
Endochitinase Gene in Saussurea involucrata Kar. et Kir.
LI Lu, WANG Xiao-Jun*, ZHAO An-Min
Xinjiang Technical Institute of Physics & Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China
Abstract A new gene was isolated from cold-acclimated Saussurea involucrata Kar. et Kir. leaves by RT-PCR.
Our experiment showed that this gene was induced by low temperature and there was an increase in the level of
its transcript during cold acclimation. This gene is 643 bp in length and the predicted open reading frame
contains 200 amino acids. Sequence comparisons between this gene and other plants’ chitinase genes at the
nucleotide level and at the amino acid level revealed that it encodes a class II endochitinase. Moreover, the
predicted product of this gene maybe has antifreeze activity.
Key words Saussurea involucrata Kar. et Kir.; cold-responsive gene; class II endochitinase gene; antifreeze
activity
收稿 2004-12-29修定 　2005-10-11
*通讯作者(E-mail: lhskj@ms.xjb.ac.cn)。
抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)是存在于许
多抗冻生物中的高效抗冻生物活性物质。这些蛋
白的特性表现为都具有“热滞”活性，能降低
冰点温度而对熔点温度没有影响，从而导致溶液
的熔点和冰点之间出现差值，这种差值就是热滞
活性(thermal hysteresis activity, THA)。这种热滞
活性导致AFP吸附在冰核表面而抑制冰晶生长。
而且，当温度降到溶液冰点以下时，AFP能影响
冰晶的形状并抑制重结晶。鱼类的AFP研究较
早，昆虫中也发现了比鱼类AFP活性更高的不含
糖的AFP，也称热滞蛋白(thermal hysteresis
protein, THP)。在植物中也存在冷诱导蛋白，它
与鱼类和昆虫AFP的性质有不少是类似的，因此
人们认为也是一种AFP[1,2]。它们也具有热滞活
性，并已在包括双子叶植物和单子叶植物在内的
20多种经低温锻炼的植物细胞液中检测到[2]。
Hon等[3]在经低温驯化后的冬小麦的原生质
体中发现一种分子量为35 kD的蛋白，经分离纯
化后发现其既具有内切几丁质酶活性又具有抗冻活
性，因此证明此蛋白是具有双重功能的酶。在其
他一些植物体，如黑麦、马铃薯和胡萝卜中也发
现这种低温诱发的病理蛋白[3~5]。但Hiilovaara-
Teijo等[6]发现，冬小麦在常温环境中进行真菌感
染后，同样能产生一些内切几丁质酶，但这种内
切几丁质酶没有抗冻活性。Yeh等[7]研究证实，由
低温诱发的内切几丁质酶病理蛋白是一类AFP家
族，而单纯由真菌感染诱发的内切几丁质酶则属
于另一类蛋白质家族。
新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir.)别
名雪荷花，其种子能在0℃发芽，3~5℃下生长，
幼苗能耐受 -20℃的严寒，其体内必然存在某种
抗冻机制。在寻找新的抗冻诱导或抗冻基因的工
作中，我们将研究主要集中在内切几丁质酶类抗
冻基因上。通过选取黑小麦的内切几丁质酶类抗
冻基因CHT9 (GenBank accession no. AF280437)的
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2005.06.008
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月732
序列作对照设计引物，从经低温驯化的新疆雪莲
的叶片中分离了1个新的基因XCH (Xin chitinase)。
实验证明，此基因是一类冷诱导基因，在雪莲冷
驯化较长一段时间后，可检测到此基因转录本的
存在，且其转录本的量与雪莲冷驯化时间明显存
在正比例关系。进一步进行序列分析表明，XCH
基因属于Ⅱ类内切几丁质酶类基因，初步预测其
编码产物可能具有抗冻活性。
材料与方法
收购新疆巴里昆雪莲(Saussurea involucrata
Kar. et Kir.)种子放在25℃、光强20 mmol·m-2·s-1、
光照8 h·d-1的条件下培养成雪莲幼苗。经典总
RNA抽提试剂盒、M-MuLV逆转录酶、Taq DNA
聚合酶、Silver Beads DNA胶回收试剂盒、限制
性内切酶EcoRI和BamHIII、T4连接酶以及DNA
分子量标准均购自Sangon公司；引物由引物设计
Primer 3.0协助设计，由Sangon公司合成；菌株
大肠杆菌DH5a以及质粒pUC18由中国科学院新疆
理化技术研究所生化实验室提供；DNA测序由
Sangon公司完成。
将雪莲幼苗分为非低温驯化植物(简称NA)和
低温驯化植物(简称CA)两组。NA组继续于常温
25℃环境下培养；CA组转入5℃/2℃(白天/黑夜)
和光照8 h·d-1的环境中，划分为CA1、CA2、CA3
和CA4组，分别继续培养1、3、5和8周。
按经典总RNA抽提试剂盒的说明方法，分别
对不同组的雪莲叶片提取总RNA，乙醇沉淀于-20℃
下储存备用。
按下列反应条件进行cDNA第一链的合成以
获得PCR反应模板：2 mg总RNA、0.5 mg oligo
(dT)18，DEPC-H2O加至总体积为11 mL。置于75℃
水浴中温育5 min后迅速于冰上冷却。再在上述
反应管中加入4 mL 5×酶反应缓冲液、2 mL 10
mmol·L-1 4种dNTP混合液、20 U RNase抑制剂，
再加DEPC-H2O至总体积为19 mL。置于37℃水
浴中温育5 min后，在反应管中加入200 U的M-
MuLV逆转录酶，于42℃水浴中反应60 min后停
止反应，将反应管于70℃水浴中温育10 min后迅
速于冰上冷却。
引物设计为：P1，5 TTAAGGATCCGGA-
GCAGTGCGGCTCGCANGGC 3; P2, 5 GGTTG-
AATTCTGACTATGCGAACGGCCTCNTG 3。再
按下列反应条件进行PCR扩增反应：(1)反应液中
含10 ng模板、5 mL 10×PCR反应缓冲液、3 mL
25 mmol·L-1 MgCl2、1 mL 10 mmol·L-1 4种dNTP
混合液、0.8 mL 20 mmol·L-1引物P1、0.8 mL 20
mmol·L-1引物P2、1.5 U Taq酶，加去离子水至
总体积为50 mL。(2)反应程序为：94℃ 4 min预
变性；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1.5 min，
35个循环；72℃延伸8 min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳、回收目的条
带，连接到pUC18质粒载体上，转化大肠杆菌 DH5a
细胞，经酶切鉴定后，对目的基因进行测序。
序列分析用Blastx进行同源性分析；用
GentyxMAC软件对该基因的开放阅读框、保守性
氨基酸序列进行分析。
实验结果
1 雪莲冷驯化
CA组雪莲在放入低温环境1周后，与NA组
雪莲相比，叶片明显较绿、较厚；在放入低温
环境3周后，叶片脆，易破裂。CA组雪莲在放
入低温环境4周后开始长出新的叶片，此新的叶
片在雪莲继续低温驯化5周甚至8周时仍然存活，
而原先的叶片这时已经枯萎死亡(图1)。
2 RT-PCR结果
对低温驯化8周(CA4组)的雪莲叶片进行RT-
PCR，电泳结果显示，在600 bp处出现1条清晰
的条带(图2)。对NA组、CA1组和CA2组雪莲叶
片的RNA以同样反应条件分别进行RT-PCR，电
泳检测均未见扩增条带。而对CA3组雪莲进行RT-
PCR时，在600 bp处出现1条扩增条带。进一
步比较CA3组和CA4组雪莲叶片RT-PCR的电泳结
果发现，在电泳上样量相同的情况下，CA4组雪
莲叶片RT-PCR产物条带亮度明显大于CA3组雪莲
(图3)。
3 目的基因测序与序列分析
RT-PCR产物经回收、克隆、测序得到基因
序列(图4)。此基因简称为XCH，全长643 bp。
通过软件DNAssist 2.2分析预测，其开放式阅读
框包含200个氨基酸，5端下游37 bp处是起始
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 733
度同源性，尤其是N端32个氨基酸的同源性达
84.7%(图6)。
讨 论
1 XCH为一类冷诱导基因
RT-PCR反应的结果可以定性反映基因在植物
体内某一特定时间内转录表达的水平。本实验结
果显示，XCH基因在雪莲未经低温诱导时不转录
表达；而当雪莲低温驯化5周时，可以检测到
XCH基因转录本的存在。可见，XCH基因在植
物体中的转录是由低温诱导激活的。在低温驯化
1和3周的雪莲叶片中检测不到XCH基因转录本的
存在，而在低温驯化8周的雪莲叶片中XCH基因
转录本的水平明显高于5周的水平，XCH基因的
表达水平与雪莲低温驯化时间存在正比例的关系，
此基因是一类低温相关基因。而只有在低温驯化
达5周以上的雪莲叶片中才能检测到XCH转录本
的结果，说明此基因需长期低温诱导才可以检测
到。这可能是由于低温驯化5周后此基因才开始
被激活转录，也可能是因为随着低温诱导达5周
时此基因转录本稳定性逐渐增强以至能检测到。
总之，实验表明XCH是一类冷诱导基因。
2 XCH是Ⅱ类内切几丁质酶类基因
植物的内切几丁质酶至少分4类[7]。Ⅰ类几
丁质酶包括3个部分：富含半胱氨酸的结合区、
富含脯氨酸的铰链区和高保守的催化区；Ⅱ类几
丁质酶与Ⅰ类相比缺少结合区与铰链区，但其催
化区与Ⅰ类高度一致；Ⅲ类几丁质酶无结合区，
图1 低温驯化5周和8周的雪莲苗
Fig.1 S. involucrata cold acclimated for 5 and 8 weeks
a：低温驯化5周的雪莲；b：低温驯化8周的雪莲。
图2 低温驯化8周的雪莲RT-PCR产物的电泳分析
Fig.2 Electrophoresis analysis of RT-PCR products from the
leaves of 8-week cold acclimated S. involu rat
图3 CA3组和CA4组雪莲叶片RT-PCR产物的电泳分析
Fig.3 Electrophoresis analysis of RT-PCR products from
the leaves of S. involucrata grown under cold-
acclimations for 5 and 8 weeks
a：CA3组，低温驯化5周的雪莲；b：CA4组，冷驯化
8周的雪莲。上样量均为20 mL。
密码子ATG，距起始密码子600 bp处是终止密码
子。 通过与黑小麦几丁质酶类抗冻基因CHT9核
酸序列比对，两者相似程度达60.5%(图5)。
CHT9与XCH编码的氨基酸序列比对的结果
显示，XCH缺失富含半胱氨酸的区段和富含脯氨
酸的区段，但与CHT9的高保守的催化区具有高
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月734
催化区与Ⅰ类一致的也较少；Ⅳ类几丁质酶具有
富含半胱氨酸的结合区，但保守的催化区一致性
较差。根据以上特征以及序列分析的结果可知
XCH基因是Ⅱ类内切几丁质酶类基因。
Hon等[3]总结自己以及他人的研究发现，凡
是具有抗冻活性的内切几丁质酶，其N端32个氨
基酸序列是高度保守一致的，而无抗冻活性的内
切几丁质酶此段的氨基酸序列的相似性较差。从
由CHT9与XCH所编码的氨基酸序列来看，XCH
与CHT9的高保守的催化区具有高度相似性，尤
其是N端的32个氨基酸与经典的Ⅰ类内切几丁质
酶类抗冻蛋白的N端32个氨基酸[3]具有84.7%的
相似性，初步证明此基因编码的Ⅱ类内切几丁质
酶可能具有抗冻活性。
3 雪莲低温驯化过程中的现象讨论
在对雪莲低温驯化过程中，雪莲在常温下已
存在，后被转入低温环境驯化的叶片(简称CW叶
片)在低温驯化5~8周时逐渐枯萎死亡。而在雪莲
低温驯化4周后，在低温环境中会长出新的叶片
(简称DW叶片)，此新叶在雪莲低温驯化8周时仍
然存活。这表明两种不同环境下长成的叶片在接
受低温驯化时，其耐受低温伤害的能力是不一样
的。DW叶片可能因某种CW叶片不存在的抗冻
机制而延缓死亡。到底是什么样的机制使两类叶
片存在如此大的差异，目前还不清楚。但实验显
示，只有在低温驯化达5周以上的雪莲叶片中才
能检测到XCH转录本，而低温驯化1和3周的雪
莲叶片中XCH基因转录本不存在；低温驯化1和
3周的雪莲叶片正是CW叶片，而雪莲低温驯化达
5周以上时CW叶片均已死亡，实验检测的叶片正
是DW叶片。也就是说，XCH转录本只存在于
DW叶片中。由此推测，可能是由于某些冷诱导
图4 XCH核苷酸以及预测氨基酸序列
Fig.4 The nucleotide and predicted amino acid sequences of XCH
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 735
图5 XCH与CHT9核酸序列比对
Fig.5 Pairwise alignment of nucleotide sequences of XCH and CHT9
灰色表示相同区域。
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月736
基因只被定向运输到DW叶片中，造成了DW叶
片比CW叶片更加耐寒。这种定向运输可能是低
温环境中生成的叶片与常温下生成的叶片相比，
在某些方面发生改变的原因，这种改变可能是叶
片细胞液pH等环境改变，也可能是叶片细胞膜上
某个载体蛋白结构或性质的改变从而更易于识别抗
冻蛋白的信号肽。具体是什么原因，有待进一步
研究。
参考文献
1 Urrutia ME, Duman JG, Knight CA. Plant thermal hyster-
esis proteins. Biochim Biophys Acta, 1992, 1121: 199~206
2 Griffith M, Antikainen M, Hon W-C et al. Antifreeze pro-
teins in winter rye. Physiol Plant, 1997, 100: 327~332
3 Hon WC, Griffith M, Mlynarz A et al. Antifreeze proteins in
winter rye are similar to pathogenesis-related proteins. Plant
Physiol, 1995, 109: 879~889
4 Zhu B, Chen THH, Li PH. Expression of an ABA-respon-
sive osmotin-like gene during induction of freezing toler-
ance in Solanum commersonii. Plant Mol Biol, 1993, 21:
729~735
5 Gatschet MJ, Taliaferro CM, Porter DR et al. A cold-regu-
lated protein from bermuda grass crowns is a chitinase. Crop
Sci, 1996, 36: 712~718
6 Hiilovaara-Teijo M, Hannukkala A, Griffith M et al. Snow
mold-induced apoplastic protein in winter rye leaves lack
antifreeze activity. Plant Physiol, 1999, 121: 665~674
7 Yeh S, Moffatt BA, Griffith M et al. Chitinase genes respon-
sive to cold encode antifreeze proteins in winter cereals.
Plant Physiol, 2000, 124: 1251~1264
图6 CHT9与XCH预测氨基酸序列比对
Fig.6 Sequence alignment of predicted amino acid sequences for XCH and CHT9
深灰底色表示完全相同，浅灰底色表示同源。