全 文 ：新疆软紫草提取物抗 HIV-1体外活性研究(Ⅰ)＊
买尔旦·马合木提1 ,2＊＊ , 贺金华2 , 古丽仙·胡加1＊＊＊
(新疆医科大学1附属肿瘤医院 , 2药学院 , 新疆　乌鲁木齐　830011)
摘要:目的:研究新疆紫草水溶性提取物抗 H IV-1 体外活性 。方法:新疆软紫草干燥根 , 先用正己烷脱脂
后 ,再用丙酮水溶液提取 , 水溶部分分别用乙酸乙酯和正丁醇除去中强极性成分 , 余下的水溶液层经过 MCI-GEL
CHP20P 、Sephadex LH-20 分离 ,用甲醇-水洗脱 ,得 4 个提取组分(Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ和 Ⅳ)。将该组分分别与 M T-2 细胞 、
HIV-1 ⅢB共培养 , 采用 M TT 染色法 , 观察对 H IV-1 感染细胞的保护作用和对 MT-2 细胞的毒性作用。结果:
组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ 、 Ⅳ对 HIV-1 感染 MT-2 细胞的50%有效浓度(EC50)分别 5.0 、10.0 、2.8 和 6.3μg/ ml , 50%抑制细
胞生长浓度(TC50)为 640 、160、180 和 400μg/ ml , 治疗指数(SI)为 128 、16、64 和 63。结论:新疆紫草水溶性提取
物对 HIV-1 感染 M T-2 细胞具有保护作用 ,同时对正常细胞也有一定的毒性 , 组分Ⅲ活性最强 , Ⅱ毒性最强 ,值得
进一步研究。
关键词:新疆紫草;抗 H IV;M TT 染色法
中图分类号:R93;R978.7;R969.4　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5551(2009)04-0374-04
Study on anti-HIV-1 activity of extracts from Arnebia Euchroma
(Royle)Johnst in vitro
Maierdan· Mahemuti , HE Jin-hua , Gulixian·Hujia
(Aff i liated Tumor Hospi tal , X inj iang Medical Universi ty , Urumqi 830011 , China)
Absrtact:Objective:To study the H IV-1 inhibitory effect of Arnebia euchroma (Roy le)Johnst.water so l-
uble ext racts in vitro.Methods:T he dried radix o f herbs we re degreased by hexane f irstly , then ex t racted
wi th ace tone.From the po rtion of w ater layer the middle and st rong polarity ingredients w ere removed by
ext ract ing w ith ethy lacetate and butanole respectively .The four w ater soluble ing redients(Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ and
Ⅳ)were isolated f rom aqua remainder , which through the MCI-GEL CHP20P , Sephadex LH-20 colunm
in order by w ashing w ith M eOH-wateras solvent.The protective ef fect to H IV-1 infected M T-2 cells and
the to xic ef fects to normal cells w ere observed culturing the samples w ith M T-2 cells and HIV-1 ⅢB , as-
sayed w ith M TT me thod.Results:The EC50 value of Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ and Ⅳ to H IV-1 infected M T-2 cells w ere
5 , 10 , 2.8 and 6.3μg/ml , TC50 we re 640 , 160 , 180 and 400μg/ml , SI w ere 128 , 16 , 64 and 63 , respec-
tively.Conclusion:The w ater soluble ex tracts of Arnebia euchroma (Roy le)Johnst show ed pro tective
ef fect to H IV-1 infected M T-2 cel ls but certain to xic ef fect to normal cells simul taneously in vi tro.The
fraction Ⅲ and Ⅱwas to be the most ef fective and toxic one respectively , it w ill be w orthy of further study.
Key words:Arnebia euchroma (Roy le)Johnst;anti H IV-1;MT T assay
　　紫草最早见于《神农本草经》 ,中国古代一直以
硬 紫 草 (Lithospermum ery throrhizonS ieb. et
Zucc .)为药用。1990年以后的《中华人民共和国药
典》中收录了紫草科(Bo raginaceae)3种植物 ,即软
紫草属 (Arnebia Forsk .)的新疆紫草 [(Arnebia
euchroma (Roy le) Johnst.)] 、 内 蒙 古 紫 草
(Arnebia gutata B unge)或紫草 (Li thos permum
ery throrhizon S ieb.et Z ucc.)。在这几种紫草中新
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基金项目:新疆维吾尔自治区地方病分子生物学重点实验室开放课题(编号:XJDX0208-2006-01);新疆维吾尔自治区高校科研计划科
学研究重点项目(编号:XJEDU2004I25)
作者简介:买尔旦·马合木提(1960-),男(维吾尔族),主任药师 ,硕士生导师 ,研究方向:中药民族药开发。
通讯作者:古丽仙·胡加(1962-),女(维吾尔族),副主任中药师 ,研究方向:中药学基础 , E-mail:gulixian 0919@hotm ail.com。
疆紫草品质最佳 ,目前新疆紫草已成为主要的商品
紫草[ 1] 。有关新疆紫草脂溶性成分———萘醌类化合
物的研究有大量的文献报道[ 2-3] 。近年来对其水溶
性成分 ———酚酸类的抗病毒研究也已引起关注 。
Makoto 等[ 4-6]对内蒙古紫草进行了抗 HIV 的研
究 ,国内谢长才等[ 7] 研究证明新疆紫草水提取物对
Ⅱ型疱疹病毒具有明显抑制和灭活作用。在此基础
上 ,我们从新疆软紫草根中提取分离得到了 4个水溶
性组分(Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ及 Ⅳ),在 MT-2细胞系用这些组分
进行了初步的体外抗 HIV药效研究 ,现报道如下 。
1　资料与方法
1.1　实验仪器与材料　冷冻干燥机(美国 Edw ards
Pirani 1001), LP400全自动酶标仪(法国), DK-S26
型电热恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司),
RE-52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),单盘
光电分析天平(北京光学仪器厂 , d:0.01mg),MCL-
GEL CHP20P(日本三菱公司), Sephadex LH-20
(安发玛西亚生物技术有限公司),反相薄层层析板
(德国 Merch Ltd , RP-F254S),丙酮 、正己烷 、乙酸
乙酯 、正丁醇 、甲醇 、甲酸为分析纯 ,实验用植物为新
疆软紫草的干燥根(新疆参茸药业有限公司 ,批号:
20050102),由新疆医科大学药学院生药/天然药物
化学教研室鉴定 。人免疫缺陷病毒 1型标准病毒株
HIV-1 ⅢB(病毒滴度:49%),正常人 T 淋巴细胞传
代细胞株 MT-2 ,正常人外周血单核细胞 PBMC (美
国Duke大学提供),微量全血培养法培养。培养液
由培养基 RPM I 加入 1%L-谷氨酰胺 、10%胎牛血
清 、庆大霉素(100 单位/ml)组成 。细胞混悬液用培
养液调节细胞计数至 2 ×105/ml。齐多夫定
Zidovudine ,AZT , 葛兰素史克公司)。
1.2　实验方法
1.2.1　紫草提取物的制备　采自新疆地区的新疆
软紫草干燥根 ,粉碎 ,用正己烷脱脂 ,药材凉干。取
脱脂后的药材适量 ,用 70%丙酮水溶液反复回流提
取 ,合并 、回收丙酮。水溶液层浓缩后 ,依次用乙酸
乙酯和正丁醇多次萃取后 ,取水溶液层 ,冷冻干燥 ,
得干燥物(得率 35% ～ 41%)。取该干燥物 , 经
MCI-G EL CHP20P 柱 ,用不同浓度的甲醇水梯度
洗脱 ,得 4个流份 ,浓缩干燥溶解后 ,分别经 Sepha-
dex LH-20 ,用不同浓度的甲醇水进一步分离 ,得提
取物 Ⅰ 、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ, 得率分别为 1.28%、2.80%、
2.32%、1.73%。
1.2.2　对 HIV-1感染细胞的保护作用　于 96孔
板中每孔加入培养液 50μl经过 DMSO助溶并稀释
的样品 ,样品共做 8 个稀释度 ,相互之间为 2倍 ,加
入 50 μl稀释的 HIV-ⅢB 病毒液 ,再加入 MT-2细
胞混悬液(细胞计数调节至 2×105/ml 左右)100
μl。每实验组设 3个复孔 ,同时设正常细胞对照 、病
毒对照及阳性药物对照孔。于 37℃ CO 2 培养箱中
培养 ,培养结束时 ,至第 6天 MTT 法细胞染色 ,溶
解 ,放置 6 ～ 7 h ,用酶标仪于550 nm 处测定OD值 ,
计算细胞存活率 。细胞存活率(%)=(实验孔 OD
值-HIV 感染对照孔 OD值)/(细胞对照孔 OD值
-HIV 感染对照孔 OD值)×100%
1.2.3　对 MT-2细胞的毒性作用　于 96孔板中每
孔加入培养液 , 50 μl经过 DMSO 助溶并稀释的样
品 ,样品共做 8个稀释度 ,相互之间为 2倍 ,再加入
MT-2细胞混悬液100μl。每实验组设 3个复孔 ,同
时设细胞 、病毒 、阳性药物对照孔。于 37℃CO 2 培
养箱中培养 ,培养结束时 ,至第 7天 MTT 法细胞染
色 ,溶解 ,放置 6 ～ 7 h ,用酶标仪于 550 nm 处测定
OD值 ,计算细胞抑制率 。细胞抑制率(%)=(实验
孔 OD值-HIV感染对照孔 OD值)/(细胞对照孔
OD值-HIV感染对照孔 OD值)×100%
2　结果
2.1　对 HIV-1感染细胞的保护作用和对细胞的毒
性作用　不同浓度的样品 Ⅰ对 HIV-1 感染细胞具
有一定的保护作用 ,当药物浓度在 5.0 μg/ml及以
上时 ,样品Ⅰ对 HIV-1 感染细胞的保护率>50%。
药物的浓度与细胞保护率呈量效关系 。同时也有一
定的细胞毒性 , 毒性大于 50%的最小浓度为 5.0
μg/ml(表 1)。
表 1　样品Ⅰ对感染细胞的保护作用和对 MT-2 细胞的毒性作用
培养 6 d时对感染细胞的保护作用
药物浓度(μg/ml) OD 值( x ±s) 保护率(%)
培养 7 d时对 M T-2细胞的毒性作用
药物浓度(μg/ml) OD值( x ±s) 保护率(%)
320.0 0.875±0.11 142.3 640.0 0.646±0.08 80.3
160.0 0.968±0.03 167.9 320.0 0.714±0.10 90.7
80.0 0.844±0.12 134.1 160.0 0.834±0.08 109.0
40.0 0.729±0.03 104.0 80.0 0.831±0.05 108.5
20.0 0.530±0.17 51.0 40.0 0.821±0.04 107.1
10.0 0.748±0.02 109.2 20.0 0.812±0.09 105.6
　5.0 0.592±0.05 68.2 10.0 1.320±0.01 183.1
　2.5 0.379±0.01 11.1 　5.0 1.120±0.04 153.0
细胞对照 0.720±0.10 细胞对照 0.780±0.20
病毒对照 0.380±0.07 病毒对照 0.120±0.01
375新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 Apr., 32(4)
　　不同浓度的样品 Ⅱ对 HIV-1感染细胞具有一
定的保护作用 ,保护率大于 50%的最小浓度为 10.0
μg/ml ,同时也有一定的细胞毒性 ,毒性大于 50%的
最小浓度为 5.0 μg/ml(表 2)。不同浓度的样品 Ⅲ
对 HIV-1感染细胞具有一定的保护作用 ,保护率大
于 50%的最小浓度为 2.8 μg/ml ,浓度大于180.0
μg/ml时 ,作用不再增大 ,细胞毒性较 Ⅰ 、Ⅱ小(表
3)。不同浓度的样品Ⅳ对 HIV-1 感染细胞具有一
定的保护作用 ,保护率大于 50%的最小浓度为 6.3
μg/ml ,浓度大于 200.0 μg/ml 时 ,作用不再增大。
毒性大于 50%的最小浓度为 6.3μg/ml(表 4)。
表 2　样品Ⅱ对感染细胞的保护作用和对 MT-2 细胞的毒性作用
培养 6 d时对感染细胞的保护作用
药物浓度(μg/ml) OD 值( x ±s) 保护率(%)
培养 7 d时对 M T-2细胞的毒性作用
药物浓度(μg/ml) OD值( x ±s) 保护率(%)
320.0 0.546±0.03 55.3 640.0 0.192±0.03 11.0
160.0 0.782±0.10 117.7 320.0 0.297±0.03 26.9
80.0 0.865±0.07 139.7 160.0 0.469±0.00 53.3
40.0 0.779±0.14 116.9 80.0 0.648±0.02 80.6
20.0 0.402±0.11 17.2 40.0 0.714±0.02 90.6
10.0 0.547±0.05 55.6 20.0 0.759±0.04 97.5
　5.0 0.382±0.05 11.9 10.0 1.311±0.03 181.6
　2.5 0.219±0.04 　0.0 　5.0 1.050±0.07 142.6
细胞对照 0.280±0.10 细胞对照 0.780±0.20
病毒对照 0.380±0.07 病毒对照 0.120±0.01
表 3　样品Ⅲ对感染细胞的保护作用和对 MT-2 细胞的毒性作用
培养 6 d时对感染细胞的保护作用
药物浓度(μg/ml) OD 值( x ±s) 保护率(%)
培养 7 d时对 M T-2细胞的毒性作用
药物浓度(μg/ml) OD值( x ±s) 保护率(%)
360.0 0.379±0.02 11.1 720.0 0.130±0.00 　1.6
180.0 0.816±0.11 126.7 360.0 0.330±0.02 32.1
90.0 0.984±0.00 171.1 180.0 0.570±0.04 68.7
45.0 1.00±0.16 177.1 90.0 0.685±0.02 86.2
22.5 0.718±0.21 100.8 45.0 0.711±0.02 90.6
11.2 0.905±0.05 150.4 22.5 0.759±0.04 90.2
　5.6 0.714±0.09 99.7 11.2 1.250±0.11 173.0
　2.8 0.588±0.04 66.5 　5.6 1.050±0.03 141.8
细胞对照 0.280±0.10 细胞对照 0.780±0.20
病毒对照 0.380±0.07 病毒对照 0.120±0.01
表 4　样品Ⅳ对感染细胞的保护作用和对 MT-2 细胞的毒性作用
培养 6 d时对感染细胞的保护作用
药物浓度(μg/ml) OD 值( x ±s) 保护率(%)
培养 7 d时对 M T-2细胞的毒性作用
药物浓度(μg/ml) OD值( x ±s) 保护率(%)
400.0 0.498±0.03 34.2 800.0 0.148±0.01 　4.6
200.0 0.848±0.10 101.3 400.0 0.381±0.02 49.3
100.0 0.996±0.05 129.7 200.0 0.526±0.02 77.3
50.0 1.05±0.00 140.1 100.0 0.677±0.02 106.4
25.0 0.554±1.08 44.9 50.0 0.729±0.02 116.3
12.5 0.673±0.04 76.8 25.0 0.676±0.00 106.1
　6.3 0.643±0.04 61.9 12.5 0.647±0.15 100.6
　3.1 0.567±0.02 49.1 　6.3 0.639±0.03 99.0
细胞对照 0.840±0.16 细胞对照 0.640±0.07
病毒对照 0.320±0.12 病毒对照 0.120±0.03
2.2　各样品抗 HIV 参数的计算　综合以上数据 ,
按 Bliss法计算出样品抑制病毒的 50%有效浓度
(EC50),50%细胞毒性浓度(TC50)及抗 HIV-1活性
的选择指数 SI 值(Selective index ,SI:TC50/EC50),
结果显示 ,不同稀释度的样品 Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ均有不同
程度的细胞的保护作用和细胞毒性 ,药物的浓度与
细胞保护率在不同的浓度范围内呈量效关系 。各样
品抑制 HIV-1活性和毒性有差异 ,其中样品Ⅲ活性
最大 ,样品 Ⅱ毒性最大 ,样品Ⅰ毒性最小(表 5)。
表 5　各样品的抗 HIV参数
样品号 EC50(μg/ ml)
病毒抑制率
(%)
TC50(μg/ml) 治疗指数(SI)
Ⅰ 5.0 68 >640 >128
Ⅱ 10.0 56 160 16
Ⅲ 2.8 66 180 64
Ⅳ 6.3 62 400 63
阳性对照(AZT) 0.1 73 30 >375
3　讨论
MT T 比色法是基于活细胞线粒体中的琥珀酸
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脱氢酶能使外源性 MT T 还原为水不溶性的蓝紫色
结晶甲瓒(Fo rmazan)并沉积在细胞中 ,而死细胞无
此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲
瓒 ,用酶联免疫检测仪在 550 nm 波长处测定其光
吸收值 ,可间接反映活细胞数量 。在一定细胞数范
围内 ,MT T 结晶形成的量与细胞数成正比 。但由
于 MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水 ,需被
溶解后才能检测 ,本研究所用的样品为混合物 ,难免
有不溶性的物质 ,导致个别样品的 OD 值超过 1.0 ,
使测得的抑制率或保护率超过 100%,引起了一定
的误差。
关于新疆紫草的水溶性成分的研究 ,日本学者
报道中国内蒙古生长的新疆紫草干燥根的热水提取
物有很强的抗 HIV-l活性 ,其 70%含水丙酮提取物
具有对抗急性感染的 H9细胞中的 HIV 复制的作
用 ,其有效成分为咖啡酸四聚体的钠 、钾盐 ,提出了
用新疆紫草的化学成分之一咖啡酸四聚体的钠 、钾
盐治疗 HIV 的可能性 ,但除了咖啡酸四聚体的钠 、
钾盐以外的其他成分没有报道 。在 M T-4细胞系观
察了常用 204种天然药物的体外抗 HIV-1活性[ 6] ,
包括紫草在内的 45个植物药在 M T-4细胞上抑制
了 HIV-1诱导的细胞致病性 。课题组初步提取了
产自新疆的软紫草的水溶性组分 ,并在 MT-2 细胞
系 ,采用 MT T 染色法 ,观察了这些提组分对 HIV
感染细胞的保护作用和对细胞的毒性作用。实验结
果表明 ,样品 Ⅰ和 Ⅱ在 2.5 ～ 320.0 μg/ml浓度范围
内 , Ⅲ在 2.8 ～ 360.0 μg/ml浓度范围内 , Ⅳ在 3.1
～ 400.0μg/ml范围内均对 HIV-1感染细胞有一定
的保护作用 ,活性大小顺序为Ⅲ>Ⅰ >Ⅳ>Ⅱ ,表明
其对 HIV-1的复制有一定的抑制作用。同时以上
样品对 MT-2细胞也有一定的毒性 ,其毒性大小顺
序为Ⅰ <Ⅳ<Ⅲ<Ⅱ。
参考文献:
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[ 收稿日期:2008-12-20]
新疆紫草提取物抗 HIV-1体外活性研究(Ⅱ)＊
买尔旦·马合木提1 ,2＊＊ , 古丽仙·胡加1＊＊＊ , 秦冬梅2
(新疆医科大学1附属肿瘤医院 , 2药学院 , 新疆　乌鲁木齐　830011)
摘要:目的:研究新疆紫草水溶性组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ 、 Ⅳ对 H IV-1 3 个关键酶的体外活性。方法:分别选用
HIV-1 整合酶(HIV-1 ing ra se , HIV-1 IN), HIV-1 蛋白酶(HIV-1 pro tease , HIV-1 PR), HIV-1 逆转录酶(HIV-1
rever se transcriptase , H IV-1 RT)体外药效筛选模型 , 观察组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ和Ⅳ对以上酶的抑制作用。结果:新疆
紫草水溶性组分Ⅰ 、Ⅱ 、 Ⅲ和Ⅳ对 H IV-1 IN 具有一定的抑制活性 , 50%有效浓度(EC50)分别为 2.21 、 14.71 、5.71
和 66.08 μg/ ml。组分Ⅰ对 HIV-1 RT 的抑制活性小 , EC50为5.63μg/ ml。结论:新疆紫草水溶性提取物对 HIV-1
IN 具有抑制活性 ,对 HIV-1 PR均无抑制活性。
关键词:新疆紫草;逆转录酶;整合酶;蛋白酶
中图分类号:R93;R978.7;R34　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5551(2009)04-0377-03
377新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2009 Apr., 32(4)
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基金项目:新疆维吾尔自治区地方病分子生物学重点实验室开放课题(编号:XJDX0208-2006-01);新疆维吾尔自治区高校科研计划科
学研究重点项目(编号:XJEDU2004I25)
作者简介:买尔旦·马合木提(1960-),男(维吾尔族),主任药师 ,研究方向:中药民族药开发。
通讯作者:古丽仙·胡加(1962-),女(维吾尔族),副主任中药师 ,研究方向:中药学基础 , E-mail:gulixian 0919@hotm ail.com。