全 文 ：珊侣调玉叹心限 l
!植 物 学 报 19 9 2, 3 4 ( ` ) : 4 7 0一 4 7斗
A e t “ B o t助 i e o s 伍 i e “
新疆紫草细胞培养物的化学成分研究 *
向桂琼
叶和春
卢馥荪
董教望
祝凤池
吴 新
李国凤
陈建林
(中国科学院植物研究所 ,北京 1 0。。 4 4 )
从新疆紫草 [注 r , 。 吞 f。 。 u : 人r 。 m 。
摘
( R o y l e )
要
J o h n s t
.
合物 ,据其理化性质和光谱数据 ,分别鉴定为去氧紫草素
的细胞培养物分离到
( d
e o x y s h i k o n i n
,
I )
、
烯酚紫草素 (月, 月一 d i m e t h y l a c r y l s h i k o n i n , 11) 、 乙酞紫草素 ( a c e t , l s h i k o n i n ,
5个茶酉昆类化
月 ,卢一二甲基丙
111)
、 2 , 3 一二
甲基戊烯酚紫草素 ( t e r a c r y l s h i k o n i n , IV ) 和 价径基异戊酸紫草素 (户一 h y d r o x y i s o v a l e r y l -
5 h i ok
o in
,
v )
。 细胞培养物不含从新疆紫草根中分得的紫草素 (s h i ok n i n ) ; 各成分在细胞培
养物中的含量与在新疆紫草根中的含量有很大差异 。
关键词 新班紫草 ;细胞培养物 ;蔡醒类化合物
C H E M IC A L C O M P O N E N T S O F C E L L C U L T U R E S O F
A R N E B I A E U C H R O M滩
X i a n g G u i
一
q i o n 只, L u F u 一 s u n ,
D o n g J i a o 一 w a n g
,
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, z ; t“ 多。 o j B o z a , y
,
Z h u F e n g 一 e h i
,
W
u X i n a n d
L i G u o
一
f e n g , Y e H e龙h u n -
C h e n J i a n
一
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A c a d e , i口 占i o i c a , B e i ji n g 1 0 00 4 4 )
A b s r
r a e t
F i 7 e n a p h t h : q u i n o n e s w e r e i s o l a t e d f r o nl t h e Pe t r o l e u m e t h e r e x t r a e t of t he e e l l e u l t u r e s of
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, 日, p一d i -
m e t h y l a e r y l s h ik o n i n
, a e e t y l s h i k o n i n
, t e r a e r y l s h ik o n i n a n d 日一 h y d r o x y i s o v a l e r y l s hi k o n i n by m e a n s
o f e h em i e a l m e t h o d s
,
H p L C
,
I R a n d ’ H 一N M R d a t a r e s p e e t i v e l y
、
T il e r e w a s n o s h ik o n i n i n het
e e l l e u l t u r e s
,
w h ie h w a s o b t a in e d f r o m t h e r o 汉 5 o f A . e邵 c z/ r o m a . T h e e o n t e n t s o f e a e h c o m Po u n d
i n t h e e e l l e u lt 一i r e s a r e d i f f e r e n t f r o m t h o s e i n t h e r o o t s o f A
.
e “ c h r o m a .
K e y w o r d s A
r n e b i a e “ c h r o m a ,. C e l l e u l t u r e s : N a Ph th a q u i n o n e云
紫草是一种传统中药 。 我们 曾对新疆紫草 [ A r , e b i a e 、 c h r o m a ( R o y l e ) J o h n s t . 1
和假紫草 ( A ; ne ib o g “ t 。 ; 。 B un g e ) 根的化学成分进行了研究 〔` ,zJ , 发现它们都富含茶醒
类化合物 。 此类化合物具有显著的抗菌 、 抗炎 、 抗肿瘤等多种药理活性 〔2一 ” , 可望成为一
本文于 19 91 年 2 月收到 , 同年 8 月收到修改稿 。
中国科学院化学研究所李立璞和陈素明同志侧 N M R , 本所庄惠丽同志测 IR , 特此致谢 。
. 国家 “ 七五 ” 攻关项目。
向桂琼等 :新疆紫草细胞培养物的化学成分研究
类新型的药物 。 紫草资源缺乏 ,利用植物细胞培养获得有用的化合物是解决资源匾乏 、 克
服化学合成弊病的重要途径 。 本文报道新疆紫草细胞培养物的化学成分研究 。
实 验 部 分
熔点用显微熔点仪和毛细管测定 , 温度未校正 。 红外光谱用 S P E C O R D 7弘 lR 仪测
定 。 核磁共振谱用 F X 一 10 型仪测定。 高效液相色谱用 J os c o F L C 一 3 50 型仪测定 。 柱
层析用硅胶 由山东青岛海洋化工厂生产 。 高效硅胶薄层由山东烟台化工研究所生产。
实验材料系本实验室从新疆紫草筛选的高产细胞系 A 一 I , 采用 人 P一 生长培养基
经细胞悬浮培养收获的细胞培养物 。 标准品去氧紫草素 ( A ) 、夕, 尽一二甲基丙烯酸紫草素
( B )
、 乙酞紫草素 ( C ) 、 2 , 3一二甲基戊烯酞紫草素 ( D ) 、 紫草素 ( E ) 和 户经基异戊酸紫
草素 ( F ) 〔` , 2 , , 均从新疆紫草根部分得 。
(一 ) 提取分离
将细胞培养物置于 50 ℃左右的烘箱中烘干 , 粉碎 , 用石油醚 (沸程 30 一 60 ℃ )回流提
取 ,提取液经浓缩得深紫红色浆状物 ,此提取物与
原植物的石油醚提取物和标准品进行硅胶 G 薄层
比较 , 展开剂为石油醚一乙酸乙醋 一冰乙酸 ( 10 :0
1 0 : 0
.
5 )
。 结果如图 1。
石油醚提取物用硅胶柱层析分离 (硅胶预先
经浓 H cl 处理 ) , 分别以不同比例的石油醚 一乙
酸乙醋洗脱。 石油醚 一乙酸乙醋 ( ” . 5 : 0 . 5 )洗脱所
得固体溶于少量丙酮 , 置冰箱中 , 析出白色蜡状
物 , 过滤 , 滤液浓缩 ,再经硅胶柱层析 , 用石油醚反
复重结晶 , 得红色鳞片状结晶 ( )I ; 石油醚一乙酸
乙醋 ( 9 9 : l) 洗脱所得粘稠状物用适量丙酮溶解 ,
置冰箱中冷却 , 滤除析出的白色蜡状物 , 如此反复
多次 , 滤液浓缩得深红色固体 , 再用石油醚一乙酸
乙醋 ( 1 0 : l) 反复重结晶 , 得深红色片 状 结 晶
( n ) ; 石油醚一乙酸乙醋 ( 9 9 : 1 )洗脱所得固体用石
油醚一乙酸乙醋 ( 10 0 : 2 )反复重结晶 , 得到红色长
针状结晶 ( n l) ; 石油醚 一乙酸乙醋 ( 9 8 : 2 )洗脱所
得深红色粘稠状物 , 经硅胶柱层析 ,得深红色油状
物 ( IV ) ; 石油醚一乙酸乙醋 ( 95 :约 洗脱所得组
分 ,通过硅胶制备薄层进行分离纯化 , 再于正己烷
中反复重结晶 , 得深红色片状结晶 ( V )。
(二 ) 化合物鉴定
人 0 0 0 1
B
O 0 0
。
c 0 C O 皿
D 0 G O VI
E 0 0。 0 0 0 1{
户
. 一 . 1 _ .
标准品 B A一 P 阮二 c
S t a n d a l d S
图 1 B A 一 C 和 BA 一 P 的薄层层析图
B A
一
P
. 新疆紫草的石油醚提取物
BA 一 c
. 新疆紫草细胞培养物的石油 醚提取物
F i g
.
l T h i n l a y e r e h r o m a t o g r a p h y o王
B A
一
P a n d B A
一
C
B A
一
P
.
T h e p e t r o l e u m e t h e r e x t r a c t o f
A r ” e b i a e “ c h r o 仍 a
B A
一
e
.
T h e p e t r o l e u m e t h e r e x t r a e t d
t h e e e l l e u l t u r e s o f A r 份 ` b i a
e u c h r o仍 a
m p 9 0一 9 1℃ 。 I R , 二r二c m 一 , : 3 5 5 0 , 16 3 5 , 15 9 0 , 1 4 5 0 , 12 4 0 , 8 3 0。 ` H 一 N M R ( C D C耘,
一 内标 )占( p p m ) : 1一 (S , 3 H一两翎月痴, 。
卷J,.j4 7 2 植 物 学 报
( m
, ZH
, A r一 C H Z一 ) , ” · 1 2
(
t
, ` H ,一 C H一 C
<)
,
6
·
8 4 ( d
, I H
, A r 一 H )
, 7
·
2 0 (
S , ZH ,
Z A r 一 H )
, 1 2
.
4 6 , 12
.
6 2 ( :
, ZH
,
Z A r 一 o H
, D ZO 交换消失 )。 H p L C k ’ 值与标准品 A 相同 , 证
明 I 为去氧紫草素。
11 m p 1 1 6一 1 1 7 oC 。 IR , 岔梦卖e m 一 ` : 3 5 , o , 17 5 0 , 16 5 0 , 14 5 0 , 1 2 5 0 , 2 2 8 0 , 1 12 0 , 8 0 0。
C H
` H 一 N M R ( e D C 1
3 , T M s 内标 ) 占( p p m ) : 1 . 6 0
7。
{
S , 3 H一< C H:), ` · 9 6 , 2 ’ ` 6
2
·。 4 ( m , ZH , 一 e H Z一 e H一 ) , 。· 16
(
t , I H
,一 e H -
,
、 ..夕才之óójS , 3 H一行-一 < C HC HO
C
<)
, ,
·
76
{
m
, `H , 一
i
一 C一 <)
,
6一 ( t , 1一 ;\ 1- ) , 6 · 9 6 ( d , 1· , · r -一又s , ZH , Z A r 一 H ) , 22 . 4 2 , 12 . 5 8( s , ZH , Z A r 一 O H , D ZO 交换消失 )。 H p L C k ’ 值与标准品 B {
相同 ,证明 n 为 口,声一二甲基丙烯酸紫草素 。
111 m p 1 0 6一 l o 7 oC 。 IR , 二警二c m 一 ` : 3 4 5 0 , 1 7 6 0 , 一6 4 0 , 1 45 0 , 1 2 6 0 , 12 4 0 , 1 1 5 0 , 10 8 0
、
!
,
C H
8 3 0。 ` H 一N M R ( C D C 1
3 , T M s 内标 ) 占( p p m ) :
C H
、`.`, 1百尹/
/3 H
2 1 6 ,
(
S , 3 ·
6一
(
t , 1一
\一节一 )
6 2 , 1
,
7 3
!
S , 3·一 <
, 2
·、 2 (m , Z H , - · H Z一 , , 5 · ` 0(t , I H ,一 C l l一 CO
A r一 C H一) 6
.
9 6 ( d
, I H
, A r 一 H )
, 7
.
2 0 (
s , ZH
, Z A r 一 H )
,
12
.
4 0 , 12
.
5 8 (
s ,
!R
Z H
, Z A卜 O H , D ZO 交换消失 ) 。 H P L C k’ 值与标准品 C 相同 , 证明 U l 为乙酞紫草素 。
I V I R , 琵彗二c m 一 , : 1 7 7 0 , 1 6 5 0 , 1 6 10 , 1 4 9 0 , 12 6 0 , 1 2 5 0 , 10 6 0 , 8 2 0。 `H 一 N M R ( C D C 13 ,
:),.s1l0
` H` 2, 一 C
<
C H
T M s 内标 ) 占( p p m ) : 1 . 5 2 , 1 . 5 6
C H
,
S
z
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、
、、龟r.J/
HC
(
S , 3一行一军_ 。 /一 勺 \0
2
.
0 0 (
s , 3 H
,一 e 一 C H :一 e 一 ) , 2 . 4 8 ( m , Z H , 一 C H Z一 C H一 ) , 2 . 9 6 (m , ZH ,一 e 一 C H Z一 ) ,
}1 } }!
0 C H 0
A r一 C H一 )
, 6一 ( d , !一 ) , 7一 ( S , 2一lR5一 (t , 1· ,一 <), 6一(t , 1一
Z A r 一 H )
, 12
.
3 6 , 12
.
5 4 (
s , Z H
, ZA r
一O H , D ZO 交换消失 ) 。 H p L C k ’ 值与标准品 D 相同 , 证
6期 向桂琼等 :新疆紫草细饱培养物的化学成分研究
明 I V为 2, 3一二甲基戊烯酸紫草素 。
V m p 9 3
.
5一 9 5 oC 。 IR , 牛分二e m 一 ` : 3 5 0 0 , 17 2 0 , 16 2 , , 1 4 70 , 1 2 2 5 , 一0 4 0 , 8 0 0 。 ’ H 一 N M R
nU6
.
由 .立
,
\、.,片于rz廿
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/ C H
咬C D c l 3 , 1 ’ M S 内标 ) 占( p p m ) : 1 · 3 0 } s , 3 H X Z , 一 C 久
} }
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Z A r 一 H )
,
12
·
3 6
,
1 2
·
5 6 ( s
,
ZH
,
Z A r 一O H
,
D ZO 交换消失 ) 。 H p L C k ` 值与标准品 F 相同 ,
证明 V 为 产轻 基异戊酸紫草素 。
(三 ) 含量测定
1
. 用比色法 测定 ,新疆紫草细胞培养物中蔡醒色素的含量为 17 . 5多 , 而对照测定新疆
紫草根中蔡醒色素的含量只有 3 . 4 多 。 .2 用 H P L C 法测定新疆紫草根和新疆紫草细胞
培养物中茶醒化合物的含量 。 l) 仪器及色谱条件 : w at er o M 一 5 10 泵 , M 一 6 80 溶剂 自
动控制器 , M 一 U 6 K 进样器 , J a s c o U V ID E C 一 1 0 0一 11 紫外分光检测器 ( 19 5一 3 5 0 n m ) ,
e z 一 2 0 4 型记录仪和 W s p 一 2 型色谱微处理机 。 色谱柱 : K Y W G 一 C : 。 10拼m 2 0 0 x s m m
( I D )
。 流动相 : 氯仿 /甲醇 /水 /冰乙酸 ( 14 5/ 4 / 2 6 / 6 , v / v )。 柱温 : 室温 。 柱压 : 7 3 5 0
k P a 。 流速 : l . Zm l / m i n 。 检测波长 U V 一 2 7 5 n m 。 记录纸速 : 1 . 5 m m /m i n 。 衰减 : 0 . 1 6
( O D )
。
)z 标准 曲线的绘制 : 精确称取标准品 A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F 各 10 m g , 混合置于
10 m l 容量瓶中 ,加适量氯仿 , 用甲醇定容 。 采用外标法定量 。 准确吸取标准溶液 1 、 3 、 6 、
1 2
、
24 川 分别进样 , 测定各组分的峰高 ( h ) 响应值 。 根据线性响应回归方程 : Y 一 。 十
表 1 标准样品的线性响应结果
T a b l e 1 L i n e a r r e s P 0 n s e
o f s t a n d a r d s a m P l e s
标准样品
5 t a n d
a r d
容量因子 (友’ )
C a P a e i t y
f a e t o r
截距 ( a )
I n r e r e e P t
斜率 ( b )
5 l o P e
相关系数 (r )
R e l
a t i v e
e o e f f i e i e n t
回收率 ( % )
R a 一 e o f
r e C o v e r y
15 5 1
。
8 2 15 5 8
.
4 5 0
。
9 9 7 2
3 9 5
。
8 6 9 10
.
0 6 0
.
9 9 9 3
一 3 4 3 。 5 7 72 9 . 3 4 0 . 9 9 9 6
一 7 9 9 . 8 2 7 2 1 . 76 0 . 99 8 7
12
。
1 2 一 1 1 3 . 5 1 3 1 6 。 0 9 0 。 9 9 9 7 1 0 0 。 3
1 6
。
0 6 一 2 8 9 。 4 7 3 15 。 6 1 0 , 9 9 9 ,
4 4 7植 物 学 报34 卷
b X( X为进样量 , Y 为响应峰值 ) , 获得各标准组分的线性响应结果 (表吮图 2 ) 。 3 ) 样品
溶液的制备 : 精确称取 B A 一 P 1 . 0 0 1 19 和 B A 一 C 0 . 4 5 0 0 9 , 分别置于 10 m l 容量瓶中 , 用
甲醇定容。 4 ) 样品的 H P L c 分析 : 分别吸取 B A 一 P 液溶 20 m l 、 B A 一 C 溶液 2 5m l 进行
H P L C 定量分析 , 根据响应峰值 ( h) , 用线性响应回归方程求出各成分的含量 (图 3 、 4 )。
样品量
S a m P l e
2 00 2 2 尸g
S a m P le
化合物含量
C o m Po n e n t e o n t e n t (% ) C o m P o
n e n
1引6479539.ECFAD政
时间(分钟 ) iT m e (m i n )
图 2 标准品的 H P L C 图谱
F 19
.
2 T h e H P L C o f s t a n d a r d s
一交一城厂飞旨一恺百一~壳一节一
时 l’q (分钟 ) T im e (m i n )
图 3 B A 一 P 的 H P L C 图谱
F 19
.
3 T h e H P L C o f B A
一
P
二方气打飞矿弓厂峨尸方一
时间 (分钟 ) T im e (m i n )
图 4 B A 一 C 的 H P L C 图谱
F 19
.
4 T h e H P L C o f B A
一
C
讨 论
新疆紫草细胞培养物中蔡醒色素的含量比新疆紫草根中的含量高出 多倍左右 。 新疆
紫草根含蔡酮化合物 A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F , 而细胞培养物仅含 A 、 B 、 C 、 D 、 F , 不含 E 。 由
H P L C 定量分析可知 。 细胞培养物中 A 、 C 、 D 、 F 的含量均比根中的高 , 主要有效成分乙
酞紫草素的含量比根 中的高 6 . 7 倍 。 因此 , 利用细胞培养解决紫草资源匾乏问题是行之
有效的 。
参 考 文 献
〔 l 〕 卢馥荪 、 向桂琼 、 祝凤池 , 1 9 8:3 假紫草化学成分研究 。 植物学报 , 2:5 4 , 6一 4弓, 。
〔 2 〕 林志彬 、 柴宝玲 、 王佩、 郭铃新 、 卢馥荪、 向桂琼 , 19 8 :0 紫草化学成分抗炎症作用的研究。 北京医学院学报 ,
1 2 : 1 0 1一 10 6 。
[ 31 林志彬 、王佩 、 阮元 、 郭铃新 , l , 8:0 月 , 月一二甲基丙烯酚紫草素的抗炎症作用 。 中国药理学报 , 卜 60 一 6 3a
[ 斗 ] p a p a g e o r g i o u , v . P 二 19 8 0 : N a t u r a l l y o e e u r r i n g i s o h e x e n y l一 n a p h t h a z a r i n p i g m e n t s : A n e w e l a s *
o f d r u g s
.
P l a
路 t a M 亡d
. ,
3 8
: 1 9 3一 2 0 3 .
[ 5 ] s a n k a w a
,
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E b i z u k a
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M i y
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Y
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I s o m u r a
,
H
.
o t s u k a
,
5
.
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M
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I n o m a r a 刁 n d F
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F u k u o k a
, 1 9 77 : A n t i t u m o r a e t i v i t y o f s h i k o n i n a n d i t s d e r i v a t iv e s
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2 3 9 2一 2 3 9 5 .