全 文 ：中国环境科学 2011,31(1)：150~155 China Environmental Science


十六烷基三甲基氯化铵与荧蒽对小球藻的联合毒性及其
作用机制

杨 良 1,葛 飞 1*,喻方琴 1,许 银 1,朱润良 1,朱门君 1,王 静 2 (1.湘潭大学环境科学与工程系,湖南 湘潭
411105；2.浙江省环境保护监测中心站,浙江 杭州 310012)

摘要：以普通小球藻(Chlorella vulgaris)为受试生物,采用批量培养方法研究了阳离子表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)与多环芳
烃荧蒽(Flu)的联合毒性及其作用机制.结果表明,当 CTAC 初始浓度固定为 100µg/L 时,随 Flu 浓度的升高(0~100.84µg/L), CTAC 与 Flu 的联
合毒性由协同效应(0~22.50µg/L)转为拮抗效应(22.50~100.84µg/L).当 Flu 浓度为 1.13µg/L 时,协同效应达到最大(RI＝2.01),与对照组相比,
生物量抑制率从 37.5%增加至 80.9%;对氮和铁单位吸收量分别从 0.27mg 和 9.18µg 降至 0.09mg 和 2.14µg;藻细胞 Zeta 电位从-10.0mV 提
高至-8.3mV;叶绿素 a 和可溶性蛋白质含量分别从 5.00mg/L 和 80.65µg/mg 降为 2.57mg/L 和 50.36µg/mg.根据实验结果分析, CTAC 与 Flu
复合污染体系提高了藻细胞 Zeta 电位,抑制了小球藻对氮和铁的吸收,降低了藻细胞体内叶绿素和蛋白质的含量.
关键词：十六烷基三甲基氯化铵；荧蒽；小球藻；联合毒性
中图分类号：X503,X826 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2011)01-0150-06

Joint toxicity and its mechanism of cetyltrimethyl ammonium chloride and fluoranthene on Chlorella vulgaris.
YANG Liang1, GE Fei1*, YU Fang-qin1, XU Yin1 , ZHU Run-liang1, ZHU Men-jun1, WANG Jing2 (1.Department of
Environmental Science and Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China ； 2.Zhejiang Province
Environmental Monitoring Centre, Hangzhou 310012, China). China Environmental Science, 2011,31(1)：150~155
Abstract：Joint toxicity of cetyltrimethyl ammonium chloride (CTAC) together with fluoranthene (Flu) on Chlorella
vulgaris was investigated by batch culture in laboratory. The joint toxicity of binary mixture of CTAC and Flu on
Chlorella vulgaris changed from synergetic effect (0~22.50µg/L) to antagonetic effect (22.50~100.84µg/L) with
increasing concentrations of Flu in the range of 0~100.84µg/L. The strongest synergetic effect (RI=2.01) was observed in
the presence of 1.13µg/L Flu, and the percentage of inhibition of biomass increased from 37.5% to 80.9%, while the
absorption of nitrogen and iron declined from 0.27mg to 0.083mg and from 9.18 µg to 2.14µg, respectively. At the same
time, Zeta potential of algal cell increased from-10.0 mV to-8.3 mV, and chlorophyll-a and soluble protein content
declined from 5.00mg/L to 2.57mg/L and from 80.65µg/mg to 50.36µg/mg, respectively. Above phenomena indicates that
CTAC and Flu combined pollution system increased the Zeta potential of algal cell and thus inhibits the absorption of
nitrogen and iron, which subsequently decreased the chlorophyll-a and protein content.
Key words：cetyltrimethyl ammonium chloride (CTAC)；fluoranthene (Flu)；Chlorella vulgaris；joint toxicity

表面活性剂是一类用途广泛的化工产品,阳
离子表面活性剂(CS)是其中毒性相对较高的一
类[1-2].在实际环境中,表面活性剂往往与芳香烃、
重金属或农药等污染物共存.多环芳烃(PAHs)是
一类持久性有机污染物,具有难降解、毒性大和
分布广等特点[3-5],因此,研究表面活性剂与 PAHs
复合污染体系对水生生态系统的影响十分必要.
表面活性剂等化学物质的环境安全评价常
通过该化学品对生物的毒性效应来表现.藻类在
水环境中分布广泛,细胞结构简单,并且对污染物
比较敏感,可以直接观察细胞水平上的毒性症状,
常被用作受试生物来评价外源污染物对生态系
统的影响[6-9].
已有关于联合毒性效应的报道大多集中在
收稿日期：2010-05-13
基金项目：国家自然科学基金资助项目(20877065);教育部新世纪优
秀人才支持计划(NCET-10-0148);湖南省催化与化工工艺创新团队
* 责任作者, 教授, gefei@xtu.edu.cn
1 期 杨 良等：十六烷基三甲基氯化铵与荧蒽对小球藻的联合毒性及其作用机制 151

污染物对生物体某个或某类指标的影响上[10-12],
而从细胞外影响递进到细胞内应答研究复合污
染体系的抑藻作用机制鲜有报道.本实验以十六
烷基三甲基氯化铵(CTAC)和荧蒽(Flu)分别作为
CS 和 PAHs 的代表,探讨 CTAC 与 Flu 复合污染
对典型淡水藻-普通小球藻(Chlorella vulgaris)的
联合毒性及其作用机制.在考察复合污染体系对
小球藻生物量影响的基础上,重点研究其抑制小
球藻生长的生理机制,包括 CTAC 与 Flu 对小球
藻吸收营养物质氮、磷和铁以及藻细胞 Zeta 电
位、叶绿素含量、可溶性蛋白质含量的影响.
1 材料与方法
1.1 实验材料
普通小球藻购自中国科学院武汉水生生物
研究所国家淡水藻种库(FACHB).CTAC(分析纯,
纯度≥98%)购自南京旋光科技有限公司,Flu(分
析纯,纯度≥98%)购自百灵威公司.
1.2 实验方法
小球藻的培养:用照度计(TES 1330A 型,台
湾)测定光照强度,调节光照强度达到 2500lx,光
暗比为 12h:12h,设定温度为(25±1) ,℃每天人工
摇瓶 3次,培养基为OECD培养液[13].实验前藻种
扩大培养 7d后,取一定体积的藻液离心去上清液,
用碳酸氢钠溶液洗涤,再离心,重复 3次,用无菌水
稀释后计数.取 100mL 实验起始浓度为 3.5×105
个 /mL 的藻液 ,加入培养液 ,均加入 100µg/L
CTAC,并分别加入Flu使其初始浓度达到1.0,2.5,
5.0,50,100,200µg/L(Flu 在 20℃的最大水溶解度),
调节 pH8.0,设置 3 组平行,每天定时测定生物量、
藻液中Flu的浓度(用于计算Flu的几何平均暴露
浓度),96h 后测定单位氨氮、总磷和总铁含量、
Zeta 电位、叶绿素和可溶性蛋白质含量.
1.3 分析测定方法
1.3.1 生物量测定 采用显微镜下血球计数板
进行计数,并在波长680nm下测定小球藻光密度,
建立不同藻细胞浓度和光密度之间的关系[14].根
据实验数据计算 96h 各实验组的抑制率 Iy 和抑
制率比率(RI).
CTAC、Flu 单一污染体系以及 CTAC/Flu
复合污染体系对小球藻生物量的抑制率 Iy 可用
式(1)表示:
tc
c
100y
Y YI
Y
−= × (%) (1)
式中:Yc 和 Yt 分别是空白组(不加污染物)和实验
组(加入污染物)小球藻培养 96h 后生物量的平均
值(测定 3 次).
抑制率比率 RI 可用式(2)计算:
OIRI
EI
= EI ( ) 100A B A B= + − ⋅ × (%) (2)
式中: OI 和 EI 分别为小球藻生物量实测抑制率
和预测抑制率, A 和 B 分别为 CTAC 和 Flu 单一
污染体系对小球藻生物量的抑制率. 复合污染
体系中 RI>1, RI＝1 和 RI<1 分别代表协同、相
加和拮抗效应[15].
1.3.2 Flu 几何平均暴露浓度的测定 分别测
定复合污染体系处理 0, 24, 48, 72, 96h 后残留的
Flu 浓度.每天定时取一定量藻液离心,取上清液
10mL,利用荧光分光光度计(RF-5301PC,日本岛
津)在 284nm 处(激发波长)及 457nm(发射波长)
下测定吸光度确定Flu实时浓度. Flu几何平均暴
露浓度 C 由式(3)计算[16](文中的 Flu 浓度均为几
何平均暴露浓度).

( )
[ ]
1
1
1
1anti log
2
(log log 1) ( 1 )
n
n
i i i i
i
C
t t
c c t t
−
=
⎧⎪= ⋅⎨ −⎪⎩
⎫+ + ⋅ + − ⎬⎭∑
(3)
式中:t1,t2,t3,t4,t5 分别为 0,24,48,72,96h;c1,c2,c3,c4,
c5 分别为 0,24,48,72,96h 实测浓度.
1.3.3 氮、磷和铁测定 将复合污染体系处理
96h 的藻液(100mL)离心 20min(5000r/min),取上
清液.采用纳氏试剂光度法,磷钼杂多酸光度法和
改进的二氮杂菲实验方法分别测定上清液中氨
氮、总磷和总铁含量[17].
1.3.4 Zeta 电位测定 将复合体系处理 96h 的
藻液,调节 pH 7.0,用 Zeta 电位仪(Delsa 440SX,
美国)测定小球藻的 Zeta 电位,重复 3 次,结果取
平均值.
1.3.5 叶绿素含量测定 取一定的复合污染体
系处理 96h 的藻液,离心取藻细胞,加入 95%的乙
152 中 国 环 境 科 学 31 卷

醇在 4℃下黑暗中提取 24h 后,离心,上清液分别
在 665, 649, 470nm 处测其吸光度[18].
1.3.6 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法,以
牛血清蛋白作标准曲线,测定小球藻在复合污染
体系下暴露 96h 后可溶性蛋白质的含量[19].
2 结果与讨论
2.1 复合污染体系对小球藻生物量的影响

0
20
40
60
80
100
Flu
CTAC+Flu
0 2 4 32 64 128
Flu 浓度(µg/L)
抑
制
率
(%
)

图 1 CTAC 与 Flu 对小球藻生物量的抑制作用
Fig.1 Percentage of inhibition of Chlorella vulgaris by
CTAC and Flu
CTAC 初始浓度= 100µg/L, t=96h
通过预实验发现,CTAC 对小球藻生物量的
抑制作用较大,96h-EC50 为 180µg/L,而 Flu 的抑
制作用很小 ,因此固定 CTAC 初始浓度为
100µg/L,考察 Flu 初始浓度在 0~200µg/L 范围内
CTAC 与 Flu 对小球藻生物量的联合毒性作用
(96h).从图 1 中可以看出,CTAC 与 Flu 复合污染
体系对小球藻生物量的抑制率先增大后减小,当
Flu 几何平均暴露浓度(以下均简称为浓度)为
1.13µg/L 时抑制率达到最大,复合污染体系对小
球藻的抑制率从对照组(初始浓度为 100µg/L 的
CTAC 单一污染体系)的 37.5%增加至 80.9%.将
图 1 数据计算处理得到表 1 中 RI,从表 1 中可知,
当复合污染体系 Flu 浓度<22.50µg/L 时,为协同
效应(RI>1);当 Flu 浓度≥22.50µg/L 时,为拮抗效
应(RI<1).当 Flu 为 1.13µg/L 时,协同效应达到最
大(RI＝2.01);当Flu浓度为 100.84µg/L时,拮抗效
应达到最大(RI = 0.14).
Wang 等[12]在研究石油碳氢化合物(PHCs)和
Cd 对双齿围沙蚕的联合毒性中也有类似的现象.
在该研究中,固定 PHCs 浓度分别为 50,200µg/L,
随着 Cd 浓度增加,复合污染体系对蠕虫的联合毒
性从协同效应 (Cd≤500µg/L)转变为拮抗效应
(Cd≥1000µg/L),但对其毒性机理未进行深入探讨.
表 1 CTAC与 Flu对小球藻生物量的抑制比率
Table 1 The ratio of inhibition (RI) of Chlorella vulgaris
biomass by CTAC and Flu
Flu 浓度(µg/L) 0.45 1.13 2.25 22.50 44.25 100.84
RI 1.28 2.01 1.72 0.90 0.51 0.14

2.2 复合污染体系对藻细胞吸收氮、磷和铁的
影响
藻类生长、繁殖过程不仅需要含氮、磷等常
规营养元素,同时还需要铁等微量营养元素[20-21].
图 2 为 CTAC与 Flu 复合污染体系对藻细胞吸收
营养元素氮、磷和铁的影响.溶液中氮、磷和铁
源分别以氨氮、磷酸盐和铁离子形式存在.由图 2
可以看出,与对照组中小球藻对氮、磷和铁的单
位吸收量相比,随着 Flu 浓度增加,CTAC 与 Flu
复合污染体系对藻细胞氮和铁的吸收量呈现先
下降(0~1.13µg/L)后增加(1.13~100.84µg/L)趋势,
与生物量的变化保持一致,而磷的吸收量基本不
受影响.当 Flu 浓度为 1.13µg/L 时,小球藻对氮和
铁的单位吸收量分别为从对照组的 0.27mg 和
9.18µg 下降为 0.09mg 和 2.14µg,当 Flu 浓度为
100.84µg/L 时,小球藻对氮和铁的单位吸收量分
别上升为 0.31mg 和 12.67µg,对磷的吸收量始终
保持在 0.06mg 左右.
氮、磷和铁等营养元素对维持细胞正常的生
理生化起着至关重要的作用.当 CTAC 与 Flu 共
存时,低浓度的 Flu 可通过静电作用和疏水作用
结合在藻细胞壁/膜上[22].研究报道[23]PAHs 可作
为间隙杂质插入到磷脂分子层中,或作为取代杂
质取代磷脂分子,从而改变细胞膜的性质,增强有
机污染物的穿透性.低浓度 Flu 可能因此促进藻
细胞吸附带正电荷的 CTAC,从而抑制了藻细胞
吸附氨氮和铁离子.高浓度的 Flu 可能与 CTAC
1 期 杨 良等：十六烷基三甲基氯化铵与荧蒽对小球藻的联合毒性及其作用机制 153

对藻细胞表面相同位点存在竞争吸附.研究表
明 [24]细胞壁上的半纤维素,细胞膜上的磷脂双分
子层可以有效结合疏水性有机化学物质,抑制小
球藻吸附 CTAC,因而藻细胞对氨氮和铁离子吸
收量提高.史小丽等[25-26]报道,光照与扰动等环境
因子影响微囊藻生物量,但单位质量微囊藻细胞
内磷含量无影响,与本研究相似.这可能是因为藻
细胞接入培养液后,会迅速过量摄取并储存磷,进
而使得每个藻细胞内磷含量较稳定[27].

0
2
4
6
8
10
12
14
0 2 4 32 64 128
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Flu 浓度(µg/L)
铁
的
吸
收
量
[µg
/(1
08
个
)]

氮
、
磷
的
吸
收
量
[µg
/(1
08
个
)]

Fe
P
N

图 2 CTAC 与 Flu 对藻细胞吸收氮、磷和铁的影响
Fig.2 Effect of CTAC and Flu on the absorption of
nitrogen, iron and phosphorus by algal cell
CTAC 初始浓度= 100µg/L, t=96h
2.3 复合污染体系对藻细胞 Zeta 电位的影响
复合体系影响了藻细胞内氨氮、铁等阳离子
型营养物质的积累,根据测定藻细胞表面电荷量
的变化,可初步推断其抑藻机制.由图 3 可以看
出,Zeta 电位随 Flu 浓度增加先升高(0~1.13µg/L)
而后降低(1.13~100.84µg/L).当小球藻暴露于初
始浓度为 100µg/L 的 CTAC 96h 后,其 Zeta 电位
为-10.0mV.当复合体系中 Flu 浓度为 1.13µg/L
时,Zeta 电位增加到-8.3mV.当 Flu 浓度增加为
100.84µg/L 时,Zeta 电位下降到-14.1mV.
由于藻细胞表面带负电荷,保持稳定的电荷
量对藻细胞调节生理功能,维持新陈代谢起着重
要作用.当表面带负电荷的藻细胞吸附 CTAC
时,CTAC 分子结构中氮原子所带正电荷使藻细
胞 Zeta 电位升高[2].由于低浓度 Flu 可以促进表
面带负电的小球藻细胞吸附CTAC,而高浓度Flu
可能与 CTAC 竞争吸附在小球藻表面,抑制了小
球藻吸附 CTAC.从而引起 Zeta 电位呈现先升高
后降低的趋势.

-15
-12
-9
-6
12864 32 420
Flu 浓度(µg/L)
Ze
ta
电
位
(m
V
)

图 3 CTAC 与 Flu 对藻细胞 Zeta 的影响
Fig.3 Effect of CTAC and Flu on the Zeta potential of
algal
CTAC 初始浓度= 100µg/L, t=96h
2.4 复合污染体系对藻细胞叶绿素含量的影响
植物色素是其进行光合作用的物质基础,根
据小球藻叶绿素含量的变化,进一步探讨 CTAC
与 Flu 的联合毒性机制.图 4 是复合体系对小球
藻叶绿素 a、叶绿素 b 以及总叶绿素含量的影响
(96h).随着 Flu 浓度的增加,复合体系处理中小球
藻叶绿素含量呈现出先减少(0~1.13µg/L)后增加
(1.13~100.84µg/L)的趋势,与生物量的变化保持
一致.对照组中叶绿素 a 含量为 5mg/L,在 CTAC
与 1.13µg/L Flu 共同作用下,叶绿素 a 含量仅为
2.57mg/L,当 Flu 浓度增加到 100.84µg/L 时,叶绿
素 a含量增加到 6.77mg/L.CTAC与 Flu复合体系
对小球藻叶绿素 b 及总叶绿素含量的影响也呈
现出类似的规律.CTAC与 1.13µg/L Flu共同处理
96h 后,叶绿素 b 与总叶绿素的抑制率分别为
38.1%和 44.8%.
叶绿素含量变化能较好地反映生物各阶段
生长发育正常与否[28].已有研究表明[29]叶绿素 a
对外缘污染物最敏感.本研究结果证实相对于叶
绿素 b,复合污染体系对叶绿素 a 抑制率较高.
Rontani 等[30-31]认为,在光合作用系统(包括系统
一和系统二)中,少数特殊状态下的叶绿素 a 作为
重要成分组成捕光色素,同时在先发生电子传递
的系统二中,作为光合电子传递链的电子供体,从
154 中 国 环 境 科 学 31 卷

而使其相比与其他植物色素更为敏感.

0
4
8
12
0
2
4
0
3
6
2.25 22.50 100.8444.25 1.130 0.45
含
量
(m
g/
L)

含
量
(m
g/
L)

含
量
(m
g/
L)
a. 叶绿素 a
b. 叶绿素 b
c. 叶绿素
Flu 浓度(µg/L)
图 4 CTAC 与 Flu 对小球藻叶绿素含量的影响
Fig.4 Effect of CTAC and Flu on the chlorophyll content
of Chlorella vulgaris
CTAC 初始浓度=100µg/L, t=96h
依据图 2 与图 4,由于复合污染体系影响了
小球藻对铁元素的吸收,而铁是叶绿素合成中某
些酶的活化剂[32],这在一定程度上导致叶绿素含
量的变化趋势呈现相似的规律.
2.5 复合体系对藻细胞蛋白质含量的影响
蛋白质是生物体内一种极为重要的高分子
有机物,通过测定小球藻蛋白质含量的变化更深
入探讨 CTAC 与 Flu 的联合毒性机制.固定
CTAC 初始浓度为 100µg/L,Flu 对小球藻可
溶性蛋白质含量的影响见图 5(96h).由图 5 可知
小球藻可溶性蛋白质含量呈现出先减少 (0~
1.13µg/L)后增加(1.13~100.84µg/L)的趋势,可溶
性蛋白质在对照组中含量为 80.65µg/mg,当 Flu
浓度增加到 1.13µg/L 时含量降为 50.36µg/mg,而
Flu浓度为 100.84µg/L可溶性蛋白质含量增加至
107.19µg/mg.

20
40
60
80
100
120
32 64 128420
可
溶
性
蛋
白
质
含
量
(µg
/m
g)

Flu 浓度(µg/L)
图 5 CTAC 与 Flu 对小球藻可溶性蛋白质含量的影响
Fig.5 Effect of CTAC and Flu on the soluble protein of
Chlorella vulgaris
CTAC 初始浓度 = 100µg/L, t=96 h
蛋白质对调节生物生理功能,维持新陈代谢
起着重要作用[33].因此外源污染物的胁迫势必会
影响藻类蛋白质含量,已有研究表明高浓度的扑
草净和琥珀酸酯磺酸钠无论是单一还是复合均
能降低可溶性蛋白的含量从而抑制蛋白核小球
藻的生长[9].
由图 4 和图 5 可知,叶绿素含量和蛋白质含
量的变化趋势基本一致.一方面可能是由于藻细
胞叶绿素含量下降,阻碍其进行光合作用,从而改
变藻细胞蛋白质含量;而另一方面,蛋白质作为生
命物质基础,细胞所有重要组成成分均有参与,其
含量的变化必然会影响细胞重要组成部分(如叶
绿体)的正常功能.
3 结论
3.1 固定 CTAC 初始浓度, CTAC 与 Flu 对小球
藻的联合毒性随 Flu 浓度升高由协同效应转为
拮抗效应,协同效应最大时 RI＝2.01.
3.2 CTAC 与 Flu 的联合毒性表现为协同效应
时,该复合污染体系提高了藻细胞Zeta电位,抑制
了藻细胞对氮和铁的吸收, 降低了藻细胞体内
叶绿素和蛋白质的含量.
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作者简介：杨 良(1987-),男,安徽安庆人,湘潭大学环境科学与工
程系硕士研究生,主要研究方向为有机污染物的环境行为及生态风
险评价.发表论文 2 篇.