全 文 ：·基础研究 ·
不同氮源对蛋白核小球藻生长 、
色素和中性脂肪积累的影响＊
王顺昌 1, 2 , 王　陶 1 , 赵世光 1 , 吴跃进 1＊ , 余增亮 1
(1.中国科学院等离子体物理研究所离子束生物工程重点实验室 , 安徽 合肥 230031;
2.淮南师范学院化学生物系 , 安徽 淮南 232001)
摘　要:单细胞微藻在生长发育过程中 , 所积累的中性脂肪具有潜在的生物燃料价值。 不同氮源对藻类的生
长具有显著影响。研究了氨态氮 、尿素氮和硝酸态氮对蛋白核小球藻生长 、色素和中性脂肪积累的影响。结果
显示 ,不同氮源对培养液 pH有显著影响 , 以氨态氮为氮源导致培养液 pH降低 , 而硝酸态氮导致培养液 pH升
高 ,培养液 pH的波动可被添加的 Hepes所稳定 , 并促进以氨态氮为氮源的蛋白核小球藻的生长。 尿素氮对蛋
白核小球藻生长 、色素积累的效果优于氨态氮和硝酸态氮 , 硝酸态氮在中性脂肪积累上优于尿素氮和氨态氮 ,
添加 Hepes对氮饥饿后蛋白核小球藻的中性脂肪积累无显著影响。
关键词:蛋白核小球藻;氮源;色素积累;中性脂肪
中图分类号:S963
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2008)02-0197-05
Growth, PigmentandNeutralLipidsAccumulationinChlorelapyrenoidosa
underDiferentNitrogenousSources
WANGShun-chang1, 2 , WANGTao1 , ZHAOShi-guang1 , WUYue-jin1＊ , YUZeng-liang1
(1.KeyLaborotaryofIonBeamBiotechnology, InstituteofPlasmaPhysics, ChineseAcademyofScience, Anhui23003,
Hefei, China;2.DepartmentofChemistryandBiology, HuainanNormalUniversity, Huainan232001, Anhui, China)
Abstract:Theunicelularmicroalgaeaccumulatedtheneutrallipids, whichcouldbepotentialyusedasthebio-fuels.
ThegrowthofalgaewasafectedbymanyenvironmentalfactorssuchaspHandnitrogenoussources.Inordertoinvesti-
gatetheefectsofdiferentnitrogenoussourcesonthegrowth, pigmentsandneutrallipidsaccumulationonalgae, the
greenalgaeChlorellapyrenoidosawascultivatedinammonia, ureaandnitrateasthenitrogenoussources, respectively.
Theresultspresentedheredemonstratedthatthegrowthproperties, pigmentsandneutralaccumulationofC.pyrenoidosa
wereafectedbydifferentsourcesofammonia, ureaandnitrate.TheresultsindicatedthatthemediumpHwasreduced
bytheusingofammoniaasthenitrogenoussource, whilethenitratecausedthemediumpHelevated.Thefluctuationof
themediumpHcouldbebalancedbytheadditionofHepesbuffer.Theureahasbetterefectsonpromotinggrowthand
pigmentsaccumulationthanthatofammoniaandnitrate, whereasthenitratehasbeterefectsonneutrallipidsaccumu-
lationthanthatofammoniaandurea, respectively.TheadditionofHepesexhibitednosignificanteffectsonneutrallipids
accumulationinalofthethreenitrogenoussourcesafternitrogenstarvation.
Keywords:Chlorelapyrenoidosa;nitrogenoussource;pigmentsaccumulation;neutrallipid
第 17卷第 2期
2008年 4月 　　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.17 No.2Apr.2008
＊ 收稿日期:2007-04-23;修回日期:2007-05-23
基金项目:中科院方向性资助项目(KSCXZ-SW-324)
作者简介:王顺昌(1964— ), 男 ,副教授 , 在读博士 ,主要从事环境与生物相互作用研究 。
＊通讯作者:(电话)0551-5593172;(传真)0551-5591310;(电子邮箱)yjwu@ipp.ac.cn
　　自 1970年代能源危机出现以来 ,发达国家不遗
余力的寻求可替代能源和可再生能源。近年来 ,由
于石油价格高居不下和能源安全 、环境保护等方面
的需求增加 ,各国在生物能源方面的投入不断加大 。
随着我国成为世界第二大石油进口国 ,能源安全问
题已成为中国经济稳定发展的重大瓶颈。开发包括
生物能源在内的可替代能源是我国能源多样性建设
的重要的一环。
藻类细胞内具有丰富的贮藏物质 ,并可产生许
多次生代谢产物 ,其潜在的生物能源价值受到人们
的重视。美国能源部从 1978-1996年资助对藻类生
物柴油进行了广泛研究 ,从 3 000株藻类样本中 ,筛
选出 300株具有潜在产油能力的单细胞藻类 [ 1] 。蛋
白核小球藻 (Chlorelapyrenoidosa)因生长迅速 、培养
容易 ,潜在的经济价值高而受到广泛研究。在正常
的生理条件下 ,藻类合成的脂肪酸主要用来合成包
括膜脂在内的各种脂肪 ,这些脂肪酸多为一些不饱
和脂肪酸如棕榈酸(16 ∶0)和油酸 (18 ∶1ω9)[ 2] 。
但当藻类受到营养胁迫 ,尤其是氮胁迫时 ,由于光合
作用并未中断 ,碳元素的同化作用仍继续进行 ,导致
脂肪合成模式的改变 , 转而合成中性 的甘油三
酯 [ 3-4] ,并以油滴的形式贮藏在细胞质中。藻类培养
中最常使用的氮源是硝酸态氮 ,在培养过程中 ,藻液
的 pH会随着培养时间的延长从 6.5上升到 9.0以
上 ,从而导致生长停滞。 Guckert[ 5] 等发现 ,当环境
pH>10时 ,甘油三酯的积累受到显著抑制 。氨盐和
尿素也是藻类培养中可供选择的氮源 ,但它们对藻
类生长的影响尚未得到充分研究 ,尤其是有关氨氮
和尿素氮对藻类脂肪积累的影响尚未见报道 ,本文
研究了硝酸氮 、氨氮和尿素氮对蛋白核小球藻生长 、
色素含量和中性脂肪积累的影响。
1　材料与方法
1.1　藻种和培养基
实验所用的蛋白核小球藻购置中国科学院水生
生物研究所。实验所用培养基为 Bold sbasal培养
基 ,并以相同的氮含量的 NH4Cl和尿素分别取代培
养基中的 NaNO3。为观察不同 pH对藻类生长的影
响 ,实验以 25 mmol· L-1的 Hepes作为缓冲剂。将
蛋白核小球藻以 1.2 ×106 个 /mL的密度接种于含
125 mL培养液的 250 mL三角烧瓶内 ,在 26 ℃下以
100 r/min振荡培养 ,并以 16 h∶8 h的光周期给予光
照 (200 μE/m2s)。每组实验设三个平行 ,藻类细胞
经鲁戈氏液固定后 ,在血球计数板上进行计数。
1.2　色素抽提和测定
取 10 mL藻液 ,以 2 600 ×g离心 10 min,弃上清
液 ,然后以 96 %甲醇抽提过夜 ,再以 2 600 ×g离心
10 min,取上清液 ,在分光光度计上 ,分别读取 666
nm, 653 nm, 470 nm和 245 nm下的 OD值 ,按 Licht-
enthaler等方法计算色素含量 [ 6] 。
1.3　中性脂肪的测定
中性脂肪测定采用尼罗红活体染色法 [ 7] 。取
5.0 mL藻液 ,加入 250 μg/mL的尼罗红丙酮溶液 20
μL,使其浓度达到 1.0 μg/mL,在漩涡振荡器上振荡
30 s,取 1 000 μL于 24孔板内 ,在酶标仪上以 488
nm激发波长和 560 nm发射波长读取荧光值 ,以甘油
三酯(triolein, Sigma)作为标准 ,测定培养液甘油三
酯的含量 。
1.4　统计分析
所有数据均以平均值 ±标准差表示 ,方差分析
采用 SPSS11.5 forWindows软件 , P<0.05表示差异
显著。
图 1　氨态氮 、尿素氮和硝酸态氮对蛋白核小球藻生长
的影响
Fig.1　Effectsofammonia, ureaandnitrateonthegrowth
propertiesofC.pyrenoidosa
2　结果与分析
2.1　不同氮源对蛋白核小球藻生长速率的影响
生物缓冲剂对小球藻的生长无任何毒性 [ 5] 。在
不加缓冲剂的条件下 ,不同氮源对蛋白核小球藻的
生长具有显著的影响 ,接种后 72 h,不同氮源对生长
速率影响很小 ,但随着培养时间的延长 ,蛋白核小球
藻的生长速率也发生变化。以氨态氮作为氮源的生
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长受到抑制 ,从接种后 96 h至 240 h,细胞密度较硝
态氮显著降低。而以尿素作为氮源 ,对蛋白核小球
藻的生长无任何不利影响 ,在 240 h的培养时间内 ,
以尿素作氮源的细胞密度不仅显著大于以氨氮 ,而
且较硝态氮高。加入缓冲剂 Hepes可促进蛋白核小
球藻的生长 。从图 1可以看出 ,在添加 Hepes后 ,以
氨氮为氮源的蛋白核小球藻生长正常 ,生长速率较
硝态氮快 ,与以尿素氮为氮源相当。而添加 Hepes
后 ,以硝态氮和尿素氮为氮源的生长速率也有所增
加 ,其中尿素氮的生长速率最快 。上述结果显示 ,不
同氮源对小球藻的生长具有显著影响 ,但加入 pH缓
冲剂可改善藻类培养条件 ,促进藻类生长。
2.2　不同氮源培养藻类的培养基 pH变化
在前面的实验中 ,加入 pH缓冲剂可促进蛋白核
小球藻的生长 ,通过测定不同氮源条件下 ,藻类培养
液的 pH发现 ,以氨氮作氮源 ,可导致藻类培养液 pH
迅速下降 , pH从接种时的 6.3 ±0.02下降到 240 h
时的 3.82±0.18,对应的 ,在加入 Hepes后 ,虽然 pH
也有降低 ,但下降幅度较小。使用硝态氮作为氮源
时 ,培养液的 pH呈显著上升的趋势 ,在培养 240 h
后 ,培养基 pH从 6.5 ±0.02升高到 9.4 ±0.20。加
入 Hepes使其 pH一直保持在 6.5左右 (图 2)。以尿
素作氮源时 ,培养液 pH波动较氨氮和硝态氮低 , pH
一直保持在 6.5 ～ 7.0之间 ,而加入 Hepes使其 pH
有所降低 ,但幅度较小 。表明不同氮源对小球藻培
养 pH有很大影响 ,其中氨氮导致 pH降低 ,而硝态氮
导致 pH升高 ,使用尿素氮 pH波动最小。
图 2　不同氮源对培养液 pH的影响
Fig.2　EffectsofnitrogenoussourcesonthepHofthe
medium
图 3　氨态氮 、尿素氮和硝酸态氮对蛋白核小球藻叶绿素 a(A)和叶绿素 b(B)的影响
Fig.3　Efectsofammonia, ureaandnitrateonthecontentofchlorophyll(A)andchlorophyllb(B)ofC.pyrenoidosa
2.3　不同氮源对蛋白核小球藻叶绿素含量的影
响
不同氮源对蛋白核小球藻的色素积累具有显著
的影响 ,但影响幅度较生长速率低。图 3A是不同氮
源条件下 ,蛋白核小球藻叶绿素 a含量的变化 ,使用
氨氮作为氮源时 ,叶绿素 a的含量显著降低 ,但从接
种到 144 h之前 ,尽管细胞密度降低很大 ,但色素含
量与其它组类似 ,当培养 144 h以后 ,叶绿素 a含量
迅速降低 ,其中在培养 240 h时 ,叶绿素 a的含量只
有其它组的一半(图 3A)。当加入 Hepes后 ,在整个
培养阶段 ,叶绿素 a的含量呈逐步上升的趋势 ,说明
环境 pH值对蛋白核小球藻的叶绿素 a积累有显著
的影响。尿素氮在有无 Hpes存在条件下 ,叶绿素 a
的含量无显著差别 ,这与其生长速率和培养液 pH的
199第 2期　　　　　　　　　王顺昌等:不同氮源对蛋白核小球藻生长 、色素和中性脂肪积累的影响　　　　　　　　
变化基本吻合 ,而以硝态氮作为氮源时 ,在培养后
期 ,加入 Hepes可促进叶绿素 a的积累 ,并在所有实
验组中保持最高的含量(图 3A)。叶绿素 b的变化
与叶绿素 a十分相近 ,即氨态氮影响其积累 ,同样 ,
以含有 Hepes的硝态氮培养基培养时 ,可获得最高
的叶绿素 a含量 (图 3B)。
图 4　不同氮源下蛋白核小球藻胡萝卜素含量
Fig.4　ThecarotenoidscontentofC.pyrenoidasaunder
differentnitrogenoussources
2.4　不同氮源对蛋白核小球藻胡萝卜素含量的
影响
与叶绿素的积累有所不同 ,氨氮只在培养后期
影响胡萝卜素的积累 ,从接种到 192 h,尽管以氨态
氮作培养基使胡萝卜素含量有所降低 ,但含量差异
较小 ,到 240 h时 ,胡萝卜素的含量不仅没有升高 ,反
而显著低于 144 h～ 192 h的水平 ,说明长时间低 pH
环境导致了胡萝卜素的分解 (图 4),同样 , 在与
Hepes共培养时 ,胡萝卜素的含量随着培养时间的延
长而上升 。尿素氮作 为氮源时 , 不论是否 加入
Hepes,胡萝卜素的含量均呈现稳步上升的趋势。在
以硝态氮作为氮源时 ,胡萝卜素的含量最高 ,而加入
Hepes后 ,胡萝卜素的含量反而有所下降(图 4)。
2.5　不同氮源对蛋白核小球藻中性脂肪积累的
影响
在没有氮饥饿条件下 ,以氨氮和尿素氮作氮源
时 ,蛋白核小球藻的中性脂肪含量十分相近 ,以硝酸
态氮作为氮源时 ,中性脂肪含量为 (3.48 ±0.09)
μg/107细胞 ,显著高于氨氮的(2.53±0.15)μg和尿
素氮 (2.66 ±0.10)μg。在培养基中添加 Hepes,对
以氨氮和尿素氮为氮源的中性脂肪积累无显著影
响 ,但会导致以硝酸氮为氮源的中性脂肪显著降低
(图 5A)。对培养物进行 24 h氮饥饿处理 ,蛋白核小
球藻的中性脂肪迅速积累 ,在不添加 Hepes时 ,不同
处理之间无显著差异 ,但以硝酸氮作氮源时 ,添加
Hepes组的中性脂肪含量较不添加时低 (图 5B)。
(A)无氮饥饿;(B)氮饥饿
(A)Withoutnitrogenstarvation;(B)Nitrogenstarvation
图 5　不同氮源对蛋白核小球藻中性脂肪积累的影响
Fig.5　NeutrallipidsaccumulationofC.pyrenoidasaunderdiferentnitrogenoussources
3　讨论
硝酸盐氮是最常用的培养小球藻氮源 ,但 Syreth
发现 ,使用硝酸氨和氨态氮混合物作为氮源时 ,普通
小球藻 (Chlorelavulgaris)优先吸收氨氮 ,因为硝酸
氮的吸收是耗能过程 [ 8] 。本实验发现 ,以氯化铵作
200　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 17卷
为氮源培养蛋白核小球藻时 ,早期的生长速率较其
它氮源稍快 ,可以更快的达到指数生长期 ,但随着培
养时间的延长 ,培养液的 pH迅速降低 ,使生长速率
受到显著的抑制 ,直至生长停滞;使用硝酸盐作为氮
源时 ,在培养后期 ,培养液的 pH会迅速上升 ,导致生
长速率下降。相对于使用氨态氮和硝酸氮 ,使用尿
素氮作为氮源时 ,培养基 pH没有比较剧烈的波动 ,
且生长速率与经典的硝酸盐培养基无显著差别。类
似的结果也见于 C.valgaris[ 9] 的培养过程。加入
Hepes作为缓冲剂后 ,不论使用氨氮作为氮源 ,或使
用硝酸氮作为氮源 ,均可获得较好的生长 ,表明不同
氮源条件下 ,蛋白核小球藻生长速率的差异 ,主要由
pH的波动造成。在以硝酸氮作氮源时 , Na+等离子
并未伴随着 NO-3 的吸收而被吸收 ,因而导致 pH上
升 ;当以氨氮作为氮源时 ,非离子态氮主要以扩散方
式进入细胞内 ,因而导致 pH降低。藻类色素积累受
多种环境因素的影响 ,如光照 、温度等。在本实验表
明 ,使用氨氮作为氮源 ,可导致叶绿素 a, b和胡萝卜
素含量降低 ,但使用其它两类氮源时 ,色素积累无显
著差异 ,但在添加 Hepes后 ,使用硝酸氮作为氮源可
获得较高的色素产量。 Shi等 [ 9]用硝酸盐氮 、氨氮和
尿素氮异养培养蛋白核小球藻的结果表明 ,尿素氮
在生物量和叶黄素积累等方面优于其它两种氮源 。
上述结果表明 ,在进行藻类的生产性培养时 ,尿素是
良好的氮源 。
藻类的脂肪合成受到多种环境因素的影响 ,在
正常生理条件下 ,蛋白核小球藻仅合成少量中性脂
肪 。如图 5所示 ,不同氮源对蛋白核小球藻中性脂
肪积累有显著影响 ,以硝酸氮作氮源时 ,中性脂肪含
量最高。这种中性脂肪的积累可能与培养液 pH的
升高有关 ,根据 Guckert等的报道 [ 5] ,当环境 pH上升
到 9以上时 ,小球藻品系 CHLOR1倾向于在细胞中
积累中性脂 肪。实验结 果显示 , 培 养基中添 加
Hepes,降低了蛋白核小球藻积累中性脂肪的能力 ,
而以尿素氮作为氮源时 ,由于培养基 pH相对稳定 ,
无论是否添加 Hepes,对中性脂肪的含量均无显著影
响 ,这表明 ,在以不同氮源作为培养基时 ,导致藻类
中性脂肪变化的主要因素是培养液 pH的改变 ,而非
氮源本身的作用。氮饥饿可以触发藻类大量积累中
性脂肪 ,蛋白核小球藻在氮饥饿 24 h后 ,中性脂肪的
积累显著增加 ,此时的中性脂肪积累似乎只与细胞
密度有关 ,而与氮源无关 。
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