全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(1):216-220
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
新疆雪莲多倍体的诱导初探＊
张蜀敏1 ,2 ,王晓军1 ,郝秀英3 ,徐　琴1 , 陈　阳1 ,2 ,
刘传军1 , 2 ,曹玉锦1 , 2 ,欧阳立恒3
(1.中国科学院新疆理化技术研究所 ,乌鲁木齐　830000;2.中国科学院研究生院 ,北京　100039;
3.新疆农业科学院微生物应用研究所 ,乌鲁木齐　830091)
摘　要:用秋水仙素和 2%二甲基亚砜共同处理新疆雪莲种子 、胚根和茎段 , 以诱导多倍体雪莲。 结果表明 ,
茎段经过 100 mg · L-1秋水仙素处理 3 d 诱导效果最佳 , 同时 ,离体培养其嵌合体苗茎段及叶片 , 诱导不定芽
生成 ,获得了四倍体细胞比例达到 90%以上的植株。
关键词:秋水仙素;新疆雪莲;多倍体
中图分类号:S567.23 +9　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2008)01-0216-05
Polyploid Induction of Saussurea involucrata Kar.et Kir.
ZHANG Shu-min1 ,2 , WANG Xiao-jun1 , HAO Xiu-ying3 , XU Qin1 ,
CHEN Yang
1 , 2 , LIU Chuan-jun1 , 2 , CAO Yu-jin1 ,2 and OUYANG Li-heng3
(1.Xin jian g T echnical Inst itute of Physics &C hemist ry , C hinese Academy of S cien ces , Urumqi　830011 , China;
2.Graduate School of C hinese Academy of S cien ces , Bei jing　100039 , China;3.In sti tu te of
M icrobiology , Xinjian g Academy of Ag ricultu ral Science , Urum qi　830000 , C hina)
Abstract:The stem , seed , radicel of S aussurea involucrata Kar.et Kir.were induced w ith colchicine
and 2%DMSO.The results show ed that the bet ter effective induct ion team is that the stem w as in-
duced w ith 100 mg · L-1 colchicine fo r 3 d.Furthermore , the stem and leaf o f the mixoploid of the
100 mg ·L-1 colchicine we re cul tivated fo r 3 d to stimulate the adventi tious buds to regenerate and the
plants w ith mo re than 90% of tet rapolid cell we re gained.
Key words:Colchicines;Saussurea involucrata Kar e t Kir;Po lyploid
　　新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et
Kir.)(2n=2x =32[ 1])系菊科凤毛菊属多年生草
本植物 ,是名贵的中药材[ 2] 。由于雪莲生长于极
端环境 ,人工栽培困难 ,长期以来对雪莲的粗放型
和掠夺性采挖 ,导致目前雪莲资源日益匮乏 。考
虑到多倍体植物普遍表现为根 、茎 、叶 、花及果实
的巨型性 ,药用活性成分含量高 ,生态适应性及抗
逆性增强等特征[ 3] ,因而 ,进行野生雪莲多倍体培
育的探索性研究 ,对于增强雪莲在各种环境条件
下的适应性 ,提高其药效成分含量 ,实现雪莲规模
化人工种植都具有非常重要的现实意义 。新疆雪
莲在组织培养方面已多有报道[ 4 ～ 6] ,但未见其多
倍体诱导的报道。本试验利用不同含量的秋水仙
素溶液并结合二甲基亚砜 ,采用多种方法对新疆
雪莲不同部位进行诱变处理 ,以期获得新疆雪莲
多倍体植株。
1　材料与方法
1.1　材 料
雪莲种子来自新疆和静县。依次用 75%乙
醇表面消毒 30 s;0.1% HgCl2 溶液 , 10 min;
15%H 2O2 溶液 , 30 m in;灭菌水漂洗 4 ～ 6次 ,播
＊收稿日期:2007-08-20　　修回日期:2007-09-05
基金项目:中国科学院西部行动高新技术项目:新疆雪莲规模化组培快繁技术研究(KGCX2-SW-506)。
作者简介:张蜀敏(1982-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:植物遗传育种研究。 E-mail:Zhan gshumin19828@yahoo.com.cn , Tel:0991-
3813610.
种于 MS基本培养基上。
1.2　方法
1.2.1　多倍体诱导方法　秋水仙素浸种法:将未
消毒的雪莲种子分别浸泡在 0 , 0.1%, 0.3%,
0.5%,0.7%, 0.9%, 1.1%的秋水仙素与 2%的
二甲基亚砜溶液中共处理 6 h ,然后将处理后的
种子消毒后 ,接种到 MS 基本培养基上培养。每
种浓度处理 100粒种子。
秋水仙素浸根法:种子露白后 ,待胚根长至 1
cm 左右 ,转接至含有 2%二甲基亚砜(DMSO),
且分别含 100 , 400 和 600 mg · L-1秋水仙素的
MS 基本培养基上依次培养 12 h , 18 h ,24 h。然
后将处理后的种子转移到不含秋水仙素和二甲基
亚砜的 MS 基本培养基上培养 。
秋水仙素处理茎段:将苗龄 50 d的无菌苗切
除根 、叶 ,保留茎干。
(1)将茎干接种于培养基①上培养 2 ～ 4 d ,然
后转移至培养基②上诱导出芽 ,之后进行茎尖染
色体鉴定 。(2)染色体鉴定后 ,将最佳诱导组合产
生的嵌合体苗切割成叶片和茎段两部分 ,皆转移
至 MS 基本培养基上 ,促使不定芽再生 ,然后切成
单株 ,在培养基③上反复继代 。(3)秋水仙素浓度
分别为 0 ,100 ,300 ,400 ,500 mg ·L-1 。
①出芽诱导培养基:MS +0.5 mg · L-1 6-
BA+0.5 mg ·L -1 TDZ +2% DMSO+秋水仙
素;②出芽诱导培养基:MS+0.5 mg ·L -1 6-BA
+0.5 mg · L-1 TDZ ;③增殖培养基:MS +0.5
mg ·L -1 6-BA +0.05 mg ·L -1 NAA 。
1.2.2　多倍体的鉴定　气孔鉴定:相同条件下撕
取植株叶片的上表皮 ,在显微镜(OLYMPLUS-
CH20)下观察单位叶面积内气孔数目和气孔保卫
细胞大小 。
染色体鉴定:对茎尖进行染色体鉴定 ,切取茎
尖依次置蒸馏水中于 4℃, 6 h;0.002 mo l· L-1
8-羟基喹啉溶液 ,2 h;卡诺氏固定液(乙醇∶冰乙
酸体积为 3∶1)室温 , 24 h;58℃下 , 1 mol ·L-1
HCl ,6 min ;45%乙酸软化 ,2 min;蒸馏水漂洗;
改良苯酚品红溶液染色 , 20 min;压片 ,在显微镜
(OLYMPLUS-CH20)下镜检观察并拍照。根尖
染色体鉴定同上。
2　结果与分析
2.1　秋水仙素浸种法的诱导效果
种子经秋水仙素诱导 , 30 d后统计成活率及
多倍体水平(表 1)。从表 1 可以看出 ,以秋水仙
素浓度为 0.5%的成活率最高 ,且嵌合体苗数量
最多 。但生长后期 ,绝大部分嵌合体苗由于根部
畸形无法吸收营养 ,最终死亡 ,存活下来的少量嵌
合体苗不同程度上发生了回复突变 。
表 1　秋水仙素处理雪莲种子的诱导效果
Table 1　 Ef fect of colchicine on induction of S.involucrate seed
处理 T reatm en t
浓度
/(mg· L-1)
Concent ration
时间/ h
Time
总粒数
Number
成活率 Survival rat io
株数
Number
成活率/ %
Survival
rat io
多倍体水平 Ploidy level
二倍体
Diploid
四倍体
Tet raploid
嵌合体
Mixoploid
四倍体细胞平均比例 / %
T he average ratio of
th e tet raploid cell
0 6 100 89 89 89 0 0 0
0.1% 6 100 39 39 36 0 3 16
0.3% 6 100 35 35 33 0 2 20
0.5% 6 100 41 41 29 0 12 38
0.7% 6 100 26 26 19 0 7 41
0.9% 6 100 22 22 17 0 5 44
1.1% 6 100 19 19 16 0 3 47
2.2　秋水仙素浸根法的诱导效果
用秋水仙素处理露白种子 ,并接种在 MS 培
养基 ,40 d后统计成活率和多倍体水平 。从表 2
可见 ,C1 ～ C3组 ,D1 ～ D3组由于浓度过高 ,导致
植株的成活率低 , B3组的嵌合体苗数目最多 ,且
成活率也较好。因此 ,在本试验中以 100 mg ·
L
-1处理 24 h的诱导效果最佳 。
C1 ～ C3组和 D1 ～ D3组的嵌合体苗在生长
后期皆逐渐死亡 。B1 组的嵌合体苗由于四倍体
细胞平均比例太低 ,外观上与对照苗无差别;初
期 ,B2和 B3组的嵌合体苗在外观形态与对照苗
有一定差异 ,具有明显的多倍体特征 ,但后期 ,其
多倍体特征不稳定 ,四倍体细胞比例有明显的下
降趋势。这是由于四倍体细胞比例低 ,且分裂速
度慢 ,从而使其与二倍体细胞竞争时处于劣势 ,导
致四倍体细胞比例逐步下降。
2.3　秋水仙素处理茎段的诱导效果及再生不定
芽的生长
·217·1 期　　　　　　　　　　　　　　　张蜀敏等:新疆雪莲多倍体的诱导初探
2.3.1　秋水仙素处理茎段的诱导效果 　无菌苗
茎段经过秋水仙素处理之后 ,转移到出芽培养基
上进行培养。20 d后 ,茎段部分抽出变异芽。变
异株外观变化显著 ,与对照株相比 ,表现为叶片肥
厚 ,叶形变异 ,茎干短缩 ,植株矮小 ,生长停滞等特
征。对其做气孔检测发现 ,保卫细胞变大 ,单位叶
面积内气孔数目减少 ,具有明显的多倍体气孔特
征。气孔保卫细胞有大小不均一和畸形的现象
(图 1)。部分变异株的同一部位上大小气孔共
存 ,这可能是由于存在不同倍性细胞[ 6] 。
表 2　秋水仙素处理雪莲胚根的诱导效果
Table 2　Effect of colchicine on induction of S.involucrate radicel
处理 Treatment
组别
Group
浓度/(mg· L -1)
Concent rat ion
时间/ h
Time
总株数
Number
成活株 Survival rat io
株数
Number
成活率/ %
Survival
rat io
多倍体水平 Ploidy level
二倍体
Diploid
四倍体
T et raploid
嵌合体
Mixoploid
四倍体细胞平均比例 / %
T he average ratio of
th e tet raploid cell
A1 0 12 30 30 100 30 0 0 0
A2 0 18 30 30 100 30 0 0 0
A3 0 24 30 30 100 30 0 0 0
B1 100 12 30 28 93 25 0 3 13
B2 100 18 30 24 81 16 0 8 21
B3 100 24 30 23 77 12 0 11 27
C1 400 12 30 6 20 2 0 4 35
C2 400 18 30 4 13 1 0 3 38
C3 400 24 30 2 7 0 0 2 41
D1 600 12 30 2 7 0 0 2 47
D2 600 18 30 0 0 0 0 0 0
D3 600 24 30 0 0 0 0 0 0
　　诱导处理后 ,初期各组合成活率都在 90%以
上 ,后期成活率随着处理时间的延长和浓度的增
加呈现显著的下降趋势。茎尖染色体检测表明 ,
b1 ～ e3各组皆有嵌合体苗产生 ,部分茎尖生长点
细胞由2n=2x=32转变为 2n=4x =64(图2),但
无完全的纯合四倍体产生。其中 ,b2的成活率较
好 ,嵌合体苗数量最多 ,且四倍体细胞平均比例较
高 ,达到 54%(表 3)。因此 , 100 mg ·L-1处理 3
d诱导效果最佳 。
表 3　秋水仙素处理茎段的诱导效果
Table 3　Effect of colchicine on induction of S.involucrate stem
处理 Treatment
组别
Group
浓度/
(mg· L -1)
Concent rat ion
时间/ h
Time
总株数
Number
成活株 Survival rat io
株数
Number
成活率/ %
Survival
rat io
多倍体水平 Ploidy level
二倍体
Diploid
四倍体
T et raploid
嵌合体
Mixoploid
四倍体细胞平均比例 / %
T he average ratio of
th e tet raploid cell
a1 0 2 30 30 100 30 0 0 0
a2 0 3 30 30 100 30 0 0 0
a3 0 4 30 30 100 30 0 0 0
b1 100 2 30 22 73.3 15 0 7 38
b2 100 3 30 15 50 5 0 10 54
b3 100 4 30 8 26.7 4 0 4 51
c1 300 2 30 5 16.7 4 0 1 40
c2 300 3 30 5 16.7 3 0 2 44
c3 300 4 30 6 20 4 0 2 56
d1 400 2 30 6 20 3 0 3 46
d2 400 3 30 5 16.7 2 0 3 55
d3 400 4 30 4 13.3 2 0 2 63
e1 500 2 30 5 16.7 2 0 3 58
e2 500 3 30 4 13.3 2 0 2 68
e3 500 4 30 4 13.3 2 0 2 70
注:成活率=成活株数/ 30×100%
Note:Survival ratio=Number of su rvival plant / 30×100%
·218· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
　　　　　　　　　　　　　a.对照株 CK　　　　　　　　　　　　　b.变异株 Variation plant
图 1　雪莲叶片的气孔(10×40)
Fig.1　Stomata from leaves of S.involucrate(10×40)
a.四倍体细胞 2n=4x=64 , T et raploid cell 2n=4x=64　　　　　b.二倍体细胞 2n=2 x=32 , Diploid cell 2n=2x=32
图 2　雪莲中期染色体数目(10×100)
Fig.2　The chromosome number at mitosis metaphase of S.involucrate(10×100)
2.3.2　再生不定芽的生长　根据茎尖染色体的
鉴定 ,秋水仙素诱变后得到的植株为嵌合体 。嵌
合体若不经过分离稳定 ,则会产生二倍体竞争 ,最
后变成正常的二倍体 ,本试验采用再生不定芽技
术对四倍体细胞进行稳定 。低浓度秋水仙素经过
短时间处理对植株的再生能力抑制作用弱 ,可实
现不定芽发生 ,因此 ,本研究对 100 mg ·L -1秋水
仙素处理 3 d产生的嵌合体苗叶片及茎段部分进
行培养。叶片经培养难以出芽 ,需进一步摸索培
养条件 ,而茎段剧烈膨大 ,形成类似愈伤状的疏松
组织 ,并且抽出了再生不定芽。再生不定芽反复
继代一段时间后 ,部分苗外观形态发生了变化 ,即
植株矮壮 ,叶厚 ,且叶形发生了明显的变化(图
3),对其进行染色体的检测 ,得到 4株单苗 ,其四
倍体细胞比例都高于 90%,二倍体细胞比例皆低
于5%,其余为染色体数目间于32-64条的非整倍
体细胞。之后 ,对 4株单苗进行扩繁 ,并多次进行
染色体的鉴定 ,发现四倍体细胞比例有逐渐上升
的趋势。原因可能在于 ,植株中若四倍体细胞占
到极高的比例 ,则在长期的生长过程中会处于优
势 ,将二倍体细胞逐步`淹没 。
　　 a.嵌合体苗　　　　　b.二倍体苗
a.the m ixoploid plant　　　　b.the diploid plant
图 3　嵌合体苗与二倍体苗
Fig.3　The mixoploid plant and the diploid plant
·219·1 期　　　　　　　　　　　　　　　张蜀敏等:新疆雪莲多倍体的诱导初探
3　讨论
本试验采用秋水仙素处理种子 、胚根和茎段
来诱导多倍体雪莲 。前两种方式虽然方法简单 ,
但效果差 ,容易出现回复突变等问题;采用雪莲茎
段结合组织培养以诱导多倍体植株 ,具有诱导率
高 、重复性强 、易扩繁 ,实验条件易于控制 、容易对
嵌合体苗进行稳定等优势。尤其在诱导率上 ,效
果更为显著 ,推测原因在于①根叶完全切除 ,仅保
留茎段 ,能抑制原有叶片与根部的生长 ,促使了茎
尖的分裂 。②本试验在雪莲的出芽诱导培养基中
添加 TDZ ,且在雪莲组培中发现较之其他的细胞
分裂素更有效刺激茎尖生长点的分裂 。 ③DMSO
的渗透作用有利于秋水仙素进入茎尖生长点细
胞 ,提高诱导效果。
在四倍体细胞稳定方面 ,本试验采用了再生
不定芽技术 ,获得了四倍体细胞比例极高的植株。
再生不定芽是由表皮单细胞或邻近几个细胞共同
发育而来 ,若发生的部位是多倍体细胞 ,则不定芽
为完全多倍体;若发生部位由二倍体和多倍体细
胞组成 , 则为嵌合体[ 7] 。苎麻[ 7] 和小花盾叶薯
蓣[ 8]等植物都是通过该方法得到了纯合或者多倍
体细胞比例极高的植株。此外 ,还能够分离到三
倍体 、非整倍体植株 ,从而丰富遗传多样性。另
外 ,本试验未获得完全纯合的四倍体植株 ,一方
面 ,对得到的四倍体细胞比例极高的单株继续诱
导再生不定芽 ,观察其染色体的变化情况 。另一
方面 ,考虑到胚状体起源于单细胞 ,若将嵌合体苗
通过胚状体获得再生植株 ,进行四倍体的稳定 ,效
果会更好。例如曾宪松[ 9] 通过胚状体途径得到了
纯合的四倍体橡胶 。因此 ,对于通过胚状体途径
稳定雪莲四倍体细胞 ,还有待今后进一步的研究。
参考文献:
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·220· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷