全 文 ：第 24卷　第 5期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vol.24　No.5
2009年　9月 　　　　　　　　　　JournalofYunnanAgriculturalUniversity　　　　　 Sept.2009
　收稿日期:2008-06-02　　　修回日期:2008-08-29
＊基金项目:云南省应用基础研究资助项目 (2008CD193)。
　作者简介:何明霞 (1968-), 女 , 湖南澧陵人 , 农艺师 , 主要从事食用菌栽培及外生菌根研究。
E-mail:zzshmx@163.com
＊＊通讯作者 Correspondingauthor:纪开萍 (1966-), 女 , 云南临沧人 , 副研究员 , 主要从事外生菌根食用菌及食
用菌栽培研究。E-mail:jkpcnlc@126.com
暗褐网柄牛肝菌菌丝体培养基的碳
源 、氮源及无机盐的筛选研究＊
何明霞 , 张春霞 , 纪开萍＊＊ ,
侯建勇 , 刘　静 , 王文兵
(云南省热带作物科学研究所 , 云南 景洪 666100)
摘要:通过单因子试验和正交试验 , 研究了不同碳源 、 氮源及无机盐对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响。结
果表明:暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的最佳碳源为葡萄糖 , 最佳氮源为酵母膏 , 最适无机盐为 KH2PO4和 Mg-
SO4· 7H2O。最佳培养基配比为:葡萄糖 20 g, 酵母膏 1 g, MgSO4· 7H2O1.5 g, KH2PO4 1 g, 去皮马铃薯
200g, 琼脂 20g, H2O1 L。
关键词:碳源;氮源;无机盐;暗褐网柄牛肝菌;菌丝
中图分类号:S646.3.035.3　　文献标识码:A　　文章编号:1004-390X (2009)05-0773-05
ScreeningofCarbonandNitrogenSourcesandInorganicSalts
MyceliumCultureMediumofPhlebopusportentosus
HEMing-xia, ZHANGChun-xia, JIKai-ping,
HOUJian-yong, LIUJing, WANGWen-bing
(YunnanTropicalCropsResearchInstitute, Jinghong666100, China)
Abstract:Bythesinglefactortestandorthogonaltest, theefectsofdiferentsourcesofcarbon, nitro-
genandinorganicsaltsonthegrowthofPhlebopusportentosusmyceliawerestudied.Theresultsshowed
thatthebestcarbonsourceandnitrogensourcewereglucoseandyeastcream, respectively.KH2PO4
andMgSO4· 7H2Owerethemostsuitablemineralsalts.Theoptimalcompositionswereasfolows:
glucose20 g, yeastcream 1 g, MgSO4 · 7H2O 1.5g, KH2PO4 1 g, potato200 g, agar20
g, H2O1 L.
Keywords:carbonsource;nitrogensource;inorganicsalt;Phlebopusportentosus;mycelium
　　暗褐网柄牛肝菌 (Phlebopusportentosus), 又
名巨型牛肝菌 , 是兼布于亚洲热带 、 非洲热带和
新西兰等地的一个大型牛肝菌 [ 1, 2] 。常见于龙眼
树 (DimocarpuslonganLaur.)、 大叶树 (Eucaly-
tusrobustaSm.)和红石砾 (Lithocarpusfenzelianus
A.Gamus)等树林下 [ 3, 4] 。在云南西双版纳 , 每
年 7 ～ 9月的雨季为农贸市场上常见的肝褐色食用
菌 , 其味道鲜美 , 深受当地消费者的青睐 [ 5, 6] 。
暗褐网柄牛肝菌营养价值丰富 , 富含蛋白质和钾 、
钙 、 镁 、铁 、锌等多种人体所需的矿质元素 [ 7] 。
本试验通过在单因子试验中确定最佳碳源 、氮源 、
无机盐的基础上 , 采用 L9 (34)正交试验设计确
定各因子的最佳比例 , 以便为暗褐网柄牛肝菌的
人工培养提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌种
暗褐网柄牛肝菌 (Phlebopusportentosus)菌
种从西双版纳热带花卉园采集的野生暗褐网柄牛
肝菌分离获得。
1.1.2　基础培养基
葡萄糖 20 g, 酵母膏 1 g, KH2PO4 1 g, Mg-
SO4· 7H2O1 g, 去皮马铃薯 200 g, 琼脂 20 g,
H2O1L。
1.2　方法
1.2.1　不同碳源对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的
影响
以基础培养基中葡萄糖为对照 , 分别设置麦
芽糖 (20 g)、 乳糖 (20 g)、 蔗糖 (20 g)、果糖
(20g)、 甘露醇 (20 g)、 可溶性淀粉 (20 g)等
7个处理 , 每个处理设 7个重复 , 采用平板培养
法 , 将直径 0.65cm的菌块分别接入培养皿中央 ,
置于 (28 ±1)℃恒温暗培养 。接种第 25 d测量菌
落直径 (以十字交叉法测量), 同时观察菌丝长
势 、菌丝颜色 、 菌落边缘特征等生长指标。对实
验数据用 DPS分析软件进行 LSD差异显著性
检验[ 6] 。
1.2.2　不同氮源对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的
影响
以基础培养基中酵母膏为对照 , 分别设置酒
石酸铵 (1g)、 硫酸铵 (1g)、 氯化铵 (1 g)、硝
酸钾 (1g)、 蛋白胨 (1 g)、尿素 (1g)等 7个
处理 , 每个处理设 7个重复 , 采用平板培养法 ,
将直径 0.65 cm的菌块分别接入培养皿中央 , 置
于 (28 ±1)℃恒温暗培养 。测量方法和指标
同上。
1.2.3　不同无机盐对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的
影响
以基础培养基中 KH2PO4 +MgSO4· 7H2O为
对照 , 分别设置 ZnSO4 · 7H2O(1 g), MgSO4·
7H2O(1g), MnSO4 (1 g), CaSO4 (1g), FeSO4
· 7H2O(1g), KH2PO4 (1 g), NaNO3 (1 g)等
8个处理 , 每个处理设 7个重复 , 其它试验方法 、
步骤 、测定项目同上 。
1.2.4　正交试验
选用 L9(34 )正交表 , 以最佳碳源 (A)、
最佳氮源 (B)、 最佳无机盐 (C)和 (D)为
直接因素进行正交试验 , 以便筛选各因素之间
的最佳组合 。其它试验方法 、 步骤 、 测定项目
同上 。
2　结果与分析
2.1　不同碳源对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的
影响
由表 1可知 , 暗褐网柄牛肝菌菌丝体生长
能利用的碳源种类较为广泛 , 乳糖 、 葡萄糖的
菌丝生长量极显著优于其它 5种糖 , 以麦芽
糖 、 果糖 、 蔗糖 、 可溶性淀粉 、 甘露醇为碳源
的培养基上菌丝生长量差异不显著 。菌丝的颜
色 、 长势等以葡萄糖为最好 , 是较理想的
碳源 。
2.2　不同氮源对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的
影响
由表 2可知 , 暗褐网柄牛肝菌菌丝体在以酵
母膏为氮源的培养基上长势最好 , 培养 25 d菌
落直径为 6.36 cm, 其次为酒石酸铵和 NH2Cl,
这 3种氮源处理的菌丝生长量明显优于其它 4种
处理 。尿素培养基上的菌丝在第 25 d尚未生长 ,
说明尿素对暗褐网柄牛肝菌菌丝的生长有一定
抑制作用 。
2.3　不同无机盐对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的
影响
由表 3可知 , 最佳无机盐是 KH2PO4 +Mg-
SO4· 7H2O, 在以此为无机盐的培养基上菌丝
生长 25 d, 菌落直径为 6.24 cm, 长势最好 ,
这说明 KH2PO4和 MgSO4· 7H2O对暗褐网柄牛
肝菌菌丝体的生长有明显的促进作用 。硫酸锌
不宜作为暗褐网柄牛肝菌菌丝体生长的无机
盐 , 因为以此为无机盐的培养基上生长 25 d,
菌落直径仅为 0.80 cm, 且菌丝生长稀疏 、
纤弱 。
774 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 24卷
表 1　不同碳源对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响
Tab.1　EffectsofdifferentcarbonsourcesonthegrowthofPhlebopusportent
碳源
carbonsources
菌落直径 /cm
colonydiameter LSD0.05 LSD0.01
菌丝长势
myceliumgrowthvigor
菌丝颜色
myceliumcolour
边缘整齐度
regularitymargin
乳糖 lactose 6.27 a A + 浅黄色 lightyelow 不规则 irregular
葡萄糖 glucose 5.73 ab AB ++++ 褐色 brown 整齐 regular
麦芽糖 maltose 5.43 bc B ++++ 褐色 Brown 整齐 regular
果糖 fructose 5.37 bc B +++ 褐色 brown 整齐 regular
蔗糖 sucrose 5.23 bc B ++++ 深褐色 puce 整齐 regular
可溶性淀粉 solublestarch 5.11 c B ++ 黄褐色 tawny 整齐 regular
甘露醇 mannitol 5.06 c B +++ 褐色 brown 整齐 regular
　　注:LSD为最小显著性差异法 , 小写英文字母表示 P<0.05的差异显著性 , 大写英文字母表示 P<0.01的差异显著
性。 “ +” 表示菌丝稀疏 、 纤弱 , “ ++” 表示菌丝较密 , “ +++” 表示菌丝密 、 长势壮 , “ ++++” 表示菌丝浓密 、
粗壮;下同。
Note:ThesignificantdifferencewascomparedwithLSDtest, thesmallletersmeansignificantdiference(P <0.05), the
capitallettersmeanextremelysignificantdiference(P <0.01).“ +” indicatedthatmyceliaweresparseandslim.“ ++” indi-
catedthatmyceliaweredenseandstrong.“ +++” indicatedthatmyceliawerethick, thesameasbelow.
表 2　不同氮源对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响
Tab.2　EfectsofdiferentnitrogensourcesonthegrowthofP.portentosusmycelia
氮源
nitrogensources
菌落直径 /cm
colonydiameter LSD0.05 LSD0.01
菌丝长势
myceliumgrowthvigor
菌丝颜色
myceliumcolour
边缘整齐度
regularitymargin
酵母膏 yeastcream 6.36 a A ++++ 茶褐色 darkbrown 整齐 regular
酒石酸铵 ammoniumtartrate 5.82 ab ABC ++ 褐色 brown 整齐 regular
NH4Cl 5.68 bc ABC ++ 黄色 yelow 整齐 regular
(NH4)2SO4 5.37 bc BC ++ 黄色 yelow 整齐 regular
蛋白胨 peptone 5.18 c BC +++ 褐色 brown 整齐 regular
KNO3 5.04 c C +++ 茶褐色 darkbrown 整齐 regular
尿素 urea 0 d D
　　注:“ -” 表示无变化。　　Note:“ -” indicatednochanges.
表 3　不同无机盐对暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的影响
Tab.3　EfectsofdiferentinorganicsaltsonthegrowthofP.portentosusmycelia
无机盐
inorganicsalts
菌落直径 /cm
colonydiameter LSD0.05 LSD0.01
菌丝长势
myceliumgrowthvigor
菌落颜色
colonycolour
边缘整齐度
regularitymargin
KH2PO4 +MgSO4· 7H2O 6.24 a A ++++ 黄褐色 tawny 整齐 regular
MgSO4· 7H2O 6.05 ab AB +++ 黄色 yellow 整齐 regular
NaNO3 5.81 abc AB +++ 褐色 brown 整齐 regular
FeSO4· 7H2O 5.69 bc ABC ++ 淡黄色 lightyelow 整齐 regular
CaSO4 5.58 cd BC +++ 黄褐色 tawny 整齐 regular
KH2PO4 5.55 cd BC +++ 褐色 brown 整齐 regular
MnSO4 5.13 d C +++ 褐色 brown 整齐 regular
ZnSO4· 7H2O 0.80 e D + 褐色 brown 不整齐 irregular
775第 5期　 　 　何明霞 ,等:暗褐网柄牛肝菌菌丝体培养基的碳源 、氮源及无机盐的筛选研究
2.4　正交试验
按 L9 (34)正交表设计表头 , 以因子葡萄
糖 、酵母膏 、 MgSO4 · 7H2O, KH2PO4 为指标进
行正交试验 (表 4)。由表 5可知 , 在所供试的培
养基中菌丝长势和菌落颜色 、 边缘整齐度无明显
差异。而菌丝生长量差异显著 , 碳源 、 氮源和无
机盐的最适配比为 A2B1C3D2 , 即得出的适宜培养
基组成为葡萄糖 20g, 酵母膏 1 g, MgSO4· 7H2O
1.5 g, KH2PO4 1 g。极差分析表明 , 对暗褐网柄
牛肝菌菌丝生长影响最大的因素是 MgSO4 ·
7H2O, 其次为 KH2PO4 和葡萄糖 , 酵母膏影响
最小 。
表 4　L9(34)正交试验因素与水平
Tab.4　ThefactorsandlevelsofL
9
(34)orthogonaltest
水平
level
因　素 factor
A
葡萄糖 /g
glucose
B
酵母膏 /g
yeastcream
C
MgSO4· 7H2O
/g
D
KH2PO4
/g
1 15 1 0.5 0.5
2 20 2 1 1
3 25 3 1.5 1.5
表 5　L
9
(34)正交试验结果
Tab.5　L9(34)Resultsoforthogonaltest
编号
number
葡萄糖 (A)
glucose
酵母膏 (B)
yeastcream
MgSO4· 7H2O
(C)
KH2PO4
(D)
水平组合
combinationlevel
菌落直径 /cm
colonydiameter
长势
growthvigor
1 15 1 0.5 0.5 A1B1C1D1 5.79 +++
2 15 2 1 1 A1B2C2D2 6.26 ++++
3 15 3 1.5 1.5 A1B3C3D3 6.36 +++
4 20 1 1 1.5 A2B1C2D3 5.63 ++++
5 20 2 1.5 0.5 A2B2C3D1 6.68 ++++
6 20 3 0.5 1 A2B3C1D2 6.84 ++++
7 25 1 1.5 1 A3B1C3D2 6.79 ++++
8 25 2 0.5 1.5 A3B2C1D3 5.13 ++++
9 25 3 1 0.5 A3B3C2D1 4.91 +
K1 18.41 18.21 17.76 17.38
K2 19.15 18.07 16.80 19.89
K3 16.83 18.11 19.83 17.12
K1 6.13 6.07 5.92 5.79
K2 6.38 6.02 5.60 6.63
K3 5.61 6.03 6.61 5.70
R 0.77 0.04 1.01 0.92
776 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 24卷
3　结论
(1)碳源试验中 , 暗褐网柄牛肝菌菌丝于葡
萄糖培养基中生长状态最佳 , 菌落完整 , 菌丝褐
色 、浓密 、 健壮;在乳糖培养基中菌丝生长稀疏 、
纤弱 、 气生菌丝量少 , 不宜作为暗褐网柄牛肝菌
菌丝生长的碳源 。结果表明葡萄糖可以作为暗褐
网柄牛肝菌母种的适宜碳源。
(2)氮源试验结果表明:有机氮源对暗褐网
柄牛肝菌菌丝生长比较有利 , 而无机氮源的影响效
果相对次之;暗褐网柄牛肝菌菌丝对氨态氮的利用
能力明显强于硝态氮;而尿素抑制菌丝的生长。
(3)无机盐试验中 , 最佳无机盐为 KH2PO4
和 MgSO4· 7H2O。镁和钾是微生物生长过程中所
需的大量元素 , Mg2+对菌丝体生物量转化有促进
作用 , 而硫酸锌对暗褐网柄牛肝菌菌丝体生长有
一定的抑制作用 。
(4)由 L9(34)正交试验筛选出了供试营养
要素的最适配比 , 暗褐网柄牛肝菌菌丝生长的最
适培养基配比为葡萄糖 20 g+酵母膏 1 g+硫酸镁
1.5g+KH2PO4 1 g+琼脂 20g+去皮马铃薯 200 g
+H2O1L。
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777第 5期　 　 　何明霞 ,等:暗褐网柄牛肝菌菌丝体培养基的碳源 、氮源及无机盐的筛选研究