全 文 ：第 8 1卷第 2 期
1 9 9 5年 5月
浙江师大学报 ( 自然科学版 )
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光质和碳素对旱芹体细胞胚发生的影响 ’
徐根娣 , 李 瑶 2 贾 林 , 叶鸣明 2 倪德祥 2 沈大徒 2
(l
. 浙江师范大学生物 来 2 . 复旦大学遗传所 3 . 第二军医大学克隆公司 )
摘 要
本文以早芹愈伤组织为材料 , 初步探讨了光质 , 碳源对旱芹体细胞胚发生的影响 。 结果表明 , 光质中蓝光对
旱芹愈伤组织的诱导及植株再生的促进作用最强 , 红光作用最弱 . 蔗搪的浓度也影响到胚的发生 ,蔗糖浓度太
高或太低都不利于产生体细胞胚和体细胞胚成熟 ,最适蔗糖浓度为 3环 .
关键词 : 旱芹 ;体细胞胚 ;光质 ;碳源
O 弓I言
植物组织培养中 , 植物细胞经历了脱分化与再分化的过程 , 其中体细胞胚是植物再分化的
一种主要途径 。在植物脱分化过程中 ,除了植物材料本身的特性外 ,外界理化因素如植物激素 、
营养成份 、 光照 、 温度等都会影响体细胞胚的发生 。 植物激素的影响最受人注意 〔” 〕 , 光质和光
量对愈伤组织的影响也有报道 2[ 一 ” ,但光质对体细胞胚发生的影响报道不多 。 旱芹体细胞胚的
发生早在 1 9 7 6 年就有报道 l[ ’ 〕 , A I一 A bt a 研究了 2 . 4一 D 对旱芹组培的影响 ls[ 〕 , 但光质对其影响
未见有报道 。 我们曾报道旱芹单细胞培养再生植株成功 〔’ 〕 ,在此基础上作一些理化调控研究 。
本实验主要是研究光质和碳素对体细胞胚的影响 ,从而得出比较合理的光质 、 碳源条件 , 并为
进一步研究旱芹体细胞胚发育提供一定的实验依据 。
1 材料与方法
材料为旱芹 ( A P i u m g ar v e of 绷 L . )种子和 叶片 , 旱芹愈伤组织诱导及单细胞培养同【1 ] 。
1
.
1 光质对旱芹愈伤组织诱导的影响
用 M s + 2 . 4一 D l m g / L + K T O . s m g / L 诱导旱芹叶片 , 置于表 1 中的各种光下诱导 , 每天光
照 1 h2 , 30 天后观察愈伤组织生成情况 , 统计鲜重 。
表 1 各种关光灯的技米参数
白 (W ) 红 ( R ) 黄 ( Y ) 绿 ( G ) 蓝 ( B ) 黑 ( D )
波长 ( n m )
光照度 ( lx )
6 1 0 5 8 0
9 6 0 12 5 0
5 4 5 4 3 0
7 0 0 1 5 0
1
.
2 光质和激素对旱芹体细胞胚成熟生成幼苗的交互作用
将白光中由叶片诱导的愈伤组 织作材料 , 选择以 下培养基再分化苗 : I : M S。 (无任何激
素 ) ; 卜 M S + K T o . s m g / L ; l : M S + K T O . s m g / L + 2 . 4一 D O . s m g / L ; VI : M S + K T o . s m g / L +
N A A .O Zm g / L + 6B A Zm g / L
。将每种处理的培养材料放在不同光质下培养 ,观察体细胞胚成熟
及再生苗情况 , 30 天后统计鲜重及胚数 (鲜重及胚数均为每 1 0 ml 三角烧瓶中的量 ) 。
本文 于 1 9 9 5 年 3 月 24 日收到
浙江师大学报 ( 自然 科学版 ) 19 9 5年
1
.
3碳源对旱芹愈伤组织继代的影响
单细胞来源的愈伤组织接种于 M S +2 .4 一D l m g /L培养基 中 , 添加不同浓度的蔗糖 , 在黑
暗条件下培养 , 生长一个月后 ,统计鲜重 ,一部分愈伤组织转入到 M S 。 + 3 %蔗糖的分化培养基
, 生长一个月后 ,统计鲜重 , 观察出苗情况 以研究第一培养基中蔗糖浓度的影响 。
4 碳源对旱芹体细胞胚成熟的影响
将单细胞来源的愈伤组织在 M s 。 + 3% s u g a r 和 l / ZM s 。 + s u g a r
上L
1 0 0 0玩 的光下每天光照 1h2 , 一个月后统计成苗情况 。
的培养基上再生苗 , 在
.一 .2 结果与讨论
2
.
1 光质对旱芹愈伤组织诱导的影响
结果如图 1所示 。 可以看出 ,绿光和蓝光对愈
伤组织的诱导最有利 , 白光次之 ,红光的诱导能力
最弱 , 在黑暗条件下 ,愈伤组织生长最慢 。 这些愈
伤组织大多停 留在球形胚阶段 ,将这些愈伤组织
转移至 M S 。 中 , 在正常光照下 , 均能再生成苗 。
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由于愈伤组织 的继代次数愈多 , 变异积累会 图 1
越多 , 为使愈伤组织生长缓慢 , 减少继代次数 , 把 2
所需保存的愈伤组织都置于黑暗条件下 , 这既不
失胚性能力 , 又减少变异积累 。
2
.
2 光质和激素对旱芹体细胞胚成熟的交互作用
结果如图 2一 4 ,从图中可得出如下结论 :
( l) 从鲜重上看 ,几种光质中 , 蓝光对旱芹体
细胞胚发生最为有利 ,其次是白光和黄光 。红光 咋
用最弱 , 其鲜重和黑暗中比较 ,几乎无影响或稍有
抑制作用 。 成熟胚的数目的变化趋势与鲜重相似
( 图 3 ) ,但从畸形胚的比例分析 ( 图 4 ) , 蓝光下产
生畸形胚最少 , 其次是绿光 ,黄光和白光差不多 。
红光诱导的畸形胚最多 。从以上分析可得出 , 蓝光
对旱芹体细胞胚发生最为有效 ,红光无效或有抑
制作用 。 ( 2) 激素对体细胞胚发生的影响 。 完
全无激素时 (培养基 I ) , 无论在何种光质下 , 生成
的幼苗最
图 2 不 同光 质和激 素对鲜重的影响
培养基 I △培养基 I ▲培养基 I + 培养基 w
10 、夕DO加0为了11
撼目疾值
l 一 _`砂 只 、 呀 B
图 3 不 同光质和激素对成熟胚数的影响
· 培养基 I △培养基 I ▲培养基 I
图 4
田 只 丫 q 6
不 同光质和激 素对崎形胚的影响
· 培养基 l 八培养基 I ▲培养基 I
第 2 期 光质和碳素对旱芹体细胞胚 发生的影响 徐根娣 李 瑶等 5 9
多 , 而且畸形胚的比例最小 。随着培养基中激素种类的增加 , 苗逐渐减少 , 畸形胚的比例逐渐增
加 , 在培养基 VI 中 , 仅生成绿色的愈伤组织 , 已看不出苗的基本形状 , 至多长出肉质化的 叶 。 在
培养基 l 、 l 中 ,鲜重和苗数差异较小 , . 还略高于 l ,这可能是生长素和细胞分裂素协调作用
的结果 ; 但畸形胚的比例 l 明显高于 l ,说明胚成熟过程中 , 不需要外源激素的调控 。
(3 )在四种培养基中 , 培养基 I 由于无激素而受光质影响比较大 (图 2一 4 中第一条曲线起
伏程度大 ) , 但培养基 I 、 l 、 W 中光质的影响逐渐减弱 , 由此可以推测激素的影响比光质的影
响大 。 培养基中无外源激素 , 光质的影响明显 ;有外源激素时 ,掩盖了一部分光质的作用 ;当激
素的影响太大时 ,光质的影响便可忽略 。
一些研究者认为 , 激素对植物组织培养的形 态发生起决定作用 , 而光质只起一种补偿作
用 , 只从数量上影响形态发生 ,并不能代替激素的作用 。
N e w co m b 和 w et he er l s] 认为短期远红光照射能增加胚的形成 , 但没提供确切证据 。 M ihc -
le r v[] 详细研究了光质对胡萝 卜体细胞胚发生的影响 , 发现高强度的 白光和蓝光抑制愈伤组织
生长和胚发生 ,红光和绿光与黑暗处理相同 , 产生最多胚状体 。 在持续光照下 , 蓝光中的细胞产
生次级胚 , 并促进下胚轴伸长 ; 红光中的培养物产生多子叶 ,胚轴长度正常 。 而 T o m as s[] 等发现
在西红柿和葛芭组织培养中 ,蓝光抑制胚轴 伸长 。 本实验中 , 发现不 同光质对旱芹胚状体的形
态无显著影响 , 光质只影响了胚状体及愈伤组织的数量 。
w ie
s 等闭和 eS ib er t 等 s1[ 都发现蓝光对烟草组织培养的器官起重要的作用 ,与本实验的结
论相似 。植物光形态建成是一个复杂的过程 , 现在 已知道 , 高等植物体内至少存在三种光受体 ,
即叶绿素内醋 , 光敏色素及一种或多种蓝光受体 。 这些光受体究竟怎样起作用还不清楚 。 参与
一个简单的过程 ,常常需两个光受体存在 ,蓝光效应涉及到蓝光受体和光敏色素两种光受体的
作用 。 对植物光形态建成的研究 ,常常由于调控一个特定过程的不同光受体 ,或一个光受体引
起多种生物学效应而复杂化 。
光究竟对植物的光形态建成起什么作用 , 其假说很多 , 普遍认为光与受体作用后 , 调控植
物基 因的开闭 ,起动或阻止酶的合成等一系列反应 , 因而调控植物体内的一 系列代谢变化 ,从
而影响形态建成 。
2
.
3 碳源对旱芹愈伤组织继代的影响
统计结果如表 2 ,蔗糖浓度太低或无时 , 生成的愈伤组织量少而且无胚性能力 , 不能再生
成苗 ;蔗糖浓度太高 , 如为 9%时 , 愈伤组织多呈球形胚 ,虽具胚性能力 ,但愈伤组织生长极慢 ,
量少 , 而且再生能力有所下降 ;蔗糖浓度为 3%时 , 只停留在胚性愈伤组织阶段 , 球形胚甚少 ,
但愈伤组织量多 ,再生能力强 ,而且正常苗比例高 。
L u 等 〔 ,〕报道 , 12 %的蔗糖有利于玉米体细胞胚的发生 , 但不利于胚性结构的保持 。 而
v as il 等 〔’ 0] 用 2 %的蔗糖成功地将上述玉米的愈伤组织保持下来 。 这与本实验的结果是一致
的 。 本实验用 3 %的蔗糖最为合适 ,蔗糖浓度太低 ,愈伤组织的胚性能力也会丧失 。 很可能高浓
度的蔗糖有利于诱导体细胞胚的发生 , 而较低浓度的蔗糖则有利于维持胚性结构 。
表 2 不 同蔗糖浓度对旱芹愈伤组织继代的影响
蔗糖浓度 ( w / v) 0 1% 2% 3% 5% 7% 9%
鲜重① 0 . 4 6士 0 . 15 0 . 6 3士 0 . 2 0 3 . 2弓士 0 . 4 9 3 . 4 6士 0 . 0 9 2 . 5 9士 0 . 3 0 1 . 6 1士 0 . 3 8 0 . 7 2士 0 . 18
鲜重② 0 . 3 1 ’ 士 0 . 0 6 0 . 4 2士 0 . 15 0 . 7 4士 0 . 16 2 . 1 5士 0 . 18 2 . 18士 0 . 2 1 1 . 4 7士 0 . 2 7 0 . 3 1士 0 . 0 9
出苗数 / / + + + + + + + + + + + +
① M s + 2 . 4一 D z m g / L \ ②M oS + 3% s u g a r , 愈伤组织死 t
2
.
4 碳源对旱芹体细胞胚成熟的影响
结果如表 3 所示 。 由表中可看出 , M S 。 较 12/ M S 。 更有利于胚的成熟 , 生成更多的幼苗 , 但
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M S
。 中的苗叶小 ,胚轴短 ,根 多 , 而 l 2/ M S 。 中叶片展开 , 苗大 ,根正常 。 因此在诱导植株再生
时 ,先在 M S 。 中培养一个月 ,再转移至 12/ M S 。 中使苗长大 。
表 3 蔗糖浓度对旱芹休细胞成熟的影响
蔗搪浓度 ( w八 ) 0 1 % 2% 3% 5% 7% 9% M S。 + 3% S
鲜重 ( g ) 0 . 8 3士 0 . 1 7 1 . 0 9士 0 . 2 0 1 . 15士 0 . 1 8 1 . 3 5士 0 . 2 6 1 . 5 3士 0 . 3 8 1 . 39士 0 . 4 0 1 . 0 6士 0 . 1 6 2 . 5 0士 0 . 3 2
成熟胚数 5 2士 5 5 7 :L 4 55士 5 6 8士 7 9 8士 1 0 9 7士 7 6 4士 3 2 0 1士 2
1 / ZM S
。 中 , 不同浓度的蔗糖对再生苗的量有影响 , 但不如蔗糖对愈伤组织生长的影响大 ,
这可能是因为 ,一旦长出绿色的子叶 ,愈伤组织就能进行光合作用 ,变为部分自养 ,合成少量糖
类而不完全依靠培养基中的糖份 。 但蔗糖的浓度对胚数及鲜重仍有一定影响 , 其最适浓度为
5 %
。 蔗糖浓度太高 (9 % ) , 植物再生的频率降低 ,而且畸形苗的比例也增大 。
参考文献
l 李瑶等 . 复旦学报 . 1 9 9 0 , 2 9 ( 4 ) : 3 8 0一 3 8 6
2 F r ibo r g G
.
e t a l
.
P h y is o l P la n t
,
1 9 7 5 3 4
:
1 6 2 ~ 16 6
3 eS i悦r t M , e r a l. P h y s io l P h a n t , 1 9 7 5 , 5 6 : 1 3 0一 1 3 9
4 W
e i s J S
.
e t a l
.
P h ” i o l P h a n t , 1 9 6 9 , 2 2 : 17 1
5 K a d k a d e
,
P G
.
e r a l
.
N a t u r e
。
1 9 7 7
,
2 70
: 4 9
6 N e w e o n l b w
,
W e t h 。理il D . F . a 〕 t G a z , 1 9 7 0 , 1 3 1 : 2 4 2 ~ 2 4 5
7 M i
c h le r G H
.
e t a l
.
P抽 n t 众 l T is u e a n d or ga n e u l t u r e , 19 8 7 , 1 1 ( 3 ) : 18 9 ~ 2 0 7
8 T h oma
s
b
.
P坛n t a l 9 7 9 , 1 4 6 : 5 4 5一 5 5 0
9 I u
.
C
.
Y
.
e t a l
.
t】l oe r A p p l . C e n e t l 9 8 3 , 6 6 : 5 8 5一 58 9
1 0 V a s i l V
.
e r a l
.
Ame
r
.
J
. 压〕 t , 19 8 4 , 7 1 : 1 5 8一 1 6 1
1 1 E
v
an s P A
.
e t a l
.
In P】a n t T is u e C u i r ur e M e t h记 5 . 1 9 8 1
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.
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T h e m os : 。 犷丁; 〔 io n t e 。 。 。二 , , : r a t i o n o f s u g a r 15 3%
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(责任编辑 肖慧明 )