全 文 ：收稿日期:2007-11-08
作者简介:周小云(1977-),男,硕士 ,助研, xiaoyunzhou77@126.com;＊通讯作者,mudun12700@163.com
基金项目:国家自然科学基金(30160039),新疆维吾尔自治区高技术研究与发展计划(200511103)
研究
简报
新疆陆地棉转雪莲 PEBP基因抗寒性研究
周小云1 , 马　盾1＊ , 危小薇1 , 艾秀莲2 , 黄乐平1
(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所 ,新疆农作物细胞工程重点实验室 ,
乌鲁木齐 830091;2.新疆农业科学院微生物研究所 ,乌鲁木齐 830091)
摘要:在环境气温骤降情况下 ,研究了转雪莲 XLPEBP 基因陆地棉后代的抗寒性 ,结果表明 , 2
份转基因陆地棉后代(T2)材料 ,抗寒性显著高于对照材料 ,其中的功能基因有一定的表达作用。
关键词:花粉管;雪莲;XLPEBP 基因;棉花;抗寒性
中图分类号:S562.035.3　　　文献标识码:A
文章编号:1002-7807(2009)01-0064-03
The Responses of the Xinjiang Upland Cotton Transformed with XLPEBP
Gene to Low Temperature
ZHOU Xiao-yun1 ,MA Dun1＊ ,WEI Xiao-wei1 , A I Xiu-lian2 ,HUANG Le-ping1
(1.Inst i tute o f Nuclear and Biological Technolog y , X inj iang Academy o f Agricultural S ciences ,
X inj iang Key Laboratory of F arm Corp Cel l Eng ineering , Urumqi 830091 , China;2.Inst itute o f
Microbiology ,X inj iang Academy o f Agricultural S ciences , Urumqi 830091 ,China)
Abstract:The responses o f the Xinjiang upland cot ton t ransformed w ith XLPEBP gene to low tem-
perature w ere studied under air temperature suddenly falling situa tion.T he results showed:the resist-
ance to f reeze injury in the of fspring (T 2)of the co t ton w as stronge r than the contro l , the X LPEBP
gene show ed i ts expression and function in the co t ton.
Key words:po llen-tube pathw ay;sasussured involucrate Kar.et Kir;XLPEBP;co tton;cold tolerance
　　新疆属典型的大陆性气候 ,春季气候多变。
尤其是新疆北部 ,倒春寒发生频繁 ,导致棉花幼苗
受到低温伤害 ,每年平均造成几万公顷死苗和僵
苗 ,给棉花生产带来了严重损失[ 1-2] 。新疆农科院
微生物研究所分离 、克隆的雪莲(sasussured in-
volucrate Kar.et Kir)拟磷脂酰乙醇胺结合蛋白
(pho sphatidy lethanolamine-binding pro tein ,
XLPEBP)基因 ,在低温诱导下有改变细胞质膜
流动性作用[ 3] 。经农杆菌介导拟南芥鉴定证明 ,
该基因具有一定的抗寒(旱)作用。新疆农科院核
技术生物技术研究所从 2005年起 ,通过花粉管通
道法转化技术 ,将雪莲拟磷脂酰乙醇胺结合蛋白
基因(XLPEBP)导入棉花中 , 获得转基因后代
(T 2)植株 。
1　材料和方法
1.1　材料
转 XLPEBP 基因陆地棉幼苗 2份:新陆早
17号(新 B 17)转 XLPEBP 基因后代(T 2)192株
和石 K5转 XLPEBP 基因后代(T 2)47株 。均种
植在与大田气候环境相同的试验田中。
1.2　方法
1.2.1　天气情况及调查 。5月 11 日 ,寒流侵袭
北疆 ,气温从 25℃骤降到 6℃,持续 1 d;13日寒
流又侵袭 ,气温降到 4℃,持续 1 d。2 d以后天气
晴朗 ,气温回升到了最高 25℃。此时 ,幼苗叶片
冷害表现明显 。根据棉苗受冷害的程度 ,设定相
应的棉苗抗冷害标准 ,对转 X LPEBP 基因的每
　棉 花 学 报　Co tton Science　　2009 , 21(1):64～ 66
株棉花幼苗(T 2)进行田间客观的抗冷害评价 。
1.2.2　标记基因的田间筛选。转基因植株种植
到第 2 代 ,仍然存在着遗传分离 。对此 ,当棉苗
(T 2)生长出 2片真叶时 ,在幼嫩真叶上开始涂抹
Basta除草剂 ,浓度为 0.025%, 7 d 和 14 d后分
别再将遗漏或疑似的植株涂抹 1 次 ,共涂抹除草
剂 3次 ,最终筛选出抗除草剂幼苗 ,挂牌记录 。
1.2.3　PCR分析。经过田间筛选 ,取最终确定
为抗除草剂(阴性反应)植株新长出的幼嫩叶片 ,
按 CTAB法提取总 DNA 。根据 X LPEBP 基因
序列 ,设计合成特异性的引物:
引物 1:5-CCA TCT CCA ACA ACC CAA-3;引
物2:5-GCC GCC AGT ACA AAA TCA A-3。
以提取的总DNA为模板 ,加上 XLPEBP 引
物 、反应缓冲液 、dNTP 和 Taq 酶后 ,进行 PCR扩
增。预变性 3 min , 95°C 变性 30 s , 54.7°C 复性
30 s ,72°C 延伸 1 min ,32 个循环后 , 72°C 再延伸
10 min。将扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳并
在凝胶成像仪上照相 。PCR分析重复 3次。
2　结果与分析
2.1　田间冷害调查
2007年 4月 23日 ,将种子播种在试验田中 ,
5月 1日开始出苗 ,当真叶开始露头 , 5月 11日和
13日两次寒流侵袭北疆。本试验在这种情况下 ,
对转雪莲抗寒基因棉花植株进行田间抗冷害调
查。从表 1分析:新陆早 17号重度受害或中度受
害的占 18%,对照高达 80%;石 K5 重度受害或
中度受害的占 23%,对照高达 79%;新陆早 17号
轻度受害或没受害的占 82%,对照仅有 20%;石
K5轻度受害或没受害的占 76%,对照仅有 21%。
以上结果均差异明显 。
2.2　田间标记基因(除草剂)植株的筛选
从幼苗长出第 2片真叶开始 ,每隔 7 d ,在新
长出的幼嫩真叶上涂抹 0.025% Basta 除草剂 ,
经过 20余天 ,共涂抹 3次 ,筛选确定抗除草剂植
株 ,两个(T 2)后代材料共获得 57株抗除草剂植
株。其中 ,子叶没有受冷害斑点的 37株(新陆早
17号 28株 ,石 K5 9株)材料均抗除草剂。
2.3　转基因植株后代的 PCR检测分析
验证棉花后代中 XLPEBP 基因导入与否 ,
将除草剂处理后表现抗性的 41株棉株(包括子叶
没有受害斑点的 37株 ,编号 8 至 44)进一步进行
分子检测:8株未产生扩增片段 , 34株抗性植株均
产生了扩增片段(图 1)。
在寒流侵袭后 ,棉花两片子叶均没受害斑点
又抗除草剂的 37株植株中(编号 8至 44)有 33
株产生了扩增片段 , 4 株未产生扩增片段 。这 4
株未扩增出目标条带 , 可能是在 PCR 实验中
DNA 模板的质量直接影响 PCR 结果 ,在 DNA
提取中个别的模板 DNA 提取不理想。具体原因
需要进一步研究。
3　小结与讨论
3.1　试验结果表明 XLPEBP 基因导入棉花植
株体内后 ,种植到第 2代(T 2)时 ,在自然环境条
件下 ,转基因植株的抗冷害能力明显高于对照材
料 ,功能基因有一定的表达作用。
3.2　倪万潮等[ 4] 提出 ,在转基因抗虫棉的研究中
就可以直接鉴定转基因植株的抗虫性 ,来达到获
得转基因植株的最终目的 。而转基因抗病棉的鉴
定则可以在人工病圃或天然病圃中直接进行转基
因抗病性的筛选。这次直接利用自然环境对转抗
寒基因的棉花筛选进行了一次尝试 ,初步证明是
可行的 ,结果也是直接的 。若在目标性状的鉴定
顺序为标记基因到生物学 ,再进行目的基因及其
表达的分子鉴定 ,这样可能对目的基因及其表达
的分子鉴定带来更多的方便。本实验先直接针对
目标性状的表现型测定 ,再进行标记基因鉴定 ,这
样双重鉴定后 ,为目的基因及其表达的分子鉴定
省去了大量的重复工作。
表 1　田间调查结果
Table 1　The results from the f ield
受害
等级 调查情况
新 B 17
株数 占总数/ %
对照
株数 占总数/ %
石 K5
株数 占总数/ %
对照
株数 占总数/ %
4 两片子叶死亡(重度) 11 5.7 29 29 2 4.3 30 30
3 两片子叶斑点较多但未死亡(中度) 24 12.5 51 51 9 19.1 49 49
2 单片子叶有2 斑点以上但子叶正常 86 44.8 20 20 14 29.8 21 21
1 子叶有 1～ 2 个斑点 43 22.4 0 0 13 27.7 0 0
0 没斑点 28 14.6 0 0 9 19.1 0 0
651 期　　　　　　　　　　　　周小云等:新疆陆地棉转雪莲 PEBP 基因抗寒性研究
　　1.DL DNA maker;2.pX LP EB P 质粒阳性对照;3为转化植株阴性对照;4 ～ 44 除草剂抗性植株;4 , 6 , 9 , 10 , 12 ～ 19 ,
21 ～ 33 , 35 ～ 44 PCR结果为阳性的植株。
图 1　XLPEBP 基因 PCR扩增
Fig.1　PCR analysis of transgenic plant
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66 　　 　　　　　　　　　　　　　　　　棉　花　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　 21卷