全 文 :工 艺 技 术
2013年第8期
Vol . 34 , No . 08 , 2013
三种浸提方法从普通小球藻中
提取油脂的比较研究
张 梦,程露萍,李昌灵,李宇佶,杨海麟*
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122)
摘 要:分别采用直接浸出、索氏提取和超声波辅助提取三种方法从小球藻(Chlorella vulgaris C9-JN2010)藻粉中提
取油脂。选择了三种方法各自的最适提取剂,研究了提取时间对提取率的影响以及提取方法对小球藻油脂肪酸组成
的影响。结果表明,三种方法的提取率最高可分别达到84.06%、89.11%和88.66%,所得油脂在脂肪酸组成上无明显差
别。超声波辅助提取法的提取效率最高、具有工业放大的前景。小球藻油中亚麻酸、亚油酸等多不饱和脂肪酸含量较
高,可作为功能性油脂进行开发。
关键词:油脂浸提,普通小球藻,提取率,脂肪酸组成
Study on comparison of three different extraction methods to extract oil
from Chlorella vulgaris
ZHANG Meng,CHENG Lu-ping,LI Chang-ling,LI Yu-ji,YANG Hai-lin*
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,
Wuxi 214122,China)
Abstract:Leaching method,Soxhlet method and ultrasonic-assisted method were selected to obtain oil from
Chlorella vulgaris C9-JN2010. Both the effect of extraction time on extraction ratio and the effect of extraction
methods on fatty acids composition were studied after the best slovent of each method were selected. The
results showed that the extraction ratio of leaching method,Soxhlet extraction method and ultrasonic-assisted
extraction method could come up to 84.06%,89.11% and 88.66%,respectively. And the lipid obtained by those
three methods was not significantly different in fatty acids composition. As the most efficiency method,
ultrasonic-assisted method was suitable for industrial amplification. The oil from Chlorella vulgaris C9-JN2010
had potential to be functional oil because of the high content of unsaturated fatty acid,such as linolenic acid
and linoleic acid.
Key words:oil extraction;Chlorella vulgaris;extraction ratio;fatty acids composition
中图分类号:TS225.6 文献标识码:A 文 章 编 号:1002-0306(2013)08-0245-05
收稿日期:2012-10-09 * 通讯联系人
作者简介:张梦(1986-),男,硕士研究生,研究方向:发酵工程。
基金项目:“863”项目子课题(2012AA021201);高等学校博士学科点
专项科研基金(20100093120002)。
小球藻是一类具有高光合作用效率、强环境适
应能力的富油微藻[1-3],与螺旋藻、盐藻、栅藻等微藻
一起构成了微藻生物技术,具有非常广阔的发展前
景[4]。以小球藻干粉为原料提取可得到小球藻油,小
球藻油中富含不饱和脂肪酸(PUFAs)和多种功能性
成分[5-8]。这些不饱和脂肪酸具有非常独特的生理功
效,能提高人体免疫机能的调解能力,防止记忆力的
减退,同时还能预防和治疗心血管疾病及癌症。因
此,小球藻油是一种营养和保健功能俱佳的油料。在
众多的油脂提取方法中,压榨法和水酶法的残油率
高[9],常用于含油率较高的原料(如芝麻、花生)中油
脂的提取;超临界流体萃取法对设备要求很高,成本
较大;而浸提法对设备要求低、操作简单、提取率
较高,且操作温度低,能有效避免活性成分的损失,
是目前常用的小球藻油提取方法。浸提法利用能溶
解油脂的有机溶剂,通过渗透、湿润、分子扩散和对
流扩散等作用将油脂提取出来。常见的浸提法有直
接浸出、索氏提取和超声波辅助提取。本文比较了这
三种方法对小球藻油提取率和脂肪酸组成的影响,
旨在为小球藻油的提取及综合利用的相关研究奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
小球藻藻株Chlorella vulgaris C9-JN2010 由本
实验室从黄海海域海水中分离并经人工选育获得;
正己烷、石油醚、乙醚、氢氧化钾、甲醇等分析纯试剂
国药集团化学试剂有限公司。
FA1004型电子天平 上海市天平仪器有限公
司;DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精密
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2013年第8期
实验设备有限公司;索氏提取装置 北京朋利驰科
技有限公司;R-25型旋转蒸发仪器 无锡申科仪器
厂;YLD-6000型数显恒温水浴锅 金坛市城东科辉
仪器厂;JY88-Ⅱ型超声破碎仪 上海将来实验设备
有限公司,变幅杆末端直径6mm;HITACHI冷冻离心
机 日本日立公司;LABCONCO冷冻干燥机 美国
LABCONCO公司;QUANTA-200型扫描电镜 荷兰
FEI公司;TRACE GC2000-TRACE MS气质联用色谱
美国菲尼根公司。
1.2 实验方法
1.2.1 藻粉的获得 先在250mL锥形瓶中用SE培养
基进行藻种活化,培养温度控制在26~28℃,通入经
0.3μm滤膜过滤的空气,光照/黑暗交替培养(12/12h)。
4d后将藻种转接到5L的玻璃瓶中,以BG11为培养基
进行扩大培养,培养条件与菌种活化的相同。当培养
液在680nm处的吸光值达到1.5时,将藻液离心收集
得到藻泥,再将藻泥冷冻干燥即得藻粉。
1.2.2 预处理 称取2g左右小球藻粉于60℃烘箱中
干燥至恒重(两次重量差小于0.2mg),记录最终重
量。将干燥后的小球藻粉放入研钵中,研磨20min后
全部收集备用。
1.2.3 选择提取剂 分别用石油醚1(沸程30~60℃)、
石油醚2(沸程60~90℃)、正己烷、乙醚和三氯甲烷这
五种有机溶剂来提取小球藻粉中的油脂,以考察各
方法在不同溶剂下的提取率。在提取时间为2h的前
提下,最高提取率对应的溶剂选做该方法的提取剂。
1.2.4 油脂提取方法
1.2.4.1 直接浸出 在常温下(25℃),将预处理后的
小球藻粉置于250mL锥形瓶中,加入100mL提取剂提
取,期间适当振荡混匀,提取结束后,加入10%氢氧
化钾溶液沉淀小球藻细胞,摇匀静止10min后,收集
上层有机相于已干燥恒重的圆底烧瓶中,旋转蒸发
除去溶剂,称量。
1.2.4.2 索氏提取 将预处理后的小球藻粉转入滤
纸筒,再将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内,提取
瓶内加入100mL提取剂,水浴加热,使提取剂不断回
流提取(约6次/h),提取结束后,将提取剂转移至已
干燥恒重的圆底烧瓶中,旋转蒸发除去溶剂,称量。
1.2.4.3 超声波辅助提取 在常温下将预处理后的
小球藻粉置于250mL锥形瓶中,加入100mL提取剂,
然后将超声破碎仪的超声探头插入锥形瓶中辅助提
取(探头底部距离锥形瓶底部约1cm,超声功率为
250W)。其他步骤同直接浸出法。
1.2.5 脂肪酸甲酯制备 取小球藻油约0.1g于20mL
试管中,加入0.5mol/L的NaOH甲醇溶液2mL,60℃水
浴中加热至油珠完全溶解,冷却后加入25% BF3甲醇
溶液2mL,60℃水浴酯化20min,冷却后加入2mL正已
烷,振摇,加入2mL饱和NaCl溶液振摇,离心取上层
有机相于一只干燥试管中并加入少量无水硫酸钠以
除去微量的水,供分析使用。
1.2.6 GC-MS分析条件 色谱条件:PEG 20M色谱柱
(30m×0.32mm×0.5mm),载气为氮气(3.0mL/min),燃
烧气为氢气(47mL/min),助燃气为空气(400mL/min)。
起始柱温120℃,保持3min,以10℃/min升温到190℃,
再以2℃/min升温到220℃,保持15min。检测器温度为
260℃,汽化室温度为250℃,分流比10 ∶1,进样量
0.5μL。
质谱条件:电离方式EI,电子能量70eV,离子源
温度200℃,质谱扫描范围50~800a.m.u(质谱质量
单位)。
1.2.7 提取率测定
提取率(%)= m0
m·w1
×100
式中,m0—提取所得藻油的质量;m—小球藻粉
质量;w1—小球藻的含油率。
小球藻含油率的测定采用GB/T 5009.6-2003中
的酸水解法[10],测得小球藻含油率为35.2%。
2 结果与讨论
2.1 提取剂的选择
由图1可知,直接浸出法和超声波辅助提取法的
最佳提取剂为石油醚2(沸程60~90℃),索氏提取法
的最佳提取剂为正己烷。
2.2 提取时间对提取率的影响
提取时间是影响提取率的非常重要的因素。提
取时间过短则提取不充分,造成原料浪费;提取时间
过长则提取效率低,造成时间浪费。因此,选取合理
的提取时间,既可以保证提取率又能保证提取效率。
选用最佳提取剂进行提取,3次平行实验取平均
值后得到三种浸提方法的提取时间与提取率之间的
关系(见图2)。由图2可知,提取20min时,直接浸出、
索氏提取和超声波辅助提取的提取率分别为55.42%、
51.52%和68.41%;提取240min时,三者的提取率分别
达到了84.06%、89.11%和88.66%。直接浸出的提取
率随时间变化较平稳,200min后提取率随时间变化
不大。索氏提取的提取率随时间的变化最为明显,特
别是40min内,提取率随时间变化非常剧烈,这可能
是由于索氏提取时,样品包在滤纸筒中不能进行搅
拌,需要反复回流几次后方能被提取剂完全浸透。超
声波辅助提取的提取率先随时间快速增长,60min以
后变化不大。
若不考虑提取时间,仅从最终的提取效果来看,
索氏提取和超声波辅助提取比较接近,分别能提取
总油脂的89.11%和88.66%,高于直接浸出法的
图1 不同提取剂对提取率的影响
Fig.1 Effect of extractant on the extraction ratio
提取方法
浸出法 索氏提取法 超声波辅助提取法
90
80
70
60
50
提
取
率
(
%)
石油醚1
乙醚
石油醚2
三氯甲烷
正己烷
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84.06%。若考虑提取时间,则超声波辅助提取的提取
效率明显要高于其他两种方法。超声波辅助提取的
提取率达到80%时只需约50min,比索氏提取快1倍,
比直接浸出快3.5倍。超声波辅助提取的最佳提取时
间为60min,直接浸出和索氏提取的最佳提取时间都
是200min,后两者比前者多2.3倍。
2.3 不同提取工艺提取效果电镜图
提取前物料为干燥的藻粉。在藻泥干燥为藻粉
的过程中,藻细胞在表面张力的作用下聚集成球状,
干燥结束后就形成了细胞团。如图3所示,细胞团直
径5~50μm,大小不一。因此,对于直接浸出和索氏提
取来说,要快速而充分地提取藻细胞中的油脂,就需
要进行细胞破碎步骤,以分散细胞团中的细胞、破坏
细胞壁,使油脂能够快速进入溶剂。对于超声辅助提
取法来说,因为超声波的热学机理、空化作用和机械
机制能够分散细胞团,加速油脂进入溶剂[11],所以破
壁对提取效率的影响不大。但为了保证结果的准确
性,本研究中的三种提取方法所用的小球藻粉都进
行了细胞破碎。
由图4(a)可知,破碎后的小球藻粉的细胞团被
分散,大部分细胞也破成碎片。将破碎后的藻粉分别
用直接浸出、索氏提取和超声波辅助提取三种浸提方
法进行提取,提取后,藻体中的油脂溶解在有机溶剂
中,去除掉溶剂后,细胞碎片发生了聚集,形成了小
的细胞碎片团。由图4(b、c、d)可知,直接浸出和超声
波辅助提取后形成的细胞碎片团比索氏提取后形成
的碎片团要大,这可能是由于直接浸出和超声波辅助
提取都加入了氢氧化钾水溶液来沉淀细胞,水的引
入使细胞碎片更容易聚集在一起,而索氏提取法一
直在有机溶剂中进行,没有水的引入。尽管三种方法
得到的藻粕都有不同程度的聚集,但是这种聚集都
发生在提取过程之后,对提取率几乎没有影响。
2.4 不同提取工艺所得小球藻油组成分析
将三种浸提方法所获得的小球藻油进行GC-MS
分析,得到总离子流图(见图5),用归一化法计算各
组分的相对百分含量。经数据库检索并与标准谱图
对照,分析确认了其中12种组份。3次平行实验取平
均值后的结果列于表1。
由图5和表1可知,直接浸出、索氏提取、超声波
辅助提取所提取的小球藻油的主要脂肪酸都是亚麻
酸(C18∶3)、亚油酸(C18∶2)、棕榈酸(C16∶0),这三种
图2 提取时间对提取率的影响
Fig.2 Effect of the extraction time on the extraction ratio
提取时间(min)
0 40 80 120 160 200 240
90
80
70
60
50
提
取
率
(
%)
浸出法
索氏提取法
超声波辅助提取法
图3 预处理前藻粉的扫描电镜图像(300×)
Fig.3 The graphic of scanning electron microscope obtaining
from Chlorella vulgaris powder before pretreatment(300×)
脂肪酸种类
占总脂肪酸的比例(%)
浸出法 索氏提取法 超声波辅助提取法
C12∶0 0.67±0.03b 0.52±0.02a 0.49±0.03a
C14∶0 0.74±0.04a 0.69±0.03a 0.71±0.03a
C15∶0 0.56±0.02a 0.51±0.04a 0.54±0.04a
C16∶0 13.72±0.29a 14.71±0.17a 14.27±0.043a
C17∶0 1.25±0.33a 1.22±0.025a 1.33±0.22a
C18∶0 4.65±0.05a 4.53±0.05a 4.69±0.03a
C16∶1 7.56±0.13a 7.60±0.21a 8.02±0.18b
C18∶1 6.77±0.09b 6.11±0.13a 6.75±0.21b
C16∶2 9.64±0.18a 9.74±0.13a 9.44±0.24a
C18∶2 20.61±0.33a 20.35±0.47a 21.07±0.42a
C16∶3 10.98±0.31a 11.23±0.29a 10.79±0.14a
C18∶3 22.85±0.35a 22.79±0.42a 21.89±0.33a
表1 不同浸提方法所得小球藻油的脂肪酸的组成
Table 1 Fatty acid composition of the Chlorella vulgaris oil
from different extraction methods
注:a、b表示统计学上的显著性差异。
图4 提取前后扫描电镜效果图(300×)
Fig.4 The graphics of scanning electron microscope before and
after extraction(300×)
注:a:破碎后的小球藻粉;b:直接浸出法;c:索氏提取法;
d:超声波辅助提取法。
a b
c d
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种类
饱和脂肪酸(S) 单不饱和脂肪酸(M) 多不饱和脂肪酸(P) m(S)∶m(M)∶m(P)
小球藻油* 21.93 14.27 63.79 1∶0.65∶2.91
大豆油 20.20 43.50 36.30 1∶2.16∶1.80
菜籽油 15.90 24.00 59.10 1∶1.51∶3.72
棉仔油 24.30 27.00 44.60 1∶1.11∶1.84
花生油 18.50 40.86 38.30 1∶2.21∶2.07
玉米油 14.50 27.70 57.00 1∶1.91∶3.93
含量(%) 比例
表2 小球藻油与其他常见食用油脂肪酸组成比例
Table 2 Fatty acids composition proportion of the Chlorella vulgaris oil and other common edible oils
注:*指三种浸提方法所得结果的平均值,其他数据均来源于文献[12]。
图5 小球藻油总离子流图
Fig.5 Total ion current charts of Chlorella vulgaris oil
注:a:浸出法;b:索氏提取法;c:超声辅助提取法。
时间(min)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
相
对
丰
度
(
%) 1—16∶0
2—16∶2
3—16∶3
4—18∶1
5—18∶2
6—18∶3
1
2 3
4
5 6
a
时间(min)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
相
对
丰
度
(
%)
b
时间(min)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
相
对
丰
度
(
%)
c
脂肪酸总量占总脂肪酸的一半以上。直接浸出、索氏
提取和超声波辅助提取所得小球藻油的饱和脂肪酸
含量分别为:21.60%、22.17%、22.03%,不饱和脂肪酸
含量分别为:79.40%、77.83%、77.97%。可见,不同方法
所得的小球藻油在脂肪酸组成上没有明显的差别。
以Chlorella vulgaris C9-JN2010藻粉为原料浸提
所得的小球藻油(取三种方法所得结果的平均值)和
其他常见植物油的脂肪酸组成比例见表2。由表2可
知,小球藻油的不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸含量
的78.06%,其中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸
分别占总脂肪酸的14.27%和63.79%。
联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的膳食总
脂肪供能为30%,其中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪
酸、多不饱和脂肪酸供能分别为10%,即3者比例为
1∶1∶1。中国营养学会的《中国居民膳食营养素参考
摄人量DRIs》推荐值也与此相同。由表2可见,以
Chlorella vulgaris C9-JN2010藻粉为原料浸提所得的
小球藻油的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱
和脂肪酸比例为1∶0.65∶2.91,多不饱和脂肪酸比例明
显高于前两者。因此,小球藻油可考虑作为补充多不
饱和脂肪酸的营养功能油脂进行开发利用。
3 结论
3.1 直接浸出、索氏提取和超声波辅助提取的最佳
提取剂分别为石油醚2(沸程60~90℃)、正己烷、石油
醚2(沸程60~90℃);最佳提取时间分别为200、200、
60min;提取率可分别达到84.06%、89.11%、88.66%。
三种方法所得的小球藻油在脂肪酸组成上相差不
大,但各方法的提取效率相差明显。超声波辅助提取
法是三种方法中提取效率最高的方法,综合考察提
取率和提取效率,该方法最具有工业应用前景。
3.2 以Chlorella vulgaris C9-JN2010藻粉为原料浸
提获得的小球藻油不饱和脂肪酸含量占总脂肪酸的
78.06%,其中多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的63.79%,
亚麻酸和亚油酸含量较高,可以作为营养功能油脂
进行开发。
参考文献
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物加工过程中感官质量的改变将对食品的总体品质
特性产生影响[24]。通过表2可以看出,在相同加热功
率条件下,除490W加热40s外,随着微波加热时间的
延长,牛肉串多汁性、嫩度和滋味呈下降趋势。多汁
性的最大值出现在700W 40s处。嫩度的最大值出现
在350W加热30s和40s处。滋味的最大值出现在350W
加热40s和490W加热60s。色泽的数值变化呈现波动
性,这可能与a*值的变化相关。色泽的最大值出现在
700W加热60s。在120s处350W与490W的总体可接受
性有显著差异(p<0.05)。总体可接受性的最大值出
现在490W 40s和350W 120s。除120s外,在相同微波
加热时间下的不同微波加热功率的总体可接受性差
异不显著(p>0.05)。
3 结论
本实验选用牛肉串作为载体,研究了不同微波
加热时间和功率对预油炸牛肉串食用品质的变化情
况。结果表明,在最优微波处理条件下(700W加热
40s、490W加热40s和490W加热60s)肉串的出品率较
高,剪切力适中,色泽更优、油炸滋味浓郁,总体可接
受性增强。对于其他风味肉制品的研究与开发,会有
越来越多的肉制品加入到微波方便食品中。随着生
产技术的改进、品种的增加、质量的提高,未来微波
方便食品的市场将会不断扩大。
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