全 文 ：羊奶果的共生固氮及氮素的运转形式
黄志宏 1 , 黄维南1 , 吕柳新 2
( 1. 福建省亚热带植物研究所 , 福建　厦门　 361006;
2. 福建农林大学园艺学院 , 福建　福州　 350002)
收稿日期: 2001- 10- 16初稿 ; 2001- 12- 08修改稿
作者简介: 黄志宏 ( 1969- ) , 男 , 硕士 , 助理研究员 , 主要从事共生固氮研究。
基金项目: 福建省科技厅资助项目 ( 94- J- 9)。
摘　要: 对羊奶果根瘤的固氮、 吸氢、 防氧保护及固氮产物的运转进行研究。羊奶果是热带植物 , 离体根瘤固氮
活性在 25～ 30℃时最高 , 且在离体 3 h以内无显著变化 ; 35～ 40℃的高温对根瘤吸氢活性有促进作用 , 离体根瘤
的吸氢活性可保持 6 h以上 ; 低温对固氮活性有明显的抑制作用。 羊奶果为酰脲型植物 , 根、 根瘤和木质部中都
含有大量的尿囊酸 ,酰脲含量均占氮化合物总量的 50%以上 , 说明它的根瘤和根都能将氮素转化成酰脲并经过木
质部向上转运 , 还有部分氮素通过以丝氨酸、 蛋氨酸为主的氨基酸形式运输。根瘤中未检测到血红蛋白 , 但有较
高含量的 SOD、 AS A和 GSH。
关键词: 羊奶果 ; 根瘤 ; 固氮 ; 酰脲 ; 防氧保护
中图分类号: Q 945. 13; S 154. 3 文献标识码: A
Nitrogen fixation and transport form of organic N compounds inElaeagnus conferta
HU ANG Zhi-hong, HU ANG Wei-nan, L U Liu-Xing
( 1. Fujian Institute of Subtropical Botany , Xiamen, Fujian , 361006, China;
2. College of Horticulture , Fujian Agriculture and Forestry Univercity , Fuz hou , Fujian , 350002, China )
Abstract: Elaeagnus conf erta is a tropica l actino rhizal plant, C2 H2-reduction and H2-uptake by excised ro o t nodules
w as m ea sur ed to determine the nitr og enase and hydro genase activities at v a rious tempera tures, nodules show ed
maximum nit rog enase activity a t 25- 30℃ and no significant change w as found within 3 hours. High tempera ture
( 35- 40℃ ) enhanced the H2 uptake by excised nodules, the hydro genase activ ity kept in high lev el fo r a t least 6
hour s. E . conf erta belong to ur eide-producing plant, a la rg e quantity o f allantoic acid w as found in the ex t racts of
nodules, ro o ts and xylem of E . conferta g r ow n without com bined nitr og en. It wa s suggested that uride could be
synthesized in th e nodules and transpo rted to the shoo t o f th e plant. A little amino acids w ere found in th e trans-
po r ted o rg anic N compounds, such as Met, Ser. Hemog lobin was not found in nodules, instead, SOD activity and
concentra tions of ASA and GSH were high.
Key words: E . conferta; Nodules; Nitro g en fixa tion; U reide; Oxygen pro tec tion
　　羊奶果 , 又名密花胡颓子 ( Elaeagnus conf erta
Roxb) ,是一种常绿攀援灌木 ,分布于越南、马来西
亚、 印度等地的热带雨林和我国的云南、 海南、 广
西南部 , 果可鲜食或加工 , 叶可入药 , 是一种有开
发前景的新型淡季水果和观果植物 [1 ]。 本文研究羊
奶果与弗兰克氏菌共生固氮体系中的若干生理生化
问题 , 即: 温度对根瘤固氮和吸氢的影响、 根瘤的
防氧保护、 固氮产物及其输出形式等 , 进一步了解
有关非豆科树种与弗兰克氏菌共生固氮的机理。
1　材料与方法
羊奶果系 1987年从广西引进 ,露地种植 ,并有
部分 1年生小苗用珍珠岩盆栽 ,浇灌 Hoag land无氮
营养液 [2 ]。 离体根瘤的固氮活性测定采用乙炔还原
法 [3 ]: 将装有根瘤的反应瓶置于不同温度的恒温箱
中 , 隔一定时间测定乙烯生成量 ; 离体根瘤的吸氢
活性测定采用气相层析法 [ 4] ; SOD (超氧化物歧化
酶 ) 活性的测定参照朱广廉等方法 [5 ] ; CAT (过氧
福建农业学报 17( 1): 53～ 56, 2002
Fujian Journal of Agricultural Sciences
文章编号: 1008- 0384 ( 2002) 01- 0053- 04
化氢酶 ) 活性和 ASA (抗坏血酸 )含量按高俊凤等
的方法测定 [6 ] ; POD (过氧化物酶 )活性按张志良方
法测定 [7 ] ; GSH (谷胱甘肽 ) 含量测定参照 Ellman
方法 [8 ] ; 可溶性蛋白质含量测定采用 Low ry方
法 [9 ] ; 豆血红蛋白提取和测定采用氰化正铁血红蛋
白法 [10 ] ; 游离氨基酸的测定参照邹铧等的方法 [11 ] ;
酰脲的测定参照尤瑞琛的方法 [ 12]。
2　结果与分析
2. 1　温度对离体根瘤固氮活性的影响
由图 1、图 2可见 ,在本试验中 ,温度为 30℃时 ,
离体根瘤乙烯生成量最高 ,且在反应的前 3 h内固
氮活性都保持在最高水平 ;其次为 25℃ ,在 15℃时
离体根瘤乙烯生成量最少 ,固氮活性受到明显抑制 ;
离体根瘤的固氮活性同时受到离体时间和反应温度
的制约 ,在一定的温度范围内 ,温度越高 ,固氮酶活
性也较高 ,且初期乙烯生成量也较多 ,但持续的高温
会引起酶的失活 ,从而导致酶活性急剧下降。35℃处
理的离体根瘤固氮活性随时间的延长下降最快 , 3 h
后仅生成少量乙烯。 25～ 30℃是根瘤固氮活性表达
的最佳温度 ,低温对固氮酶有较显著的抑制作用。固
氮活性的测定应在离体反应 2～ 3 h内进行。
图 1　羊奶果离体根瘤在不同反应温度下乙烯的生成量
　 Fig. 1　 Ef fect of temperature on C2H4 production
in detached nodules of E . conferta
2. 2　温度对离体根瘤吸氢活性的影响
对羊奶果离体根瘤进行不同温度处理 , 并在数
小时内连续跟踪测定其吸氢活性。结果表明 , 羊奶
果根瘤有很强的吸氢活性 , 较高的温度对离体根瘤
的吸氢活性表达有促进作用 , 40℃时根瘤吸氢活性
可高达 0. 512 0μmol· min- 1 (图 3)。吸氢活性的测
定受底物浓度的影响较大 , 本试验中根瘤吸氢活性
随反应时间增加下降很快 , 主要原因是由于密闭反
应体系中 H2量减少而非酶的失活 , 在 H2消耗到一
定程度时 , 重新注入 H2 , 根瘤吸氢活性随底物浓度
的升高而迅速恢复 (图 4)。试验证明 , 根瘤离体后
6 h内 , 各温度处理的根瘤吸氢活性均可保持在较
高水平上 , 这与吸氢酶本身热稳定性较好有关。
图 2　羊奶果离体根瘤在不同反应温度下的固氮活性
　 Fig. 2　 Ef fect of temperature on nitrogenase activity
in detached nodules of E . conferta
2. 3　根瘤的活性氧清除系统
实验表明 (表 1) , 羊奶果体内存在着由 SOD、
POD、 CA T组成的清除活性氧的酶系统 ,其中根和
根瘤的 SOD活性较高 ,而一般情况下同种植物叶片
SOD活性高于地下部分的根或块根、块茎 ;此外 ,羊
奶果叶、根和根瘤中的 ASA、 GSH含量也较高 , 说
明存在 GSH和 ASA酶促偶联反应清除 H2O2的机
制 ; 根和根瘤匀浆中氰化正铁血红蛋白的光吸收值
( A540 )都很低 , 分别为 0. 020 3和 0. 019 1, 存在血
红蛋白的可能性很小。
表 1　羊奶果叶 、根、根瘤的 SOD、 C AT、 POD活性
和 ASA、 GSH含量
Table 1　 SOD, CAT, POD activities and ASA,GSH contents
in various organs of E . conferta
项　　目 叶 根 根瘤
可溶性蛋白 ( mg· g- 1 ) 153. 25 27. 07 15. 43
SOD( U· mg- 1min- 1 0. 93 2. 40 2. 02
CA T(μg· mg- 1· min- 1 ) 56. 08 64. 36 39. 92
POD( 0. 01△ A470mg- 1· min- 1 ) 70. 50 222. 94 14. 77
ASA( mg· hg- 1 ) 33. 44 6. 62 24. 26
GSH(μg· mg- 1) 392. 31 22. 79 32. 10
54 福建农业学报 第 17卷
2. 4　根瘤和根中有机氮化物的组分及运转形式
在 Hog land无氮营养液中生长的羊奶果的根
瘤、 根、 木质部中都含有大量的尿囊酸 , 酰脲含量
均占氮化合物总量的 50%以上 , 高于氨基酸含量
(表 2) , 说明它们的根瘤和根都能将氮素转化成酰
脲 , 并经过木质部向上转运。根、 根瘤、 木质部中
可检测到的游离氨基酸种类约 10种 (表 3) ,天门冬
氨酸、 谷氨酸普遍存在 , 根瘤和木质部中丝氨酸和
甲硫氨酸含量较高 , 说明根瘤固定的氮素还以氨基
酸的形式上行运转。 施化合态氮的羊奶果根瘤中有
机氮化物总量较高 ,其中氨基酸总量有明显增加 ,特
别是天门冬氨酸和丝氨酸 , 同时还检测到少量尿囊
素。
图 3　羊奶果离体根瘤在不同反应温度下的吸氢活性
Fig. 3　 Ef fect of temperature on hydrogenase activity in detached nodules of E . conferta
图 4　密闭反应体系中 H2浓度变化趋势
Fig. 4　 Changes of H2 concentration in the stoppered serum bottles containing nodules
注: 图 3、 图 4空心点处表示重新注氢。
　表 2　无氮液培养的植物不同部位中有机氮化物的组成
与含量
　 Table 2　 Composition and content of organic N in the
extracts of plants grown without combined nitrogen　
有机氮化物 根瘤
( mg· g- 1 )
根
( mg· g- 1 )
木质部
( mg· g- 1)
根瘤*
(mg· g- 1 )
尿囊酸 3. 65 1. 13 1. 51 2. 73
尿囊素 0 0 0 0. 40
酰脲总量 3. 65 1. 13 1. 51 3. 13
氨基酸总量 1. 82 1. 01 0. 70 3. 32
有机氮化物总量 5. 47 2. 14 2. 21 6. 45
酰脲含量 (% ) 66. 73 52. 80 68. 33 48. 53
氨基酸含量 (% ) 33. 27 47. 20 31. 67 51. 47
　　注: * 有施化合态氮的羊奶果植株测定值。
3　讨　论
关于豆科植物的研究表明 , 根瘤的形成、 发育
和固氮受到温度的影响 , 并和宿主植物的地理起源
密切相关。温带豆科植物根瘤最佳固氮温度为 20～
24℃ , 热带、 亚热带豆科植物根瘤的最佳固氮温度
为 25～ 30℃。在放线菌结瘤植物中 , 原产于高原亚
寒带的沙棘根瘤在 20℃时根瘤的固氮活性最高 , 超
过 30℃即丧失固氮活性 [13 ] ; 羊奶果原产于热带雨
林 , 在 30℃时 , 根瘤的固氮活性最高。可见 , 在放
线菌结瘤植物中 , 温度对根瘤固氮的影响也同宿主
的生态特性相关。 N2在根瘤中还原成 NH4+后 , 主
要以有机态的形式向上运输 , 豆科植物有酰脲型和
酰胺型两种 ,热带、亚热带豆科植物大多为酰脲型 ,
向地上部输送的氮化物主要是酰脲 , 包括尿囊酸和
尿囊素 , 酰胺型则以天冬酰胺和谷氨酰胺为主 , 包
括许多温带豆科植物。羊奶果根瘤固定的氮素主要
以酰脲形式运往地上部 , 同杨梅、 沙棘、 桤木一
55第 1期 黄志宏等: 羊奶果的共生固氮及氮素的运转形式
样 [11 ] , 是酰脲型植物 , 但向上运转的特定氨基酸有
所不同 , 丝氨酸、 蛋氨酸含量较高。
表 3　无氮液培养的植物不同部位中游离氨基酸的
组成与含量
Table 3　Content of f ree amino acids in organs of plants
grown without combined nitrogen
氨基酸 根瘤
( mg g- 1 )
根
( mg g- 1)
木质部
( mg g- 1)
根瘤*
( mg g- 1 )
天门冬氨酸 ( Asp) 0. 1132 0. 4610 0. 0734 1. 0633
谷氨酸 ( Glu) 0. 0818 0. 0195 0. 0774 0. 0625
丝氨酸 ( Ser) 0. 1769 0. 0299 0. 1441 1. 3236
甘氨酸 ( Gly) 0 0. 1401 0. 2027 0
苏氨酸 ( Th r) 0. 1370 0 0 0. 2128
精氨酸 ( Arg) 0 0. 1601 0 0. 1937
蛋氨酸 ( Met) 0. 0588 0. 167 0. 1200 0
异亮氨酸 ( Il e) 0. 1706 0. 0859 0 0. 2459
亮氨酸 ( Leu ) 0. 0137 0 0 0
苯丙氨酸 ( Ph e) 0. 6550 0 0. 0812 0. 2227
组氨酸 ( His) 0. 4124 0 0 0
总量 1. 8194 1. 0132 0. 6988 3. 3245
　　注: * 有施化合态氮的羊奶果植株测定值。
在根瘤固氮体系中 , 氧可使固氮酶不可逆地失
活 , 豆科植物根瘤中的豆血红蛋白通过调节氧的浓
度起到供氧和保护固氮酶的作用 , 羊奶果的根瘤中
几乎没有血红蛋白。超氧阴离子自由基理论认为超
氧阴离子自由基是氧毒性的主要原因。 Puppo曾提
出 SOD可能参与了对氧害的防护的假说 [ 14] , 大豆、
豌豆、 蚕豆及桤木的根瘤中发现有较高含量的抗坏
血酸过氧化物酶、 脱氧抗坏血酸还原酶和谷胱苷肽
还原酶 [15 ] ; 在羊奶果根瘤中 , SO D、 ASA、 GSH含
量较高 ,可能起到清除活性氧、保护固氮酶的作用。
此外 , 羊奶果根瘤有很强的吸氢活性 , 可通过羟化
反应消耗大量的氧。
福建东南沿海丘陵地区森林植被长期以来遭到
破坏 , 水土流失严重 , 羊奶果是少数几种分布在热
带地区的放线菌结瘤植物之一 , 在较高的温度下根
瘤仍保持很强的固氮活性 , 又具有一定的经济价值
和观赏价值 ,可以在地表温度较高的荒地荒坡种植 ,
是一种值得推广的保持水土、恢复植被的先锋植物。
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56 福建农业学报 第 17卷