全 文 ：[文章编号 ] 　1000-4718(2008)10-2033-04
　[收稿日期 ] 2007-07-02　　　[修回日期 ] 2007-12-13
＊[基金项目 ]国家自然科学基金资助项目(No.30670845);河北省自然科学基金资助项目(No.C2007000831)
■通讯作者 Tel:0311-86265563;E-mail:hanmei@hebmu.edu.cn
大花旋覆花内酯通过抑制 NF-κB活化
抗血管炎症反应＊
张　佳 , 　尉　坤 , 　刘月平 , 　温进坤 , 　张嫡群 , 　韩　梅■
(河北医科大学基础医学研究所生物化学与分子生物学研究室 ,
神经与血管生物学省部共建教育部重点实验室 ,河北 石家庄 050017)
　　[摘　要 ] 　目的:以离体培养的血管环为研究对象 ,探讨大花旋覆花内酯(1-O-acetylbritannilactone, ABL)
抑制脂多糖(LPS)诱导的血管炎症反应效应和分子机制。方法:将体外培养的血管环预先用 ABL孵育后 , 再用
LPS刺激 ,提取组织总蛋白进行 Westernbloting分析。结果:ABL抑制 LPS诱导的 IKK磷酸化活化和由此引发的
IκBα的磷酸化降解 , 降低 NF-κB水平 , 进而抑制 NF-κB依赖的炎症因子 iNOS、COX-2、ICAM-1和 VCAM-1
的表达。结论:ABL是一种调节 NF-κB活性的制剂 ,具有抑制致炎因子表达 , 上调抑炎因子水平 , 维持两者平衡
的作用 , 可消除 LPS诱导的血管炎症反应。
[关键词 ] 　旋覆花内酯;炎症;主动脉;NF-κB
　　[中图分类号 ] 　R363　　　　　[文献标识码 ] 　A
1 -O-acetylbritannilactoneinhibitsvascularinflammatoryresponse
throughsuppressingNF-κBactivation
ZHANGJia, YUKun, LIUYue-ping, WENJin-kun, ZHANGDi-qun, HANMei
(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology, InstituteofBasicMedicalSciences, HebeiMedicalUniversity, KeyLa-
boratoryofNeurobiologyandVascularBiology, MinistryofEducation, Shijiazhuang050017, China.E-mail:hanmei@
hebmu.edu.cn)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:Toinvestigatetheefectsandmolecularmechanismof1-O-acetylbritannilatone(ABL)
onLPS-inducedinflammatoryresponsesinaortainvitro.METHODS:TheaortaloopspretreatedwithABLwerestimula-
tedwithLPSfordifferenttimes.Theproteinextractsfromtheaortawereusedtodetecttheexpressionofinflammatoryfac-
torsbyWesternbloting.RESULTS:ABLinhibitedtheactivationofNF-κBandtheexpressionofinflammatoryfactors
iNOS, COX-2, ICAM-1 andVCAM-1, andincreasedthelevelofanti-inflammatoryfactorIκBαviablockingthe
phosphorylationactivationofIKKandthedegradationofIκBαinducedbyLPS.CONCLUSION:ABLabolishesthevas-
cularinflammatoryresponsetoLPSstimulationthroughmodulatingNF-κBactivity.
　　[ KEYWORDS] 　Acetylbritannilactone;Inflammation;Aorta;NF-kappaB
　　血管炎症反应是动脉粥样硬化 、经皮腔内冠状
动脉成形术后血管再狭窄等心血管疾病发生发展的
主要病理机制 [ 1] 。在血管炎性病变中 ,约有上百种
基因表达出现异常 ,进而引起血管平滑肌细胞表型
与功能的改变。基因调控区序列同源性比对分析发
现 ,在炎性因子诱导下表达异常的基因大多受核因
子 -κB(nuclearfactor-κB, NF-κB)的反式激
活 [ 2] 。大花旋覆花内酯 (1 -O-acetylbritannilac-
tone, ABL)是用有机溶剂法从传统中草药欧亚旋覆
花中分离得到的一种有效单体成分。前期研究表
明:ABL对脂多糖(LPS)诱导的单核 /巨噬细胞活化
具有明显的抑制作用 [ 3, 4] ,提示 ABL可能是一种抗
炎制剂 。在此基础上 ,本实验通过建立主动脉离体
培养模型 ,体外观察 ABL对 LPS诱导的血管炎症因
子表达的影响 ,初步探讨其抗血管炎性反应的效应
及作用机制 ,为药物治疗血管炎性疾病奠定基础。
·2033·中国病理生理杂志　ChineseJournalofPathophysiology　2008, 24(10):2033-2036
材　料　和　方　法
1　材料
ABL由我校药学院分离及鉴定 ,其化学结构参
见文献 [ 5] ;雄性 SD大鼠 (体重 300-350 g)由河北
省实验动物中心提供;DMEM培养基购自 Promega
公司;LPS购自 Sigma公司;本实验所用抗体均购自
SantaCruz公司;ECL发光试剂购自 Pierce公司;其
它试剂均为进口或国产分析纯 。
2　方法
2.1　离体血管环体外培养与分组　参照文献 [ 6]方
法加以改良 。实验动物常规麻醉消毒 ,于无菌条件
下 ,迅速分离大鼠胸腹主动脉 ,去除血管周围的结缔
组织 ,剪成 2-3 mm左右的动脉环 。将动脉环放在
24孔培养板中 ,加入含 10%胎牛血清 DMEM培养
基至刚好浸没动脉环 。将培养板置入 37 ℃孵箱 ,通
入混合气体(含有 95% O2和 5% CO2),每隔 6 h换
1次培养基。
将血管环分为 3组:对照组 , 不加任何处理因
素;LPS组 ,用不同浓度 LPS(5、10、20 mg/L)处理不
同时间;ABL+LPS组 ,血管环用 20 μmol/LABL预
孵育 2 h后 ,再加入 20mg/LLPS处理。
2.2　蛋白提取液的制备及定量　将不同因素处理后
的血管环 ,按每 100mg组织加入 1mLRIPA裂解液进
行匀浆。 4℃ 8 000r/min离心 10min,取上清 (即蛋
白提取液 )加入 PMSF调至终浓度为 1%。蛋白提取液
用改良的酚试剂法定量蛋白浓度 ,于 -20℃保存。
2.3　Westernbloting分析　按文献[ 7]方法进行 ,各
组取等量蛋白样品 ,经 12%十二烷基硫酸钠 -聚丙烯
酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后 ,电转移至 PVDF膜
上;封闭后的膜依次与适当稀释的Ⅰ抗和 Ⅱ抗进行结
合反应。用化学发光法检测膜上的抗原抗体结合区
带。采用 Kodak公司 ID数码成像分析软件对显色区
带的信号强度进行相对定量分析。实验重复 3次。
3　统计学处理
采用 SPSS10.0软件分析 ,数据以均数 ±标准差
( x±s)表示 。多样本均数两两比较采用单因素方差
分析 (One-wayANOVA)。
结　　果
1　ABL抑制 LPS诱导的血管环 NF-κB的表达
分别给予不同浓度的 LPS(5、10、20 mg/L)刺激
血管 6 h, NF-κBp65蛋白的表达随着 LPS刺激浓
度的增加而呈升高趋势 。与对照组相比 , 分别增加
4.6、11.8和 15.7倍(图 1)。分别用 5、10、20 μmol/L
ABL预孵育血管环 2 h后 ,加入 LPS(20 mg/L)刺激
6 h。随着 ABL浓度的增加 , NF-κBp65蛋白的表
达呈逐渐下降趋势 ,与未用 ABL预孵育的血管相
比 ,分别降低 10.2%、56.0%和 74.3%,见图 2。
Fig1　EfectofLPSonNF-κBp65 expressioninvesseltissues
invitro. x±s.n=5.＊P<0.05vs0mg/LLPSgroup.
图 1　不同浓度 LPS对血管 NF-κBp65表达的影响
Fig2　EffectofABLonLPS-inducedNF-κBp65 expression
invesseltissuesinvitro. x±s.n=5.＊P<0.05 vs0
μmol/LABLgroup.
图 2　不同浓度 ABL对 LPS诱导的血管 NF-κBp65表达
的影响
·2034·
2　ABL抑制 LPS诱导的血管环中 iNOS、COX-2、
ICAM-1和 VCAM-1的表达和抑炎因子 IκBα降
解
Westernbloting分析结果显示 , 给予 LPS(20
mg/L,下同)刺激 12 h, iNOS和 COX-2蛋白的表
达与对照组相比均明显增加 ,分别为对照组的 2.73
倍和 4.69倍 。而用 ABL预孵育 2h后 ,再加入 LPS
处理 12 h, iNOS和 COX-2蛋白的表达受到明显的
抑制 , 与单独 LPS组相比 , 分别降低 41.5% 和
33.2%,见图 3。ABL对 LPS诱导的黏附分子 ICAM
-1和 VCAM-1的表达具有同样的抑制作用 ,如图
3所示 , LPS可诱导血管环 ICAM-1和 VCAM-1蛋
白的表达 ,分别为对照组的 2.21倍和 2.77倍 。用
ABL预孵育后 ,再加入 LPS处理 ,则 LPS诱导的两种
黏附分子表达明显被抑制 ,分别较 LPS组降低 40%
和 57%。
Fig3　 EffectofABLonLPS-inducediNOS, COX-2,
ICAM-1, VCAM-1 andIκBαexpressioninvessel
tissuesinvitro. x±s.n=5.＊P<0.05 vscontrol;
#P<0.05 vsLPS.
图 3　ABL对 LPS诱导的血管 iNOS、COX-2、ICAM-1、
VCAM-1和 IκBα表达的影响
3　ABL抑制 LPS诱导的 IKK活化和 IκBα磷酸化
降解
Westernbloting分析结果显示 ,用 LPS刺激血管
1 h后 , LPS组 p-IKK水平是对照组的 1.49倍。用
ABL预孵育后 ,再加 LPS处理 1h,则 p-IKK水平明
显降低 ,比 LPS组降低了 41.7%(图 4)。给予 LPS
刺激血管 1 h, LPS组 p-IκBα水平与对照组相比明
显增加 ,为对照组的 1.61倍 。ABL预孵育组的 p-
IκBα的含量明显低于 LPS组 ,下调了 30.2%(图
4)。IκBα蛋白含量随着 p-IκBα水平的升高而降
低 ,两者呈相反趋势变化(图 4)。
Fig4　EfectofABLonp-IKKandp-IκBαlevelinvessel
tissuesafterLPSinductionfor1 hinvitro. x±s.n=5.
＊P<0.05 vscontrol;#P<0.05vsLPS.
图 4　ABL抑制 LPS诱导的 IKK活化和 IκBα的磷酸化降
解
讨　　论
NF-κB是参与炎症反应的一类重要转录因
子 [ 8, 9] ,在炎症反应中起重要的枢纽作用 ,受其调控
的基因达 160多种 , 包括致炎因子 (iNOS, COX-
2)、黏附分子(ICAM-1, VCAM-1)和抑炎因子(IL
-10, IκB)等 ,这些因子的表达异常介导了动脉粥样
硬化和血管再狭窄的发生发展 。我们从抗炎中药欧
亚旋覆花中分离得到一种有效单体成分 ABL,体外
观察其对 LPS诱导的血管炎症反应的影响。结果表
·2035·
明 , ABL(0 -20 μmol/L)能够剂量依赖性地抑制
LPS诱导的 NF-κBp65的表达 ,这与本室前期以单
核 /巨噬细胞和血管内皮细胞为实验对象所获得的
研究结果相印证 [ 3, 4] ,提示 ABL是一种多靶点的抗
炎制剂 。进而 ,体外观察了 ABL对 LPS诱导的血管
iNOS、COX-2等炎症因子表达的影响 。结果显示 ,
LPS刺激后 , iNOS、COX-2及黏附分子 ICAM-1和
VCAM-1的表达被显著上调;而经 ABL预处理后 ,
LPS诱导的 iNOS、COX-2、ICAM-1和 VCAM-1蛋
白表达受到明显抑制 。
NF-κB活化是炎性因子基因表达的关键步骤 ,
该过程有赖于其上游 IKK的磷酸化活化和 IκBα磷
酸化降解 [ 10] 。正常情况下 , NF-κB与抑制蛋白 IκB
结合并定位于胞浆。多种刺激因素 ,如 LPS、TNF-α
等作用于血管后 ,通过信号转导而激活 IKK,活化的
IKK进一步使底物 IκB磷酸化 ,继之泛素化降解 。
释放出的 NF-κB转位入核 ,与下游基因的启动子
区 NF-κB识别序列结合 ,激活下游基因的表达 ,从
而引发或加剧炎症反应。为进一步探讨 ABL抑制
NF-κB表达和降低上述炎症因子水平之间的关系 ,
本实验观察了 ABL对 NF-κB活化的上游环节
IκBα、p-IκBα和 p-IKK水平的影响 。结果显示 ,
ABL能够抑制 LPS诱导的 IKK磷酸化活化和 IκBα
的磷酸化降解 。由此可见 , ABL的抗炎作用与阻断
炎性信号转导 、抑制 NF-κB活化以及炎症因子表
达有关 。ABL通过影响 NF-κBp65的活化 ,进而抑
制其下游 iNOS、COX-2、ICAM-1和 VCAM-1等
多种炎症相关基因的表达;此外 , ABL通过上调
IκBα水平提高其稳定性 ,来强化组织自身的抗炎能
力 ,进而发挥其抑制血管炎性反应的作用。 ABL的
这种作用不同于 NF-κB抑制剂 。
ABL是在多层次上调节 NF-κB活性的一种抗
炎制剂 , 通过抑制炎症因子表达 , 维持组织内致
炎 /抗炎力量的平衡 , 防止炎症的进一步扩散 。因
此 , ABL是一种具有良好应用前景的抗血管慢性炎
症性疾病的有效单体 。
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