全 文 ：94:3290-3295.
[ 10] 　Streck E L , Vieira P S , Wannmacher C M D , et al.
I n v itro effects of homocy steine on some parameters of
oxidative stress in rat hippocampus[ J] .Metabolic Brain
Disease , 2003 , 18(2):147-154.
THE IMPAIRMENT OF HOMOCYSTEINE ON NEURONS
AND THE RELATED MECHANISMS
HOU Yue , HOHG Yan , CHEN Wei-qiang , LI Shu-tian , WANG Dong-lan , CHENG Yi-yong
(Inst itu tion of Health and Environmental Medicine , Academy of M ilitary Medical Sciences , Tianjin 300050 , China)
ABSTRACT
Aim:To observ e the impairment of homocy steine(Hcy)on neurons in vitro and the related mechanismes.Methods:We exam-
ined the consequences of treatment of cultured rat cor tical and hippocampal neurons with Hcy and detected the neurons apoptosis ,
calcium influx , DNA damage and ox idative injury.Results:Primary cortical and hippocampal neurons were treated w ith Hcy(250
μmol/ L)fo r 4 h resulted in apoptosis time-dependently.S-adenosy l me thionine(SAM)could significantly , but MK-801 , an NM DA
receptor inhibito r , couldn t repress the Hcy induced neuron apoptosis.Hcy could induce neuron calcium overload through activating
the NMDA recepto rs.The DNA of neurons w as damaged by Hcy because the methy lation reactions were inhibited.Hcy trea tment al-
so induced MDA level significantly increased , but did not affect the neurons T-AOC.Conclusion:These findings indicate that Hcy
compromises neuronal homeostasis by multiple , divergent routes , including DNA damage , neuron exito tox icity , and oxidative injury.
Hcy mediated neuron apoptosis w as mainly due to DNA damage.
KEY WORDS:homocysteine;neurons;apoptosis;DNA damage
青藤碱对吗啡依赖与戒断小鼠脑组织 nNOS活性的影响＊
刘　珍1 , 郑济芳2■ , 胡　弼1■ , 刘运莲2 , 周军媚2
(1.南华大学生理学教研室, 2.南华大学遗传学教研室 , 湖南衡阳 421001)
摘要　目的:观察青藤碱对吗啡依赖与戒断小鼠中枢神经系统中大脑皮层 、小脑 、脑干的 nNOS活性变化的影响。方法:剂量递
增法建立小鼠吗啡依赖模型 ,青藤碱治疗前后用纳洛酮催瘾 ,观察戒断症状;化学比色法测各脑组织匀浆的 nNOS活性。结果:青
藤碱可扭转成瘾小鼠的体重下降趋势 ,减轻戒断症状;使由吗啡依赖与戒断引起异常变化的 nNOS 活性水平恢复到最终接近对照
组水平。结论:青藤碱能显著减轻吗啡依赖小鼠的戒断征状 ,其机制可能与青藤碱影响各脑组织 nNOS 活性相关。
关键词:　青藤碱;　吗啡;　戒断;　一氧化氮合酶
KEY WORDS:　sinomenine;　morphine;　w ithdraw al;　nit ric oxide synthase
中图分类号:Q426 文献标识码:A 文章编号:1000-6834(2007)03-0297-03
　　NO(Nitric o xide)在吗啡依赖和戒断中起非常重要的作
用 , nNOS(nervous nitric oxide synthase)是 NO在神经系统中
生成的关键酶 ,催化 L-精氨酸和 O2 生成 L-胍氨酸和 NO[ 1] 。
Leza等发现小鼠小脑 nNOS 活性的升高参与介导了吗啡耐
受与戒断[ 2] 。 nNOS 的反义寡核苷酸探针选择性下调 nNOS
活性后 ,能阻断小鼠发生吗啡镇痛耐受 , nNOS 基因敲除的小
鼠不能产生吗啡耐受[ 3] 。 吗啡戒断时 , 小鼠蓝斑核中的
nNOS 阳性细胞数量增多[ 4] , nNOS 的特异性抑制剂可以剂
量依赖性地减轻小鼠吗啡戒断症状。因此 , nNOS 可能和吗
啡诱导的依赖与戒断有关。
青藤碱(sinomenine , Sin)是青风藤的主要化学成分 ,化学
结构类似于吗啡 ,是目前所知的植物中最强的组胺释放剂之
一 ,有显著的镇痛 、镇静 、抗炎 、抑制免疫及降血压等功效。
研究表明 ,青藤碱能减轻吗啡依赖大鼠的戒断症状 , 并降低
戒断后骤增的单胺类神经递质含量 , 预先使用青藤碱可降低
吗啡耐受小鼠的神经系统中 cAMP水平[ 4] 。另外 , 青藤碱自
身没有奖赏或厌恶效应 ,能明显抑制条件性位置偏爱(condi-
tio ned place preference , CPP)的形成 , 对已形成的位置偏爱亦
有拮抗作用[ 4] 。然而 , 青藤碱作用于吗啡依赖小鼠时 , 对中
枢神经系统中 nNOS 活性是否有影响尚未见报道。 本实验
旨在将青藤碱用于治疗小鼠吗啡依赖与戒断 , 检测其对小鼠
各脑组织的 nNOS 活性的影响 , 探讨青藤碱在小鼠吗啡依赖
与戒断中的作用机制。
297中国应用生理学杂志 , 2007;23(3)
1　材料与方法
1.1　实验动物与材料
昆明种雄性小鼠 48 只 , 体重(25±2)g , 由南华大学实验
动物中心提供。盐酸青藤碱 湖南正清制药厂出品 , 批号
0409104;盐酸吗啡(morphine)注射液 沈阳第一制药厂出
品 ,批号 050207;纳洛酮(naloxone , Nal)北京四环制药厂出
品 ,批号 0407151;NOS 活性测定试剂盒 ,南京建成生物工程
研究所生产。 752 型紫外分光光度计为北京市六一仪器厂产
品。
1.2　小鼠吗啡依赖模型的建立
48 只小鼠随机分为 6 组(n =8):(1)Control组;(2)Mor-
phine组;(3)Morphine+nal 组;(4)Morphine+Sin 组;(5)
Morphine+Sin.+Nal 组;(6)Self-w ithdraw al 组。参照文献
[ 2] 建立小鼠吗啡依赖模型 , 2 ～ 6 组皮下注射 Morphine 量
为:第 1 d 20 mg/ kg ,每日递增 20 mg/ kg ,至第 5 d 量达 100
mg/kg;对照组每天注射等体积 Saline。一天两次 , 时间分别
是 8∶00 和 20∶00 ,每天早 8∶00测量小鼠体重 。
1.3　建模后的处理
第 5 d最后一次注射吗啡2 h 后 ,对 Morphine+Nal组腹
腔注射(ip)Nal(4 mg/kg)催瘾 ,参照文献[ 5] 进行戒断症状评
分 , 30 min 后与 Morphine组一起断头处死 , 剥离大脑皮层 、
小脑 、脑干 , -80℃冷冻待测;第 6 d 早 8∶00 开始分别对
Morphine+Sin 组和 Morphine+Sin+Nal组 ip 配置好的 Sin
注射液(40 mg/kg), Self-withdraw al组停用 Morphine ,与 Con-
trol组一起 ,每天注射 Saline , 时间及容积与前 5 d 一致。 第
10 d晚最后一次注射后 2 h , 对 Morphine+Sin+Nal组 ip Nal
(4 mg/ kg)催瘾 , 观察戒断症状 , 30 min后将此四组小鼠断头
处死 ,剥离各脑组织 , -80℃冷冻待测。
1.4　脑组织匀浆的制备
将冷冻的脑组织分别置于 Saline中漂洗 , 滤纸拭干后称
重 ,转移至玻璃匀浆器 , 加 9倍脑组织重的匀浆液匀浆 , 3 500
r/min 离心 8 min ,取 400 μl上清液待测。
1.5　总蛋白含量与 nNOS 活性的测定
考马斯亮蓝法测大脑皮层 、小脑 、脑干总蛋白含量 ,硝酸
还原酶法测 nNOS 活性 , 实验操作按试剂盒说明进行。
1.6　数据处理
各组数据用均数±标准差( x ±s)表示 , 应用 SPSS12.0
统计软件以 t 检验比较两组间体重变化差异 ,单因素方差分
析比较各组间 nNOS 活性差异。
2　结果
2.1　小鼠吗啡依赖模型的建立
对建模期间 Morphine组与Control组的体重变化值进行
分析 ,结果表明 , Control组小鼠体重呈正增长趋势 , Morphine
组体重却一直下降。自第 2 d起 ,Morphine组与 Control组体
重变化就出现显著性差异(P <0.05), 至第 3 d ,两组小鼠间
体重变化已呈极显著差异(P<0.01), 该趋势持续到其后的
第 4 d 和第 5 d(图 1)。
Fig.1　A comparison of the relative body-weight in mice during
the model construction( x±s)
＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs control group
　　小鼠在第 5 d 最后一次注射吗啡后 , 用 Nmal 对 Mor-
phine+Nal组进行急性戒断 , 结果显示 ,Morphine+Nal组小
鼠较 Control组出现了明显的理毛 、喷嚏 、眼睑下垂 、咬牙等
戒断征状(表 1), 表明已成功建立了小鼠吗啡依赖模型。
2.2　Sin对吗啡依赖小鼠体重减轻的扭转
第 6 d 与第 7 d , Mmorphine+Sin 组与 Self-w ithdrawal组
都处于负增长状态 , 较 Contro l组有极显著差异(P <0.01);
从第 8 d 起 ,Morphine+Sin 组小鼠体重转为正向增长 , 推测 ,
此时 Sin 可能已发生药物效应 , 扭转了吗啡依赖和戒断引起
的体重下降;而 Self-withdraw al组的体重仍在下降 , 虽然下降
趋势有所缓和 ,但与 Control组比差异仍然显著(P <0.05)。
直到治疗的最后 1 d , Self-withdrawal组小鼠体重才有所增长,
但增长幅度仍显著低于 Morphine+Sin组(P<0.05 ,图 2)。
青藤碱治疗后 ,Mor+Sin+Nal组的戒断症状与 Control
组比没有显著差异 ,表明青藤碱能有效脱毒。 而在后 5 d 使
用Saline的 Self-w ithdraw al组小鼠 Nal戒断后 , 小鼠在理毛
和眼睑下垂两项中与 Control组比较仍有显著性差异(表 1)。
Fig.2　A comparison of the relative body weight in mice with
Sin- treated( x±s)
＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs control group;#P<0.05 , ##P<
0.01 vs morphine+Sin group
2.3　各脑组织 nNOS活性分析
nNOS 活性检测结果分析表明 , 吗啡依赖小鼠 nNOS 活
性仅在大脑中较 control组有明显下降(P<0.05), 小脑和脑
干中也有下降 , 但与 Control组比较差异不显著。耐受再戒
断后 , nNOS 活性升高均在各脑组织 nNOS 活性升高均在各
脑组织较 Control组出现显著性差(P<0.01 , 图 3)。
298 Chin J Appl physiol 2007;23(3)　
Tab.1　Symptoms analysis of acute withdrawal after mo rphine and sinomenine trea tment in mice( x±s , n =8)
Behaviors Control Mor+Nal Mor+Sin+Nal Self-withdrawal
G rooming 3.0±0.8 12.2±1.9＊＊ 6.4±1.7 11.6±3.0＊＊
Sneezing 1.6±1.1 8.0±5.5＊ 5.0±3.7 6.0±3.8
Ptosis 2.3±1.3 15.0±0.0＊＊ 2.8±3.6 5.6±2.4＊
Teeth chatting 1.7±0.9 4.2±2.3＊ 2.8±2.3 3.2±2.4
Total score 14.2±6.2 47.2±14.7 23.2±15.3 28.4±14.8
　　Mor:Morphine;Sin=Sinomenine;Nal:Naloxone
＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 v s contro l group
Fig.3 　nNOS activity in cerebra , cerebella and brain-stem of
mice( x ±s)
＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs control g roup;#P<0.05 , ##P<
0.01 vs morphine g roup;■P<0.05 , ■■P<0.01 v s mor-
phine+Nal g roup
　　Sin的治疗使由依赖而引起降低的 nNOS 活性在各脑组
织中恢复到几乎接近 Control组水平。对 Sin 治疗后的小鼠
进行 Nal急性戒断发现 , 小脑中的 nNOS 活性较治疗前的
Morphine+Nal组有显著性差异(P <0.05),但大脑和脑干中
nNOS 活性却未出现显著性差异。产生这一现象的原因可能
是吗啡依赖小鼠中枢神经系统中小脑的 nNOS 活性与 Nal
急性戒断最为相关。上述结果也表明 , Sin 能有效调节吗啡
依赖与戒断时各脑组织的 nNOS 活性的变化。
Self-withdrawal组大脑和小脑中的 nNOS 活性与 Control
组有显著差异(P <0.05), 这一结果排除了延长时间对
nNOS 活性的影响。
3　讨论
吗啡耐受和戒断症状的产生是由中枢和外周神经系统
中一些相关神经元共同作用而实现的[ 1] 。哺乳动物中枢神
经系统中存在着 NMDA 受体-NO-cGMP 通路 , 直接或间接
地影响该途径的关键酶可能阻断该途径信号的传递[ 1 , 2] 。
NO 是介导吗啡依赖和戒断的重要神经递质 , nNOS 是 NO 在
神经系统中生成的关键酶。国内外研究表明 , nNOS 活性的
变化是吗啡依赖与戒断症状产生的重要生化机制 , 抑制
nNOS 活性的升高可减轻吗啡戒断症状[ 2 , 3] 。本研究表明 ,
青藤碱可有效缓和小鼠各脑组织中 nNOS 活性由依赖引起
的下降和由戒断引起的异常升高 , 使其接近对照组水平 。由
此推测 ,青藤碱减轻吗啡依赖与戒断症状可能是通过改变中
枢神经系统各脑组织 nNOS 活性而实现的 。
目前 ,有学者认为 , Sin的药理作用机制可能与抑制钙离
子转运有关。但是 , Sin 是否通过拮抗钙离子通道 , 从而抑制
NMDA 受体-NO-cGMP 途径中信号的传导来影响 nNOS 活
性 ,需要进一步研究。
4　参考文献
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　＊基金项目:南华大学博士启动基金资助(5-03-XJQ-03-044);湖
南省自然科学基金资助项目(04JJ30046)。
收稿日期:2005-10-14;修回日期:2006-12-08
作者简介:刘　珍(1981-), 女 , 湖南耒阳人 , 硕士在读 , 从事神
经生理学研究。■通讯作者 , E-mail:zjfgene@eyou.com;hubi-
gene@yahoo.com.cn
299中国应用生理学杂志 , 2007;23(3)