全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１４（０５）：９８～１０３
第一作者简介：韦善君（１９７５－），女，博士，讲师，研究方向为植物生
理与分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉ．ｓ．ｊ＠１６３．ｃｏｍ．
责任作者：周宜君（１９６４－），女，博士，教授，研究方向为分子遗传
学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｅｅｎｚｈｏｕ＠２６３．ｎｅｔ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１１００５０７）；中央民族大学
青年科学基金资助项目（０９１０ＫＹＱＮ５１）；中央高校基本科研业务
费专项资金资助项目；中央民族大学大学生创新训练资助项目
（ＵＲＴＰ２０１４１１）。
收稿日期：２０１３－１１－１３
新疆雪莲叶片高效再生植株体系的建立
韦 善 君，武 运 芳，杨 　 林，罗 云 燕，可 　 祥，周 宜 君
（中央民族大学 生命与环境科学学院，北京１０００８１）
　　摘　要：以新疆雪莲快繁无菌苗为试材，研究了新疆雪莲高效植株再生的条件。结果表明：
长势健壮的无菌苗叶片切段可以通过２种途径高效再生不定芽；直接器官再生途径：长３～５ｍｍ
的叶切段在ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ的培养基上先后暗诱导３周和光诱导４周，分
化率达（７３．３±３．８）％，平均出芽量（５．０±０．３）个芽／块；间接器官再生途径：叶切段在ＭＳ＋ＮＡＡ
０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ　０．５ｍｇ／Ｌ培养基上暗诱导３周，愈伤组织诱导率１００％，愈伤组织在 ＭＳ＋
ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ的培养基上光诱导４周，分化率达（８８．９±５．９）％，平均
（５．５±０．４）个芽／块；不定芽在ＭＳ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ培养基中壮苗和增殖培养
后，在ＭＳ＋ＩＢＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋０．１％活性碳的培养基中生根率达１００％；２种植株再生途径均可用
于新疆雪莲的诱变育种和转基因育种研究。
关键词：新疆雪莲；快繁无菌苗；植株再生；激素；诱导
中图分类号：Ｓ　５６７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１４）０５－００９８－０６
　　新疆雪莲属菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）凤毛菊属（Ｓａｕｓｓｕｒｅａ）
多年生一次结实的高山草本植物［１］，又称天山雪莲，我
国的新疆、青海、甘肃等省３　０００ｍ左右的高原寒带山区
有分布，主产于新疆境内的天山山脉、阿勒泰山脉和昆仑
山脉雪线附近，多生长于高山冰碛石、流石滩石隙及高山
草甸上［２］，是高山植被的重要组成成分。其生境常年积雪
不化，气候严寒，土壤贫瘠，条件十分恶劣。种子在０℃发
芽，３～５℃生长，幼苗能经受－２１℃的严寒；全年生长期不
到２个月。自然条件下生长５～８ａ后开花［３］。
新疆雪莲为稀有资源，特殊的生长环境使其具有独
特而神奇的药理作用。在西藏、新疆、青海、甘肃、云南、
四川等地，雪莲入药的习用已久，主要用于祛寒、除风
湿，治疗关节炎、妇科疾病，增强免疫、抗癌等。化学分
析表明，雪莲含有黄酮类、生物碱类、香豆素类、三萜类、
多糖类、挥发油类以及鞘胺醇等化学成分［４－７］。现代药
理学研究表明，新疆雪莲具有抗炎镇痛、抗癌、扩张血
管、降血压、清除自由基、抗疲劳、终止妊娠和收缩子宫
等作用［７－１１］。除了药用价值之外，在雪地中盛开的雪莲
还有吉祥的寓意。由于特殊的药用价值和寓意，不当采
集严重破坏了自然生长的雪莲资源，现已被列为国家二
级保护植物［１２］。
组织培养与离体再生植株是弥补自然资源稀缺的
理想途径。通过组织培养产生不定芽或胚状体可以实
现雪莲种质的快速繁殖，有助于发展雪莲的人工种植，
还为进一步的诱变或转基因育种奠定基础；通过细胞培
养方法获得有效次生代谢产物，具有周期短、不受季节
和气候等自然条件限制等的优点。目前，关于雪莲组织
培养与植株再生研究已有相关报道［１３－１７］，多数采用种子
萌发的幼苗子叶、真叶、下胚轴和根作为外植体，但由于
雪莲种子不易采收，发芽率低，因而外植体不易获
得［１８－１９］。此外，关于雪莲的研究文献中所报道的培养条
件、愈伤组织状态、再生率等差异很大。为进一步提高
雪莲组织培养的效率，该试验以增殖培养的无菌叶片和
茎为外植体，从激素组合、培养时间、光照条件三方面进
行研究，以期建立新疆雪莲稳定高效的植株再生体系，
为其快速繁殖和转基因研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试新疆雪莲种子由新疆药用植物研究所贾晓光
研究员提供。参考傅晓春等［１７］和武利勤等［１８］的方法萌
发种子和增殖培养无菌苗。试验用基本培养基为 ＭＳ，
添加蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂７．０ｇ／Ｌ，ｐＨ　５．８～５．９。培养基
的灭菌条件为１２１℃、２０ｍｉｎ。
８９
北方园艺２０１４（０５）：９８～１０３ ·生物技术·
１．２　试验方法
１．２．１　不同外植体诱导愈伤组织　取增殖培养４～５周
的无菌苗叶片和茎作为外植体。分成植株底部１～３叶
和４叶以上２类，切成长度为３～５ｍｍ的片段，茎段长
度２～３ｍｍ。根据雷亮等［１９］的配方，试验选用的培养基
为ＭＳ＋ＮＡＡ　２．０ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．５ｍｇ／Ｌ。将３种外植
体分别接种于培养基上，每培养皿接种１５个片段，每
处理３皿。于（２３±２）℃条件下暗培养，６周后记录愈
伤组织的发生率和生长状况。愈伤组织诱导率（％）＝
产生愈伤组织的外植体块数／总接种的外植体块数×
１００％；分化率（％）＝分化的组织块数／总接种的组织块
数×１００％。
１．２．２　不同激素诱导愈伤组织　为比较不同植物生长
调节剂组合诱导愈伤组织的效果，该试验设计了以４叶
以上叶片为外植体，在１０种培养基上进行诱导（表１）。
表１ 不同诱导愈伤组织激素组合
编号 培养基／ｍｇ·Ｌ－１
１ ＭＳ＋ＮＡＡ　２．０＋６－ＢＡ　０．１
２ ＭＳ＋ＮＡＡ　２．０＋６－ＢＡ　０．５
３ ＭＳ＋ＮＡＡ　２．０＋６－ＢＡ　１．０
４ ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５＋６－ＢＡ　１．０
５ ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５＋６－ＢＡ　１．５
６ ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５＋６－ＢＡ　２．０
７ ＭＳ＋ＮＡＡ　１．０＋ＴＤＺ　０．５
８ ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５＋ＴＤＺ　１．０
９ ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２＋ＴＤＺ　０．５
１０ ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２＋ＴＤＺ　０．２５
１．２．３　愈伤组织细胞压片观察　取长势旺盛的愈伤组
织，用刀片切取表面单层细胞薄片，置于载玻片上，加１
滴蒸馏水后制成临时压片。在Ｌｅｉｃａ显微镜下观察愈伤
组织的细胞形态特征。
１．２．４　不定芽诱导　直接诱导不定芽：以植株中上部生
长健壮的叶片作为直接诱导不定芽的外植体，每培养皿
接种１２～１５块，每处理３皿，诱导方法见表４。光照强
度４０μｍｏｌ·ｍ
－２·ｓ－１，光周期１４ｈ／ｄ，温度（２５±１）℃。
有暗期培养的材料光诱导４周，无暗期培养的材料直接
光诱导６周。记录各处理不定芽发生率及生长状况。
间接诱导不定芽：采用诱导的愈伤组织，材料分别为
１．２．１中诱导６周产生的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型组织以及在 ＭＳ＋
ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ　０．５ｍｇ／Ｌ培养基中诱导３周产
生的愈伤组织，分化用培养基为ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋
６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ，诱导条件同上。
１．２．５　生根诱导及移栽　将诱导产生的不定芽转至
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ的培养基上，培
养３～４周，将苗丛拆成单株，接种到生根培养基上诱导
生根，每瓶３株，每处理接种５瓶，培养条件同１．２．４。４
周后统计生根率，测量根长。取生根良好的植株清洗干
净，移栽到营养土∶珍珠岩∶蛭石为２∶１∶１的培养基
质中，温室培养２周后统计存活率。
１．３　数据分析
试验数据采用ＳＰＳＳ　１７．０的单因素方差分析法
（ＡＮＯＶＡ）进行处理分析，比较不同处理间的差异。
２　结果与分析
２．１　不同外植体产生愈伤组织效果比效
由表２可知，在该培养基上诱导的愈伤组织色泽偏
暗，淡黄色，内部较硬实。相同条件下，植株底部１～３叶
愈伤组织发生率较低，叶柄的效果较叶片好；４叶以上的
叶片、叶柄切段愈伤组织诱导率近１００％；茎段愈伤组织
诱导率为１００％，并有２～３株丛生的腋芽长出。说明年
龄适中的叶片和茎段具有很好的愈伤组织发生能力。
因叶片数量多且材料易得，相同的诱导效果下，更适宜
用作外植体。
表２ 不同外植体产生愈伤组织效果比较
外植体类型 诱导率／％
底部１～３叶
叶片 ３７．８±４．４ｃ
叶柄 ５３．３±３．８ｂ
４叶以上
叶片 １００．０±０ａ
叶柄 ９７．８±２．２ａ
茎段 １００．０±０ａ
　　注：同栏数字后不同字母表示处理间在０．０５水平差异显著，下同。
２．２　不同激素组合诱导愈伤组织效果的比较
２．２．１　愈伤组织发生时间及发生率比较　由表３可知，
在添加ＮＡＡ与６－ＢＡ的诱导培养基上，叶片切段培养
１０～１２ｄ后在切口处开始膨大，２周后愈伤组织可见，
３～４周后为愈伤组织发生高峰期。在添加 ＮＡＡ与
ＴＤＺ的培养基中，外植体活动时间相对较早，培养６～
７ｄ后切口处膨大，１０ｄ后可见愈伤组织，２周左右为愈伤
组织发生高峰期。在１０种培养基中，叶片切段容易被诱
导产生愈伤组织，在生长调节剂浓度相对较低的４、５号处
理中，诱导率低于８０％，其它处理中诱导率接近１００％。
２．２．２　愈伤组织的结构特点比较　根据颜色、硬度和表
面湿润程度，将获得的愈伤组织分为４种类型：Ⅰ型为表
面水渍状、硬而密实的组织；Ⅱ型为表面干燥、白色颗粒
状组织（图１－Ａ１）；Ⅲ型介于Ⅰ型和Ⅱ型之间，为略湿润的颗
粒状，白色至淡黄色（图１－Ｂ１）；Ⅳ型是完全水渍状、较松
软的组织。观察Ⅱ、Ⅲ型愈伤组织的细胞形态可以发现，
Ⅱ型中细胞多为圆形，细胞质相对较浓（图１－Ａ２）；Ⅲ型的
细胞多为腊肠形，有的为２～３个细胞连在一起呈弯月
状，细胞质较淡（图１－Ｂ２）。不同类型培养基诱导的愈伤
组织差异较大，当ＮＡＡ浓度为２．０ｍｇ／Ｌ时（１～３号），
愈伤组织以Ⅰ型为主，６－ＢＡ浓度越低时，外层组织越薄且
水渍状，偏灰色；随着６－ＢＡ浓度的升高，外层松软组织
增多，水渍状减少，转淡黄色和白色，出现Ⅲ型和少量Ⅱ型
组织。在６－ＢＡ／ＮＡＡ比值较高的培养基中（４～６号），
愈伤组织以Ⅱ型和Ⅲ型为主，其中６－ＢＡ浓度为２．０ｍｇ／Ｌ
９９
·生物技术· 北方园艺２０１４（０５）：９８～１０３
　　　　表３　不同生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响
编号 诱导率／％ 愈伤组织状态
１　 ９７．８±２．２ａ 组织块较小，内部硬实，表层湿软，灰白色
２　 １００．０±０ａ 组织块较小，较硬，湿润，灰白色
３　 １００．０±０ａ 组织块较大，较硬，湿润，灰白至淡黄色，约１／４有小芽
４　 ６６．７±７．７ｃ 组织块较小，颗粒状，淡黄色或灰白色，约１／５有小芽
５　 ７７．１±２．１ｂ 组织块较小，颗粒状，淡黄色至白色，约１／２有小芽
６　 ９５．６±４．４ａ 组织块较大，颗粒状，淡黄色至白色，１／２有小芽
７　 ９５．７±２．２ａ
组织块很大，水渍颗粒状，较硬，淡黄色至白色，１／２～２／３
有小芽
８　 １００．０±０ａ
组织块很大，略水渍的颗粒状，淡黄色至白色，约２／３有
小芽
９　 １００．０±０ａ 组织块较大，颗粒状，白色，表面较干，约２／３有小芽
１０　 ９４．４±２．９ａ 组织块较小，颗粒状，白色，表面干，约１／２有小芽
时诱导率和生长量均明显增加，但Ⅱ型没有明显增加。
当以ＴＤＺ取代６－ＡＢ与ＮＡＡ组合时（７～１０号），愈伤组
织中Ⅱ型的比例明显增加，其中以ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ
０．５ｍｇ／Ｌ组合效果最好。ＴＤＺ浓度为１．０ｍｇ／Ｌ时愈
伤组织块最大，但水渍程度较重，浓度为０．２５ｍｇ／Ｌ时
组织块较小；ＮＡＡ浓度为０．５ｍｇ／Ｌ及以上时，组织块
硬度和水渍程度加重。
２．３　不定芽诱导
２．３．１　外植体直接分化不定芽诱导　由表４可知，在附
加ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ的培养基上，叶片
切口先膨大，可直接发生不定芽。外植体若全光照培
养，不定芽发生率为（２４．５±２．２）％，平均出芽量（２．５±
０．３）个／块，有少量芽玻璃化（约５％）；若先经适当的暗
培养再转光照培养，不定芽发生率和出芽量均显著提
高，其中以暗培养３周效果最好，分化率和出芽量分别
为（７３．３±３．８）％和（５．０±０．３）个／块（图１－Ｃ），但约１０％
的芽玻璃化；暗诱导４周以上时，分化率降低，玻璃化程
度加重。在附加ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ　０．５ｍｇ／Ｌ的培
养基上，以适当暗诱导再进行光培养的芽分化效果好，
外植体膨大的切口处产生颗粒状突起，发育为不定芽。
暗诱导２、３、４周的处理中芽分化率皆为８０％左右，差异
不显著（Ｐ＞０．０５），但显著高于全光照处理的分化率
（２６．７±３．８）％；暗诱导３周和４周的出芽量最高（８～
９个／块）；暗诱导２周的芽玻璃化较轻。总体上，在该培
养基上分化的芽多数纤细而扭曲，玻璃化较重，暗处理
时间长时甚至不能长出芽，呈绿色点状。综合考虑分化
率、出芽量和芽健壮程度，外植体在 ＭＳ＋ＮＡＡ
０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ培养基中暗诱导３周、再光
诱导４周，直接发生不定芽效果最好。
　　表４ 生长调节剂及光照条件对外植体直接分化不定芽的影响
培养基／ｍｇ·Ｌ－１ 诱导方法 分化率／％ 出芽量／个·块－１ 芽的形态 玻璃化率％
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５＋６－ＢＡ　２．０
暗６周＋光４周 ２４．５±２．２ｄ ３．３±０．３ｃｄ 略弯曲 ７０
暗４周＋光４周 ４２．２±５．９ｃ ３．６±０．４ｃｄ 伸展 ２５
暗３周＋光４周 ７３．３±３．８ａｂ　 ５．０±０．３ｂｃ 伸展 １０
暗２周＋光４周 ６２．２±４．５ｂ ４．２±０．４ｂｃｄ 伸展 ５
光６周 ２４．５±２．２ｄ ２．５±０．３ｄ 伸展 ５
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２＋ＴＤＺ　０．５
暗４周＋光４周 ８２．２±２．２ａ ８．９±１．０ａ 卷曲为点状 ７５
暗３周＋光４周 ７５．６±．０ａｂ　 ８．０±１．１ａ 点状或扭曲 ５０
暗２周＋光４周 ８４．４±５．９ａ ５．７±０．８ｂ 点状或扭曲 ２５
光６周 ２６．７±３．８ｄ ３．２±０．５ｃｄ 短粗或扭曲 ２５
２．３．２　愈伤组织间接分化不定芽诱导　由表５可知，Ⅱ
型分化率达９３．３％，平均出芽量（７．２±０．４）个／块，芽多
单生，略弯曲，约２０％玻璃化。Ⅲ型和Ⅰ型分化率较低，玻
璃化程度较高。外植体在 ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ
０．５ｍｇ／Ｌ培养基中暗诱导３周产生的愈伤组织，以Ⅱ型
为主，少量为Ⅲ型。该类组织的再生率可达８８．９％，与Ⅱ
型组织的分化率无显著差异；出芽量（５．５±０．４）个／块低
于Ⅱ型组织，但是玻璃化程度明显减轻，芽的伸展性较
好，更健壮（图１－Ｄ）。
表５　不同类型愈伤组织分化不定芽效果
愈伤组织类型 分化率／％ 出芽量／个·块－１ 芽的形态 玻璃化率／％
Ⅰ ６．７±３．８ｃ １．４±０．２ｄ 弯卷 １００
Ⅱ ９３．３±３．８ａ ７．２±０．４ａ 略弯曲 ２０
Ⅲ ５１．１±５．９ｂ ２．６±０．３ｃ 略弯曲 ７０
暗诱导３周 ８８．９±５．９ａ ５．５±０．４ｂ 伸展 １０
２．４　不定芽的增殖培养、生根诱导及再生植株移栽
分化产生的不定芽，转到 ＭＳ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ＋
６－ＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ的培养基中培养３～４周后，芽生长健
壮，茎基部发出１～３株的新芽，形成密集的不定芽丛
（图１－Ｅ）。将不定芽转接到表６所示的培养基中诱导
不定根。结果表明，当培养基中无生长调节剂时，没有
根形成；当含有适量浓度的ＮＡＡ或ＩＢＡ时，２周后茎
基部发出不定根。从生根率、生根量和根长来看，以ＩＢＡ
０．５ｍｇ／Ｌ处理的效果最好（表６，图１－Ｆ）。若在该培养
基中添加０．１％的活性碳时，根更细且白色。生根良好
的植株移栽成活率１００％，生长健壮（图１－Ｇ）。
表６ 生长调节剂对不定芽生根的影响
培养基 生根率／％ 生根量／条 根长／ｃｍ
ＭＳ　 ０．０　 ０．０ｅ ０．０ｃ
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．０５　 １００．０　 ６．８±０．５ｃｄ　 ３．３±０．５ａ
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１　 １００．０　 ８．５±０．６ｃ ２．８±０．７ａ
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５　 １００．０　 １９．８±０．８ａ ＜０．２ｂ
ＭＳ＋ＩＢＡ　０．１　 ４５．０±４．３　 ６．６±０．４ｄ ３．２±０．８ａ
ＭＳ＋ＩＢＡ　０．５　 １００．０　 １１．２±０．５ｂ ３．３±０．７ａ
ＭＳ＋ＩＢＡ　０．５＋０．１％活性碳 １００．０　 １０．９±０．７ｂ ３．４±０．９ａ
００１
北方园艺２０１４（０５）：９８～１０３ ·生物技术·
图１　新疆雪莲的愈伤组织和再生植株
注：Ａ１．Ⅱ型愈伤组织；Ａ２．Ⅱ型愈伤组织的细胞（４０×）；Ｂ１．Ⅲ型愈伤组织；Ｂ２．Ⅲ型愈伤组织的细胞（４０×）；Ｃ．外植体在 ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ
２．０ｍｇ／Ｌ培养基中诱导产生的不定芽；Ｄ．在ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ　０．５ｍｇ／Ｌ培养基中暗诱导３周产生的愈伤组织，在ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ
２．０ｍｇ／Ｌ的培养基中分化的不定芽；Ｅ．不定芽在ＭＳ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ培养基中壮苗培养；Ｆ．生根植株；Ｇ．移栽后的再生植株。
３　讨论与结论
瓦·古巴诺娃等［１３］１９９０年首次报道了新疆雪莲的
组织培养研究，以幼嫩小头状花序作为外植体获得了再
生植株，后来诸多的研究中皆以种子萌发幼苗的各部分
组织为外植体。自然条件下新疆雪莲生长５～８ａ后开
花［３］，人工栽培植株２～３ａ后开花。种子有冠毛，易随
风飘走，需在种子完熟前用透气的布袋将花朵包裹住花
序，可采收９０％的种子。种子萌芽率通常为５０％～
７０％［１８－２１］，随着贮存年限的延长萌芽率显著下降。上述
因素限制了种子萌发幼苗的获得。雪莲的幼芽在适宜
的培养基上可以增殖产生大量无菌苗［１７］。该研究以增
殖培养４～５周无菌苗的中上部叶为外植体，在含适合
生长调节剂的培养基中，直接分化不定芽率可达（７３．３±
３．８）％，通过愈伤组织再生不定芽比率可达（８８．９±
５．９）％。无菌苗切去叶片后余下的基部，在增殖培养基
中可以长出新的叶子供再次使用。说明无菌苗的叶是
一种有效、易得的外植体，可以替代种子萌发的幼苗。
无菌苗１～３叶的愈伤组织发生率低，可能与叶龄相对
较大有关。在已有的一些报道中，叶片愈伤组织诱导率
高低不一［２２－２３］，除了植物生长调节剂的配方差异外，在
一定程度上可能与选用的叶片幼嫩程度不同有关。
生长素和细胞分裂素类物质的种类和浓度对外植
体或愈伤组织再生植株有重要影响。该试验用于愈伤
组织诱导或继代培养的１０种培养基配方中，当ＮＡＡ浓
度为１．０ｍｇ／Ｌ以上时，愈伤组织多为硬实、表面湿润的
组织，该类组织生长慢，分化能力很低。林侃等［１４］也曾
报道２，４－Ｄ浓度高时诱导的愈伤组织硬实，说明生长素
类物质浓度高时可使新疆雪莲愈伤组织硬化。当培养
基中附加浓度为０．５ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ及以上浓度时，促进白
色颗粒状、表面干燥愈伤组织的产生，该类组织再生植
株能力强。当培养基中含有６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．５ｍｇ／Ｌ时，外植体先经３周的暗培养后转光培养，可
直接产生不定芽。ＴＤＺ是人工合成的苯基脲衍生物
（Ｎ－苯基－Ｎ′－１，２，３－噻二唑－５－脲），已被广泛用于植物组
织培养中［２４］，在新疆雪莲组织培养中的研究很少有报
道。该试验结果表明，ＴＤＺ在新疆雪莲的愈伤组织的
培养中有很好的效果，浓度为０．５ｍｇ／Ｌ的 ＴＤＺ与
ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ配合使用时，愈伤组织发生较ＮＡＡ和
６－ＢＡ组合早５ｄ左右，Ⅱ型的比例较高。但是，使用ＴＤＺ
替代６－ＢＡ时，无论是诱导外植体直接分化不定芽，还是
通过愈伤组织分化不定芽，均有一定程度的扭曲甚至不
能长出，说明ＴＤＺ可以促进雪莲不定芽的发生，但对芽
的发育有抑制作用。先用含有ＴＤＺ的培养基诱导愈伤
组织３周左右，再用含有６－ＢＡ的培养基诱导愈伤组织
分化，可明降低ＴＺＤ的抑制作用，获得伸展良好的不定
芽。Ｈｕｅｔｔｅｍａｎ等［２５］和Ｌｕ［２６］曾总结，ＴＤＺ在植物特别
是木本植物的不定芽诱导中非常有效，但在诱导芽变成
完整植株存在一些问题，例如分化不出完整芽且叶片卷
曲，不利于伸长生长，玻璃化较重，生根困难等。因此
ＴＤＺ应用于新疆雪莲组织培养时应注意控制浓度或作
用时间，抑制玻璃苗等畸化现象的发生。
１０１
·生物技术· 北方园艺２０１４（０５）：９８～１０３
适当的暗诱导结合光照培养促进新不定芽的分化。
由于光促进分化，抑制脱分化，所以在植物组织培养
中，通常是在无光的条件下进行愈伤组织的诱导和继
代培养，在光照条件下诱导芽分化。师校欣等［２７］研究
表明，２～３周的暗培养能够显著提高葡萄离体叶片不定
芽的再生率和出芽数。该研究也发现，新疆雪莲离体叶
片经过２～３周的暗培养后，直接分化或通过愈伤组织
分化不定芽效率明显提高，更长时间的暗培养愈伤组织
生长较好，但分化率明显下降，再生苗易玻璃化。
综合该研究结果，可以得出新疆雪莲２种高效的植
株再生途径。直接器官再生途径：无菌苗叶段在 ＭＳ＋
ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ的培养基上暗诱导
３周，转光诱导４周，即可获得较多丛生芽；间接器官再
生途径：无菌苗叶切段在 ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ
０．５ｍｇ／Ｌ培养基上暗诱导３周产生愈伤组织，转到
ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ培养基上光诱导
４周，可获得大量不定芽。不定芽在 ＭＳ＋ＮＡＡ
０．０５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ培养基中增殖和壮苗培养
３～４周后，转到ＭＳ＋ＩＢＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋０．１％活性碳培养
基中诱导生根，即可获得再生植株。
参考文献
［１］　谭敦炎，朱建雯，姚芳，等．雪莲的生殖生态学研究Ⅰ．生境、植物学及
物候学特性［Ｊ］．新疆农业大学学报，１９９８，２１（１）：１－５．
［２］　安争夕，沈观冕，翟大彤，等．新疆植物志［Ｍ］．５卷．乌鲁木齐：新疆
科技卫生出版社，１９９９．
［３］　卓娅，刘杰龙，古巴诺娃，等．天山雪莲生态适应特性及人工繁殖的
研究［Ｊ］．新疆师范大学学报（自然科学版），１９９３，１３（３）：８１－８４．
［４］　杨峻山，谢凤指，刘庆华，等．新疆雪莲的香豆素类化学成分的研究
［Ｊ］．中国药学杂志，２００６，４１（２３）：１７７４－１７７６．
［５］　李燕，郭顺星，王春兰．新疆雪莲黄酮类化学成分的研究［Ｊ］．中国药
学杂志，２００７，４２（８）：１９－２１．
［６］　侯朋艺，黄健，孙博航，等．新疆雪莲化学成分的分离与鉴定［Ｊ］．沈阳
药科大学学报，２０１１，２８（２）：１２０－１２３．
［７］　肖皖，李宁，波拉提·马卡比力，等．雪莲化学成分和药理活性研究
进展［Ｊ］．现代药物与临床，２０１１，２６（５）：３４４．
［８］　李君山，蔡少青．雪莲花类药材的化学和药理研究进展［Ｊ］．中国药
学杂志，１９９８，３３（８）：４９９－４５２．
［９］　杨伟鹏，周钟鸣，熊玉兰，等．野生雪莲和培养雪莲总黄酮主要药效
作用比较研究［Ｊ］．中国中医药信息杂志，２００６，１３（１）：３２－３６．
［１０］翟科峰，段红，荆建国，等．天山雪莲提取物纯化前后各部位抗炎镇
痛作用［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１０，３０（５）：３７４－３７７．
［１１］王一凡，柳茵，刘维军，等．雪莲对动脉粥样硬化大鼠血脂和Ｃ反应
蛋白的影响［Ｊ］．中国药理学通报，２０１１，２７（６）：８８４－８８５．
［１２］国家环境保护局，中国科学院植物研究所．中国珍稀濒危保护植物
名录［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８７．
［１３］瓦·古巴诺娃，刘杰龙，石玉瑚．新疆雪莲的组织培养［Ｊ］．新疆农业
科学，１９９０（５）：２２１－２２２．
［１４］林侃，王晓军，赵民安．新疆天山雪莲体胚诱导与分化研究［Ｊ］．西北
植物学报，２００６，２６（７）：１３５１－１３５４．
［１５］杨林，覃筱燕．新疆雪莲的组织培养及植株再生［Ｊ］．中央民族大学学
报（自然科学版），２００６，１５（１）：２６－２９．
［１６］Ｇｕｏ　Ｂ，Ｇａｏ　Ｍ，Ｌｉｕ　Ｃ　Ｚ．Ｉｎｖｉｔｒｏ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
ｐｌａｎｔ　Ｓａｕｓｓｕｒｅａ　ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ　Ｋａｒ．ｅｔ　Ｋｉｒ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐｏｒｔ，２００７，２６：
２６１－２６５．　
［１７］傅晓春，王晓军，赵民安，等．新疆雪莲体外直接器官发生的快繁研
究［Ｊ］．干旱区研究，２００８，２５（２）：２４８－２５３．
［１８］武利勤，郭顺星，肖培根．新疆雪莲胚芽的组织培养和植株再生［Ｊ］．
中国中药杂志，２００５，３０（１１）：８１４－８１６．
［１９］雷亮，赵兵，徐春明，等．光温条件对新疆雪莲愈伤组织反应器培养
后再分化能力的影响［Ｊ］．过程工程学报，２００６，６（６）：９４２－９４７．
［２０］康喜亮，王晓军，牛力涛，等．濒危药用植物天山雪莲种子萌发特性
研究［Ｊ］．种子，２０１０，２９（５）：８１－８５．
［２１］朱军，李晓瑾，王月娥，等．天山雪莲种子萌发特性研究［Ｊ］．种子，
２０１０，２９（６）：６７－７０．
［２２］覃建兵，庞红霞，祝长青．植物激素对新疆雪莲愈伤组织诱导和分化
的影响［Ｊ］．华中师范大学学报（自然科学学版），２００９，４３（４）：６３３－６３７．
［２３］覃建兵，庞红霞，曹兴芹．新疆雪莲愈伤组织诱导及总黄酮的测定
［Ｊ］．西北植物学报，２０１０，３０（６）：１２６４－１２７０．
［２４］徐晓峰，黄学林．ＴＤＺ：一种有效的植物生长调节剂［Ｊ］．植物学通报，
２００３，２０（２）：２２７－２３７．
［２５］Ｈｕｅｔｔｅｍａｎ　Ｃ　Ａ，Ｐｒｅｅｃｅ　Ｊ　Ｅ．ＴＤＺ：ａｐｏｔｅｎｔ　ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ　ｆｏｒ　ｗｏｏｄｙ　ｐｌａｎｔ
ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９３，３３：１０５－１０９．
［２６］Ｌｕ　Ｃ　Ｙ．Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ＴＤＺ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｕｌａｒ　ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，２９：９２－９６．
［２７］师校欣，杜国强，贺柱，等．外植体及培养条件对葡萄不定芽再生的
影响［Ｊ］．果树学报，２００８，２５（４）：５８５－５８８．
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　Ｌｅａｆ　ｏｆ　Ｓａｕｓｓｕｒｅａ　ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔｅ
ＷＥＩ　Ｓｈａｎ－ｊｕｎ，ＷＵ　Ｙｕｎ－ｆａｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｌｉｎ，ＬＵＯ　Ｙｕｎ－ｙａｎ，ＫＥ　Ｘｉａｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｙｉ－ｊｕｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｎｚｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｓａｕｓｓｕｒｅａ　ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔｅ　ａｓ　ｐｌａｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｕｓｓｕｒｅａ　ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｒｏｂｕｓｔ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｗａｙｓ．Ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｙ：ｌｅａｆ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　３～
５ｍｍ　ｗｅｒｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ
（７３．３±３．８）％ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　３ｗｅｅｋｓ　ｉｎ　ｄａｒｋｎｅｓｓ　ａｎｄ　４ｗｅｅｋｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ．Ｔｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｄｕｃｅ
２０１
北方园艺２０１４（０５）：１０３～１０５ ·植物保护·
　　　　
第一作者简介：周芳（１９８８－），女，河南开封人，硕士研究生，现主要
从事植物真菌病害及生物防治等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｆａｎｇｌｕｃｋ
＠１６３．ｃｏｍ．
责任作者：郝晓娟（１９７７－），女，山西晋中人，博士，副教授，现主要
从事植物病害生物防治等研究工作。
基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（３１０００８７３）；山西
省科技攻关资助项目（２０１２０３１１０１６－２）；山西农业大学中青年学术
骨干基金资助项目（ＸＧ２０１２１０）。
收稿日期：２０１３－１１－１５
十种杀菌剂对欧李褐腐病菌的室内毒力测定
周 　 芳，郝 晓 娟，程 　 超，王 美 琴，李 新 凤，王 建 明
（山西农业大学 农学院，山西 太谷０３０８０１）
　　摘　要：以１０种杀菌剂为试材，以欧李褐腐病菌为研究对象，采用菌丝生长速率法和孢子萌发
抑制法测定了１０种杀菌剂对欧李褐腐病菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ　ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）的室内毒力，以筛选出防治欧李褐
腐病的有效药剂。结果表明：４３０ｇ／Ｌ戊唑醇悬浮剂、２４％腈苯唑悬浮剂、１０％苯醚甲环唑水分散粒
剂、８０％多菌灵可湿性粉剂、７０％甲基硫菌灵可湿性粉剂、５００ｇ／Ｌ异菌脲悬浮剂、５０％腐霉利可湿性
粉剂对欧李褐腐病菌菌丝生长的半致死浓度（ＥＣ５０）均低于０．７００ｍｇ／Ｌ，其中４３０ｇ／Ｌ戊唑醇悬浮剂
对菌丝的抑制效果最好，ＥＣ５０为０．０２７ｍｇ／Ｌ；８０％代森锰锌可湿性粉剂对菌丝的抑制效果最差，ＥＣ５０
为５７．６４５ｍｇ／Ｌ。供试的１０种药剂对孢子萌发的ＥＣ５０均低于２．５００ｍｇ／Ｌ，抑制作用最强的是５００ｇ／Ｌ
异菌脲悬浮剂，ＥＣ５０为０．０２４ｍｇ／Ｌ；效果最差的是８０％代森锰锌可湿性粉剂，ＥＣ５０为２．４９６ｍｇ／Ｌ。２４％
腈苯唑悬浮剂、４３０ｇ／Ｌ戊唑醇悬浮剂、５００ｇ／Ｌ异菌脲悬浮剂可以用于欧李褐腐病的防治。
关键词：欧李褐腐病；美澳型核果链核盘菌；杀菌剂；毒力
中图分类号：Ｓ　４３６．６２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１４）０５－０１０３－０３
　　欧李（Ｃｅｒａｓｕｓ　ｈｕｍｉｌｉｓ）广泛分布于我国华北、西北、
东北及华东等地区，其果实钙含量居所有经济型水果之
首，因此又名“钙果”［１］。除含钙丰富外，欧李果实中还含
有多种维生素、氨基酸及铁锌硒等矿物元素，具有降压、
降胆固醇、抗炎症和抗癌作用［２］，是我国特有的新一代
保健型果品［３－４］。近年来，欧李种植发展势头迅猛，但随
着种植面积的增加，病害问题日益突出。欧李褐腐病
２０１１年首次报道于辽宁省［５］，在山西省欧李种植区同样
　　　　
发生普遍，生长后期如遇多雨潮湿天气，引起果实腐烂，
发病率高达８０％以上，使果实丧失经济价值。杜俊杰
等［６］认为褐腐病是欧李生产中危害最为严重的病害。
褐腐病菌主要以菌丝体在僵果上越冬，翌年僵果表面产
生大量分生孢子，通过风雨传播引起初次侵染。国内尚
未发现该病菌的有性阶段，因此分生孢子在初侵染中起
主要作用。适宜条件下，病部可产生大量分生孢子，进
行再次侵染。目前欧李褐腐病防治及药剂筛选尚鲜见
报道，筛选出能有效抑制欧李褐腐病菌菌丝生长和分生
孢子萌发的化学药剂，对该病害的有效防控至关重要。
现采用菌丝生长速率法和孢子萌发抑制法测定了１０种
杀菌剂对欧李褐腐病菌（美澳型核果链核盘菌）Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ
ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ的室内毒力，以期筛选出防治欧李褐腐病的
有效药剂，为该病害的化学防治提供参考。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试欧李褐腐病菌（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ　ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ），由山西
　　　　
ｈｅａｌｔｈｙ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｓｈｏｏｔ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ（５．０±０．３）ｓｈｏｏｔｓ／ｅｘｐｌａｎｔ．Ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｙ：ｃａｌｉ
ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＴＤＺ　０．５ｍｇ／Ｌ　ｆｏｒ　３ｗｅｅｋｓ　ｉｎ
ｄａｒｋｎｅｓｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ　ｆｏｒ　４ｗｅｅｋｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ．
（８８．９±５．９）％ｏｆ　ｃａｌｉ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｓｈｏｏｔ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ（５．５±０．４）ｓｈｏｏｔｓ／ｃａｌｕｓ．Ａｆｔｅｒ
ｇｒｏｗｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．０５ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．３ｍｇ／Ｌ　ｆｏｒ　３ｔｏ　４ｗｅｅｋｓ，ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｂｅｃａｍｅ
ｓｔｒｏｎｇｅｒ．Ｔｈｕｓ，ａｌｍｏｓｔ　１００％ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｒｏｏｔ　ｗｅｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳ＋ＩＢＡ　０．５ｍｇ／Ｌ＋０．１％ａｃｔｉｖｅ　ｃａｒｂｏｎ．
Ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｓ．ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓａｕｓｓｕｒｅａ　ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔｅ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；ｐｌａｎｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ｈｏｒｍｏｎｅ；ｉｎｄｕｃｅ
３０１