全 文 ：微生物学通报 Jun. 20, 2014, 41(6): 1035−1042
Microbiology China © 2014 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.130443


基金项目：山东省自然科学基金联合专项项目(No. ZR2010CL005)；烟台市科技发展计划项目(No. 2011069)
*通讯作者：Tel：86-535-6675148； ：chengxianhao@sohu.com
收稿日期：2013-07-08；接受日期：2013-09-29；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2013-10-29
研究报告
亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的提纯及性质
张琪 1 程显好 2* 郭文娟 1 刘凤红 2 王朝霞 2
(1. 天津工业大学 天津 300387)
(2. 鲁东大学 菌物科学与技术研究院 山东 烟台 264025)


摘 要：【目的】探讨锌离子诱导亚香棒虫草(Cordyceps hawkesii)菌丝体金属硫蛋白的产生及性
质。【方法】亚香棒虫草菌丝体以 18 g/L Zn2+在 10 L发酵罐中诱导培养 64 h后收集菌丝体，产
率为每升发酵液收集 12.2 g菌丝体(干重)，细胞破碎取上清液通过 2次凝胶柱层析，冷冻干燥
得到亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白纯品。利用考马斯亮蓝法(Bradford 法)进行含量测定，用银饱
和分析法结合原子吸收光谱(AAS)测定 MT含量，用 Ellman’s方法和火焰原子吸收法分别测得
巯基含量和结合锌原子数，用电喷雾质谱仪测得分子量，全自动氨基酸分析仪测氨基酸组成。
通过对羟基自由基、DPPH 自由基和超氧阴离子自由基的清除率试验探讨亚香棒虫草金属硫蛋
白的抗氧化活性。【结果】发酵终点金属硫蛋白产量为 15.3 mg/g菌丝体湿重。金属硫蛋白的分
子量为 7 680 Da，每分子蛋白质含有 18个巯基、结合 4个 Zn原子。氨基酸组成分析结果显示，
每分子蛋白质共含 60个氨基酸，其中含有 15个半胱氨酸，且含有组氨酸和芳香族氨基酸。亚
香棒虫草金属硫蛋白的抗氧化活性稍强于谷胱甘肽，弱于动物金属硫蛋白。【结论】亚香棒虫
草在 Zn2+胁迫下能够大量合成金属硫蛋白，且其金属硫蛋白的性质与哺乳动物金属硫蛋白有相
似性。
关键词：亚香棒虫草菌丝体，金属硫蛋白，锌诱导，氨基酸组成，抗氧化活性
Purification and characterization of metallothionein in
Cordyceps hawkesii mycelia
ZHANG Qi1 CHENG Xian-Hao2* GUO Wen-Juan1 LIU Feng-Hong2 WANG Zhao-Xia2
(1. Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387, China)
(2. Institute of Fungi Science and Technology Research, Ludong University, Yantai, Shandong 264025, China)
Abstract: [Objective] To produce and characterize metallothionein in Cordyceps hawkesii mycelia
under the zinc ion stress. [Methods] C. hawkesii achieved maximum mycelia of 12.2 g/L in a
fermenter as Zn2+ up to 18 g/L. Pure C. hawkesii mycelia Zn-metallothionein was obtained with
Sephadex G-50 and desalting Sephadex G-25 gel filtration, dried by freeze-drying. The methods of
bradford and silver saturation with atomic absorption spectrometry analysis were used to separately
determine the protein content and MT content. The methods of Ellman’s reagent colorimetry and
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atomic flame absorption spectrometry were used to determine the sulfhydryl content and the number
of zinc atoms, respectively. The molecular weight of C. hawkesii mycelia Zn-metallothionein was
determined by electron spray mass spectrometry (ESMS). Automatic amino acid analyzer measured
amino acid composition. The antioxidant activity was identified by scavenging capacity of hydroxyl
radicals, DPPH radicals and superoxide anion radicals. [Results] The Zn-metallothionein reached
15.3 mg/g mycelium (wet weight) after 64 h of fermentation. The molecular weight of
Zn-metallothionein was 7 680 Da. One molecule Zn-metallothionein contained 18 mercapto groups
and combined 4 zinc atoms. Amino acid composition analysis shows that each molecule of the
protein contained 60 molecules of amino acids, which contained 15 molecules of cysteine, and
contained three molecules of histidine and one molecule of aromatic amino acid. The antioxidant
activity was slightly stronger than glutathione and weaker than mammal metallothionein.
[Conclusion] C. hawkesii can synthesize Zn-metallothionein under Zn2+ stress and the structure was
similar to mammalian metallothioneins.
Keywords: Cordyceps hawkesii mycelia, Zn-metallothionein, Zinc induced, Amino acid
composition, Antioxidant activity

金属硫蛋白(Metallothionein，简称 MT)是广泛
存在于动物、微生物、植物中的一种低分子量(一
般为 2−8 kD)、高金属含量、富含半胱氨酸
(20%−30%)、不含芳香族氨基酸，不含或含极少量
组氨酸的蛋白质[1]。真核微生物中分离出的金属硫
蛋白基本结构、性质与动物体内的金属硫蛋白类
似，只在半胱氨酸含量、结合金属的数量、氨基酸
组成及蛋白质的结构域上略有差别，故称之为类金
属硫蛋白 (Metallothionein like protein，简称
MTL)[2]。自 1957 年美国生物学家 Margoshes 和
Vallee[3]发现金属硫蛋白到现在，金属硫蛋白的药
学及生物学特性已得到广泛研究，其具有抗氧化、
清除自由基、重金属解毒、维持生物体内金属含量
动态平衡、提高机体免疫、抗肿瘤等功能[4]。现如
今 MT的主要来源是动物肝脏，但其成本高、产量
低、生产周期长等缺点使 MT市场价极高，严重影
响其推广及应用。
本实验室前期工作中发现，亚香棒虫草
(Cordyceps hawkesii)菌丝体对锌有超富集能力[5]，
此外亚香棒虫草菌丝体具有来源广泛、发酵周期
短、成本低等优点。所以本研究将以深层液态发酵
亚香棒虫草菌丝体为研究对象，研究这种新的材料
来源是否能够产生金属硫蛋白，对 MT的提取分离
过程进行简化，并进行初步性质鉴定，以期为工业
化大量生产 MT提供合理的开发依据。
1 材料与方法
1.1 菌种
亚香棒虫草菌株(Cordyceps hawkesii)，购于中
国林业微生物菌种保藏管理中心，编号 CFCC
5967。保藏于 PDA培养基。对于所购菌株进行简
单的形态鉴定发现，其生长茂盛，在固体培养基上
菌落呈白色棉花团絮状，菌丝排列比较密集；分生
孢子聚集成团，近椭球形，其呈现出的基本形态符
合虫草属菌株的基本特征。
1.2 培养基
发酵培养基(g/L)：葡萄糖 25，酵母浸粉 5，蛋
白胨 6，磷酸二氢钾 1，硫酸镁 1，pH 6.0−7.0。
1.3 液体种子的制备
将保藏菌种接入试管斜面培养基中，25 °C培
养 8 d，置于 4 °C保存。置 200 mL液体培养基于
500 mL锥形瓶中，1×105 Pa灭菌 30 min，每瓶液
体培养基中接一块活化好的约 5 mm3大小的菌种，
25 °C、150 r/min摇床中培养 3 d。
1.4 硫酸锌诱导亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白
最适浓度的筛选
液体培养基中添加 ZnSO4·7H2O，Zn2+的质量
浓度设置在 0−20 g/L范围内，梯度为 1 g/L，共设
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1 个空白对照组和 20 个实验组，每组 5 个平行实
验。置 200 mL液体培养基于 500 mL锥形瓶中，
于 1×105 Pa灭菌 30 min，接入 5 mL种子液，于
25 °C、150 r/min摇床中培养 8 d。过滤后，将菌丝
体用清水洗 3次，分别测其菌丝体的产量、菌丝体
中锌含量和菌丝体中 MT含量。
1.5 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT发酵罐放大培养
仪器设备：10 L发酵罐(SY-3005B，上海世远
生物设备工程有限公司)。
发酵条件[6]：装液量 6 L/10 L，接种量 3%，
Zn2+的质量浓度：18 g/L，通气量 0.5 m3/h，发酵
搅拌转速 250 r/min，发酵温度 26 °C，pH 6.5，发
酵时间 88 h。
1.6 亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的提纯
将富集锌的亚香棒虫草菌丝体经抽滤除去液
体培养基，用无菌水洗涤 3−4 次，抽干得到菌丝
体；取研钵研磨后的菌丝体于烧杯中，加入相当于
试样质量 4倍体积的 1 mol/L NaOH溶液，充分搅
拌 10 min。煮沸 10 min破碎细胞且变性除杂蛋白，
冰块迅速制冷，中和至中性，于 4 °C、5 000 r/min
离心 20 min。取上清液于 80 °C水浴中热变性除杂
蛋白质 5−10 min，冷却，4 °C、10 000 r/min离心
25 min，取上清液−20 °C贮存。
取35 mL上清液上样于预先充分平衡好的Sephadex
G-50 (φ5 cm×40 cm)柱进行分离，以纯水作洗脱剂
进行洗脱，流速 1.6 mL/min，每 10 min收集 1管。
对洗脱液进行紫外(254 nm)和锌信号检测，收集含
锌的蛋白组分，用旋转蒸发仪短时间低温浓缩后真
空冷冻干燥，得到 MT粗品。用超纯水溶解冻干粉，
上样于预先充分平衡好的脱盐柱 Sephadex
G-25 (φ2.5 cm×50 cm)，以超纯水为洗脱剂，流速
0.8 mL/min，每 10 min收集 1管，脱盐纯化 2次，收
集有效锌结合蛋白组分，真空冷冻干燥得到纯度较
高的 MT。
1.7 金属硫蛋白的分析和鉴定
1.7.1 MT 的紫外吸收光谱特征图：取 1 mg MT
于 500 mL无菌水中，在 pH分别为 8.0和 2.0条件
下，210−320 nm 紫外区进行连续扫描，间隔为
0.5 nm。得到该蛋白组分的紫外吸收光谱特征图。
1.7.2 Zn-MT 的定量测定[7]：利用银饱和分析法
结合原子吸收光谱(原子吸收分光光度仪 AA800
型，美国 PE公司)检测菌丝体中 MT的含量。利用
公式：MT (μg/mg菌丝体)=(CAg+−CBKG)×3.55×VT/m
计算出菌丝体中 MT的含量。其中，CAg+为最终上
清液中 Ag+的质量浓度，CBKG 为不加样品液的空
白样品最终上清液的读数；VT 为最终总体积；m
为得到样品液所用菌丝体的质量。
1.7.3 蛋白质含量测定 [8]：利用考马斯亮蓝法
(Bradford法)测定样品中蛋白质的含量。
1.7.4 锌含量测定[9]：利用火焰原子吸收法测定样
品中 Zn含量。
1.7.5 巯基含量测定[10]：利用简化的 DTNB 法测
定巯基含量。
1.7.6 金属硫蛋白分子量测定[11]：利用电喷雾质
谱仪(Quattro，英国质谱公司)测定分子量。将金属
硫蛋白干粉溶于含 0.1%乙酸的甲酸溶剂中，配成
10 mg/L的待测液。将浓度为 10 mg/L的待测金属
硫蛋白流动注射进样(FIA)，电喷雾离子化正离子
方式(ESI+)，毛细管电压 3 850 V，锥电压 60 V，干
燥气温度 130 °C，干燥气流速 417 L/h，雾化气流
速 70 L/h，采集质量范围 0−16 000 (m/z)。由仪器
软件计算出分子量。
1.7.7 氨基酸组成测定：准确称量两份 200 μg金
属硫蛋白冻干粉，一份中先加入 0.08 mL过甲酸，
−10 °C充分反应 4 h，取出后冻干抽去过甲酸，加
蒸馏水再冻干。此份过甲酸氧化的样品和另一份未
用过甲酸氧化样品，各加入 0.8 mL 6 mol/L恒沸
HCl溶液于水解管中，于 110 °C真空状态下水解
24 h，启封后加 2 mL质量浓度为 0.02 mol/L NaOH
静置 4 h，用 0.1 mol/L 的 HCl 溶液中和后，用
0.02 mol/L HCl稀释于 250 mL容量瓶中，上机(日
立 835-50型氨基酸自动分析仪)分析氨基酸组成。
氨基酸标准和水解样品用茚三酮显色，在 570 nm
和 440 nm双波长下测定。过甲酸氧化法用于测得
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半胱氨酸含量。
1.8 抗氧化性试验
1.8.1 羟自由基的清除率：按文献[12]方法测定。
1.8.2 DPPH 自由基的清除率：按文献[13]方法
测定。
1.8.3 超氧阴离子自由基的清除率：按文献[14]方
法测定。
2 结果与分析
2.1 亚香棒虫草菌丝体MT诱导条件的选择
培养基中加入不同浓度的 Zn2+后，亚香棒虫草
菌丝体中 Zn 含量、MT 含量和菌丝体产量的变化
见图 1。在 0−18 g/L范围内，亚香棒虫草菌丝体内
富集 Zn的量与合成 MT的量正相关，二者与菌丝
体产量呈负相关关系。细胞受到重金属胁迫是菌丝
体产量降低的原因之一。由于菌丝体细胞具有自我
解毒机制，因此在重金属胁迫下仍可正常新陈代
谢，MT就是代谢产物之一。在 Zn2+浓度为 18 g/L
时，亚香棒虫草菌丝体内合成 MT的量最大，经计



图 1 不同 Zn2+浓度下亚香棒虫草菌丝体中锌含量、MT
含量和 200 mL发酵液中菌丝体产量
Figure 1 Zinc and MT contents in Cordyceps hawkesii
mycelia and mycelia yields of 200 mL fermentation of
different zinc concentration
算得 200 mL发酵液可产生 96 mg MT，可见此浓度
下MT总产量较高。当 Zn2+浓度大于 18 g/L时，菌
丝体产量锐减，MT总产量明显下降。出于不同 Zn2+
浓度下发酵液中MT总产量的考虑，确定在发酵罐
扩大培养亚香棒虫草菌丝体时，Zn2+浓度为 18 g/L。
2.2 10 L发酵罐放大培养亚香棒虫草菌丝体过
程发酵终点的确定
在 10 L发酵罐培养条件下，亚香棒虫草菌丝
体生物量及 MT随培养时间的变化规律，见图 2。
前 16 h为调整期，16−48 h为对数生长期，48−64 h
为稳定期，64 h以后进入衰亡期。培养至 56 h时，
菌丝体生物量达到 10.378 6 g/L，菌丝体内 MT的
含量为 16.365 mg/g菌丝体湿重，计算得 MT总产
量为 169.8 mg；而在 64 h时生物量高达 12.164 g/L，
菌丝体内 MT的含量却降低至到 15.335 mg/g菌丝
体湿重，计算得 MT的总产量为 186.5 mg。从 MT
总产量方面考虑，确定 10 L发酵罐扩大培养亚香
棒发酵终点为 64 h。
2.3 亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的纯化
2.3.1 Zn-MT 紫外吸收特征光谱测定：本研究中
的亚香棒虫草菌丝体锌结合蛋白质组分，在 pH为
8.0和 2.0条件下的紫外吸收光谱特征如图 3所示。



图 2 发酵过程中亚香棒虫草菌丝体生物量与MT含量
Figure 2 Mycelia biomass and MT contents of Cordyceps
hawkesii mycelia in the fermentation process
张琪等: 亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的提纯及性质 1039

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图 3 金属硫蛋白紫外扫描光谱图
Figure 3 Ultraviolet absorption spectra of Zn-MT

这种锌结合蛋白在 210−300 nm范围内出现明显的
肩峰。当 pH 2.0时，蛋白质在 280 nm处的吸收比
在 240−260 nm范围的吸收少很多；而当 pH 8.0时
此吸收峰仍有部分吸收峰，说明亚香棒虫草菌丝体
中的锌结合蛋白含少量芳香族氨基酸，此亚香棒虫
草菌丝体金属硫蛋白的光谱特征，与锌结合的兔肝
标准金属硫蛋白(Zn-MT)略有不同。在酸性条件下
MT分子上结合的金属可脱去，去金属的硫蛋白在
低 pH 值时较稳定。Zn-MT 在 pH 为 3.5−4.5 时有
50%的金属离子发生解离，脱金属后的硫蛋白在
190 nm处有一明显的肽键吸收峰。而在碱性环境
下硫蛋白分子之间发生二硫交联，形成稳定的大分
子聚合物，使其在 254 nm附近的吸光度不明显[15]。
可据此对不同种类的 MT进行分离鉴定。通过对比
纯化的亚香棒虫草菌丝体锌结合蛋白组分与标准
Zn-MT 的反相色谱图，可发现二者的脱金属蛋白
色谱图相似。参照现有的研究报道，同时鉴于亚香
棒虫草菌丝体诱导产生的锌结合蛋白质与哺乳动
物提取的 MT光谱特征具有一定的相似性，基本确
定此虫草结合蛋白为本研究所想得到的锌结合硫
蛋白(Zn-MT)。
2.3.2 亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的纯化：经锌
诱导的亚香棒虫草菌丝体蛋白质粗提取液用凝胶
层析柱 Sephadex G-50 分离的结果如图 4 所示。


图 4 亚香棒虫草菌丝体粗提取液经G-50凝胶层析分离
的色谱图
Figure 4 Chromatogram of crude protein extract of
Cordyceps hawkesii mycelia by Sephadex G-50 gel filtration
column separation

图 4第 13管处有一个较强的紫外吸收峰，对应的
锌信号偏低，由其外观都呈淡黄色，可能是分子量
较大的色素组分；而图 4第 61管处又出现一个强
的紫外吸收峰，其对应的锌信号都很强，且由于该
峰的洗脱位置与标准兔肝金属硫蛋白的位置基本
一致，可推测该峰为本研究所需提取的锌结合硫蛋
白组分，收集第二个洗脱峰的有效洗脱液，真空冷
冻干燥得到纯度为55%以上的呈淡黄色略带腥味金
属硫蛋白粗品。超纯水溶解冻干粉，经 Sephadex
G-25 层析柱脱盐，收集洗脱峰的有效洗脱液进行
真空冷冻干燥，这样可得到纯度为 85%以上的雪白
色无气味的金属硫蛋白精品。
2.4 亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的性质鉴定
2.4.1 金属硫蛋白性质测定：由图 5电喷雾质谱的
测定结果得到亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 分子量为
7 680 Da。纯化的亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT中含
Zn量为 34.1 g/g MT，巯基含量为 2.384 mol/g MT，
由此推算出每分子 Zn-MT 中含 4 个锌原子和 18
个巯基。因半胱氨酸和甲硫氨酸中均含有巯基，由
以下氨基酸组成测定结果不难看出所测得的巯基
数目与半胱氨酸和甲硫氨酸的总数目相符。

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图 5 电喷雾质谱测定分子量
Figure 5 ESMS spectrum of m/z

2.4.2 氨基酸组成分析：由氨基酸组成测定显示
(表 1)，亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 总数趋近于
60个氨基酸。其中疏水性氨基酸，如：Ala、Val、
Leu、Ile、Pro、Tyr，共有 15 个，占 25%；半胱氨
酸 15个，占 25%；含有 3个组氨酸和 1个酪氨酸等
芳香族氨基酸，占 6.7%。而典型的哺乳动物MT (以

表 1 亚香棒虫草金属硫蛋白的氨基酸组成
Table 1 Amino acid composition of Zn-MT from
Cordyceps hawkesii
氨基酸
Amino acid
含量
Relative molar
quantities (%)
残基数
Probable
number of
residues
邻近整数
Nearest
integer
半胱氨酸 Cys 26.645 3 15.4 15
天冬氨酸 Asp/Asn 6.552 2 3.7 4
苏氨酸 Thr 5.261 7 3.1 3
丝氨酸 Ser 4.883 3 3.3 3
谷氨酸 Glu 10.498 7 4.9 5
脯氨酸 Pro 2.954 5 1.6 2
甘氨酸 Gly/Gln 5.976 6 5.5 6
丙氨酸 Ala 6.498 2 5.1 5
缬氨酸 Val 0.029 7 0 0
甲硫氨酸 Met 2.993 1 2.6 3
异亮氨酸 Ile 4.319 7 2.9 3
亮氨酸 Leu 7.403 6 3.9 4
苯丙氨酸 Phe 0.046 6 0 0
组氨酸 His 6.781 9 3.0 3
赖氨酸 Lys 5.504 9 2.8 3
精氨酸 Arg 0.737 2 0.4 0
酪氨酸 Tyr 2.515 9 1.3 1
总量 Total 99.603 1 59.5 60
小鼠肝脏MT-Ⅱ为例)，每分子含有 18个半胱氨酸，
占 28%，且能结合 7 个锌原子，疏水氨基酸占
22.7%，不含任何芳香族氨基酸或组氨酸[16]。说明
亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT与哺乳动物 Zn-MT在分
子组成具有一定的相似性和差异性。
2.5 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT的抗氧化性试验
2.5.1 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT对羟基自由基的
清除作用：羟基自由基(·OH)具有极高的氧化电位，
是目前自然界中所知活性氧自由基中仅次于氟的
氧化剂，是对生物体毒性最强、危害最大的一种自
由基。大量研究证明，金属硫蛋白和谷胱甘肽对羟
基自由基的清除能力很强。以谷胱甘肽清除羟基自
由基的能力与亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白清除
羟基自由基能力作比较。由图 6 可知，Zn-MT 清
除羟基自由基的能力随着 MT 浓度的增加呈增长
趋势，且其半数清除率浓度(IC50)为 81.14 mg/L，
谷胱甘肽的 IC50为 61.05 mg/L。半数清除率浓度
IC50 大小与其自由基清除能力成反比，即 IC50 越
小，表明该种物质清除能力越强。亚香棒虫草菌丝
体 Zn-MT清除羟基自由基的能力弱于谷胱甘肽。
2.5.2 亚香棒虫草菌丝体Zn-MT对DPPH自由基
的清除作用：DPPH自由基是一种紫黑色的稳定的
醇溶性自由基，于 517 nm波长处有强吸收。通过
在 517 nm 处的吸光值来反映自由基被清除的程
度，清除自由基的能力越强，其抗氧化活性越高。
亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT清除 DPPH自由基的能
力与谷胱甘肽作比较。由图 7 可看出，Zn-MT 对
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图 6 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT清除羟基自由基的能力
Figure 6 The abilitity of eliminating hydroxyl radical of
Cordyceps hawkesii mycelia Zn-MT



图 7 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT清除 DPPH自由基的
能力
Figure 7 The abilitity of eliminating DPPH radical of
Cordyceps hawkesii mycelia Zn-MT

DPPH自由基的清除能力与其浓度成正比。且亚香
棒虫草菌丝体 Zn-MT 和谷胱甘肽的 IC50 分别为
80.37 mg/L和 82.22 mg/L。按半数清除率浓度看亚
香棒虫草菌丝体 Zn-MT清除 DPPH自由基的能力
稍强于谷胱甘肽。
2.5.3 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT对超氧阴离子自
由基的清除作用：超氧阴离子自由基具有强氧化
性，是机体内生命代谢产生的寿命很长的自由基。
本实验利用邻苯三酚在碱性环境下发生自氧化反
应测定 Zn-MT 对反应体系中产生的超氧阴离子自
由基的清除作用。以谷胱甘肽清除超氧阴离子自由
基的能力作为比较实验。如图 8所示，亚香棒虫草
菌丝体 Zn-MT 对超氧阴离子自由基的清除能力随
着亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 浓度的增加而增强。
其中亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 和谷胱甘肽的半数
清除率 IC50分别为 82.22 mg/L和 83.53 mg/L。由
此可见亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 对超氧阴离子自
由基的清除能力稍强于谷胱甘肽。
2.5.4 小结：谷胱甘肽是一种还原性很强的内源性
自由基清除剂，所以采用谷胱甘肽来做对照实验，
比较本研究中的亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 的抗氧
化活性。现已有研究证明典型动物金属硫蛋白抗氧
化活性很强，其清除超氧阴离子自由基的能力约为
GSH的 25倍[1]。而本研究中的虫草菌丝体 MT的
抗氧化能力稍强于谷胱甘肽，这说明在抗氧化活性
方面，亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT 虽强，但仍弱于
典型的动物金属硫蛋白活性。
3 讨论
氨基酸组成分析表明，亚香棒虫草菌丝体 MT
与典型的哺乳动物MT (以小鼠肝脏MT-Ⅱ为例)既



图 8 亚香棒虫草菌丝体 Zn-MT清除超氧阴离子的能力
Figure 8 The abilitity of eliminating superoxide anion
radical of Cordyceps hawkesii mycelia Zn-MT
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具有一定的相似性，又存在明显的差异；而从氨基
酸组成和结合金属原子的量来看与酵母菌 MT[17]
类似。不同生物体内的 MT结构普遍有差异性。亚
香棒虫草菌丝体 Zn-MT 半胱氨酸含量较高，但含
有少量芳香族氨基酸和组氨酸，金属结合能力弱于
哺乳动物 MT。研究证明典型的动物金属硫蛋白清
除自由基的能力远远强于谷胱甘肽，但本研究中的
亚香棒虫草菌丝体 MT 清除自由基的能力只是稍
强于谷胱甘肽而已。以上说明亚香棒虫草菌丝体
MT相对于哺乳动物 MT来说，是一种进化上功能
趋同于动物 MT，高级结构上相似于动物 MT[18]的
虫草金属结合蛋白，是亚香棒虫草菌丝体能够耐受
环境中金属污染的重要原因之一。
目前虫草菌丝体金属硫蛋白研究很少，本研究
提供了一种有效的、简化的金属硫蛋白提纯方法；
对亚香棒虫草菌丝体 MT进行初步性质鉴定，确定
一种新的能够生产金属硫蛋白的材料与方法。对于
虫草菌丝体金属硫蛋白高级分子结构以及金属与
巯基的络合常数的测定有待进一步研究。
到目前为止，金属硫蛋白的商业化生产和研究
性提纯主要依据动物肝脏或植物提取工艺，这些工
艺具有操作复杂、成本高、生产周期长、产率低等
缺点，极大地影响了金属硫蛋白的研究和应用。本
文以亚香棒虫草菌株为材料，采用液态深层发酵并
用 ZnSO4 胁迫其菌丝体合成金属硫蛋白，发酵终
点时产率为 15.335 mg/g (菌丝体湿重)，相较于传
统的提纯方法，其生产周期缩短、工艺简化、产率
提高、成本降低。
亚香棒虫草菌丝体金属硫蛋白的产量受环境
中锌离子浓度的影响变化显著，亚香棒虫草菌丝
体对金属离子有明显的富集作用，由此可以判断
亚香棒虫草菌丝体耐受环境中金属污染的一种原
因之一是金属诱导其产生大量金属硫蛋白，把有
害金属以游离离子的形式转化为无害的蛋白结合
形式。鉴于亚香棒虫草菌丝体在大规模发酵培养
上的优越性，其金属硫蛋白会有在工业化生产的
潜力。
参 考 文 献
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