全 文 ：第 29 卷第 3 期 烟台大学学报(自然科学与工程版) Vol． 29 No． 3
2016 年 7 月 Journal of Yantai University (Natural Science and Engineering Edition) Jul． 2016
文章编号:1004-8820(2016)03-0187-06 doi:10． 13951 / j． cnki． 37-1213 /n． 2016． 03． 006
收稿日期:2016-03-17
基金项目:国家重大新药创制科技重大专项课题资助项目(2011ZX09102 － 006 － 04)．
作者简介:李方悦(1990-)，男，山东济南人，硕士研究生．
通信作者:许卉(xuhui33@ sina． com)，教授，博士，研究方向:药物分析及药代动力学．
新疆紫草指纹图谱的建立
李方悦1，曹雪霖2，郝盛源1，刘 卉1，邢绍蓉1，许 卉1
(1．烟台大学药学院，山东 烟台 264005;2．武警后勤学院学员二旅，天津 300309)
摘要:为了给紫草的质量控制提供依据，建立了用于新疆紫草药材指纹图谱的 ＲP －
HPLC条件．在 518 nm下四氢呋喃 －乙腈 －甲酸水(0. 17%)三元混合溶剂等度洗脱体系
(43∶ 8∶ 49，v / v / v)为流动相，将 10 批样品的 HPLC测试数据导入国家药典委员会“中药指
纹图谱相似度评价系统(2012A)”软件进行处理，以 ZC － 01 的谱图 S1 作为参照谱图，生
成对照指纹图谱． 10 批样品的指纹图谱与对照指纹图谱比较，相似度在 0. 995 以上;各批
新疆紫草羟基萘醌指纹图谱中共有峰的相对保留时间基本一致，相对标准偏差 ＲSD(n =
6)均小于 1% ．由于样品来源不同，各批样品共有峰的相对峰面积及百分峰面积存在一定
差异;各批样品所含共有峰峰面积均大于 95%;10 批新疆紫草羟基萘醌指纹图谱的相似
度均大于 0. 995，根据研究结果并考虑大生产的复杂性暂定新疆紫草羟基萘醌指纹图谱
的相似度应大于 0. 990．
关键词:羟基萘醌;新疆紫草;指纹图谱;反向高效液相色谱(ＲP － HPLC)
中图分类号:Ｒ931. 5 文献标志码:A
紫草(Arnebiae Ｒadix)是历版《中国药典》收载
的一种常用中药，为紫草科植物新疆紫草 Arnebia
euchroma Johnst或内蒙紫草 Arnebia guttata Bunge的
干燥根．紫草味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有清热凉
血、活血解毒、透疹消斑的功效，中医常用于血热毒
盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等的
治疗［1］．
羟基萘醌类成分是新疆紫草药材及其制品质量
控制的重要指标性成分［2］．软紫草中的羟基萘醌绝
对构型为 S型，即阿卡宁(AK)及其衍生物;硬紫草
中则为 Ｒ型，即紫草素及其衍生物． 新疆紫草是常
用的中药材，属于软紫草［3 － 4］．不同品种的紫草羟基
萘醌类成分种类与含量有较大差异，文献报道以新
疆紫草中羟基萘醌的含量最高，可达 1. 17% ～
6. 30%［5 － 6］．建立新疆紫草指纹图谱对新疆紫草的
质量控制具有重要意义．
由于多种紫草羟基萘醌类成分的化学结构相
近，满足各单体成分同时分别定量测定的 HPLC 分
离条件筛选成为一种挑战，特别是对于 α －甲基正
丁酰紫草素(MBAK)和异戊酰紫草素(IVAK)这一
对构造异构体的分离． 较早的文献研究了同时测定
多种羟基萘醌类化合物的方法，未能有效分离
MBAK 和 IVAK［7 － 10］． 目前尚未见文献报道针对
MBAK和 IVAK 进行有效分离的 ＲP － HPLC 方法．
本研究在文献［11］基础上系统考察了乙腈 －水、甲醇
－水、乙腈 －甲醇 －水、四氢呋喃 －水等混合溶剂体
系下的阿卡宁(AK)、乙酰阿卡阿宁(ACAK)、β －乙
酰氧基异戊酰阿卡宁 (AOAK)、去氧阿卡宁
(DOAK)、β，β＇－二甲基丙烯酰阿卡宁(DAAK)α －
甲基正丁酰紫草素(MBAK)、异戊酰紫草素(IVAK)
烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 29 卷
7 种常见羟基萘醌成分的色谱行为，并重点关注
MLAK与 IVAK的分离情况． 最终得到了优化的色
谱条件，各成分色谱峰的分离度均在 1. 5 以上，在系
统方法学验证的基础上，参考文献［12 － 14］与 2010 版
药典关于指纹图谱的有关规定，以新疆紫草中 AK
等 7 个主要紫草羟基萘醌类化合物为对照，指认了
新疆紫草中的 6 个共有峰，测定了 10 批新疆紫草的
HPLC色谱，并导入国家药典委员会“中药指纹图谱
相似度评价系统(2012A)”软件进行处理．确定紫草
的指纹图谱研究方法，对新疆紫草的鉴别与检查具
有参考意义．
1 实验部分
1. 1 仪器
Agilent1100 高效液相色谱仪(包括在线脱气
机，二元高压泵，自动进样器和 VWD检测器)，MET-
TLEＲ TOLEDO XS105 电子天平(梅特勒 －托利多
公司)，伟能达 200 型微型中药粉碎机．
1. 2 试药
对照品 β，β ＇ －二甲基丙烯酰阿卡宁(DAAK，
批号 111689 － 201405)购自中国食品药品检定研究
院;AK，批号 140715、ACAK，批号 140714、AOAK，
批号 140714 购自上海同田生物技术股份有限公司;
DOAK，批号 AV21、MLAK，批号 AV51、IVAK，批号
AV41 购自 TCI(上海)化成工业发展有限公司;四氢
呋喃、乙腈、甲醇均为 HPLC 级(美国默克公司);实
验用水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯． 10
批药材均经烟台大学药学院生药室鉴定，ZC － 01 ～
ZC －10 产地及批号见表 1．
表 1 药材产地及批号
Tab． 1 Medicinal origin and lot number
样品编号 产地 批号
ZC － 01 新疆阿克苏地区库车县 20140717
ZC － 02 新疆阿克苏地区拜城县 20140827
ZC － 03 柯尔克孜自治州阿图什 20140426
ZC － 04 柯尔克孜自治州乌恰 20140808
ZC － 05 博尔塔拉蒙古自治州温泉 20140519
ZC － 06 伊犁哈萨克自治州 20140627
ZC － 07 巴音郭楞蒙古自治州若羌县 20140622
ZC － 08 静县巴音布鲁克山区 20140719
ZC － 09 塔城地区克拉玛依市 20140810
ZC － 10 新疆乌鲁木齐市 20140901
1. 3 溶液的制备
1. 3. 1 对照品溶液 取 AK、ACAK、AOAK、DOAK、
DAAK、MLAK、IVAK对照品适量，精密称定，分别置
容量瓶中，加乙醇溶解，稀释至刻度，摇匀，得浓度分
别为 0. 2、2. 0、0. 2、0. 5、2. 5、1. 0、4. 0 mg /mL对照储
备溶液，0 ～ 4 ℃保存． 临用时，取适量，以乙醇为溶
剂稀释至所需浓度．
1. 3. 2 混合对照品溶液 分别精密吸取“1. 3. 1”
项下各对照品储备液适量，至 10 mL量瓶中，加乙醇
定容，摇匀，即得．
1. 3. 3 供试品溶液 取紫草粉末(过四号筛)约
0. 5 g，以石油醚(60 ～ 90℃)为溶剂超声提取，提取
液蒸干，残渣加流动相溶解，过滤后定容，得 200
mg /mL的药材供试品溶液．
1. 4 色谱条件
色谱柱:Alltima C18，250 × 4. 6 mm，5 μm;柱温:
30 ℃;流动相:四氢呋喃 － 乙腈 － 0. 17 %甲酸水
43∶ 8∶ 49(v / v / v);流速:1 mL /min;检测波长:518
nm;进样量:20 μL;运行时间:60 min．
2 结果与讨论
2. 1 色谱条件考察
紫草的指纹图谱研究最大的问题在于 MLAK
与 IVAK难以达到有效分离． 我们考察了不同的流
动相，发现在乙腈 －水体系中，MLAK与 IVAK的色
谱行为基本一致，无法分离;四氢呋喃 －水体系可对
二者实现一定程度的分离，但分离度不足 1. 5．在该
体系中加入一定量乙腈，并在水相中加入一定浓度
的甲酸以调节酸度，所得优化的四氢呋喃 －乙腈 －
甲酸水(0. 17%)三元混合溶剂等度洗脱体系(43∶ 8
∶ 49，v / v / v)，最终可获得对包括 MLAK、IVAK 在内
的 7 种羟基萘醌成分的有效分离．
2. 2 系统适用性与专属性试验
空白溶剂乙醇、流动相溶液、7 个羟基萘醌的单
一对照品溶液，以及混合对照品溶液和供试品溶液
分别进样，其中，混合对照品溶液和供试品溶液连续
进样 5 次，按 1. 4 项下方法测定，记录色谱图． 如图
1 所示，在混合对照品溶液的色谱图中，溶剂乙醇和
流动相对 7 个羟基萘醌成分均不产生干扰，各成分
色谱峰形良好，理论塔板数均在 8 000 以上，分离度
＞ 1. 5，且与同浓度单一对照品溶液色谱图中的色
谱峰面积相对偏差 ＜ ± 1%(0. 14% ～ 0. 98%)．在
混合对照品溶液以及供试品溶液连续进样 5 次的色
谱图中，7 个组分色谱峰面积测量值的 ＲSD 在
0. 5% ～1. 8%范围内，均不大于 2. 0% ．上述试验结
881
第 3 期 李方悦，等:新疆紫草指纹图谱的建立
果表明，所建立的 ＲP － HPLC 方法系统适用性和专
属性均满足指纹图谱测定的要求，可采用混合对照
品溶液作为对照进行 7 个组分的同时定性分析，可
指认 7 个色谱峰分别为 1 － AK;2 － ACAK;3 －
MOAK;4 － DOAK;5 － DAAK;6 － MLAK;7 －
IVAK．



6
4
2
0 1 2 3 4 5 6
t/min
A/
m
AU
1
2
3 4
5
6
7
图 1 供试品溶液 HPLC谱图
Fig． 1 HPLC chromatogram of the test solution
2

10
8
6
4
2
0 1 2 3 4 5 6
t/min
A/
m
AU
1
3
4
5
6
7
图 2 混合对照品溶液 HPLC谱图
Fig． 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance solution
2. 3 线性关系考察
取 DAAK 对照品适量，以乙醇为稀释溶剂，制
备混合对照的标准系列溶液，依 2. 2 项下条件进样
测定，记录色谱图，以各组分色谱峰面积(A)对其标
准溶液浓度(C，μg /mL)进行线性回归． 所建立的
ＲP － HPLC方法对于 7 种羟基萘醌组分定量测定的
线性相关系数 r 均大于 0. 995，线性范围 2 ～ 250
μg /mL内，可满足实际样品分析的需要．
2. 4 仪器精密度试验
取 1. 3. 3 项下供试品溶液，连续进样 5 次，分别
记录色谱图． 结果显示，AK、ACAK、AOAK、DOAK、
DAAK、MLAK和 IVAK色谱保留时间波动的 ＲSD分
别为 0. 41%、0. 42%、0. 37%、0. 47%、0. 48%、
0. 53%、0. 55%;色谱峰面积波动的 ＲSD 分别为
1. 9%、1. 0%、1. 4%、1. 7%、1. 2%、1. 2%、1. 2% ．上
述试验结果表明，本研究所建立的 ＲP － HPLC 方法
对于 7 中羟基萘醌组分的同时测定具有良好的仪器
精密度．
2. 5 稳定性试验
取 1. 3. 3 项下供试品溶液，分别在配制后 0 h、1
h、3 h、4 h、8 h 进样一次，记录色谱图． 结果 AK、
ACAK、AOAK、DAAK、MLAK和 IVAK色谱峰面积波
动的 ＲSD 分别为 1. 7%、1. 1%、1. 3%、1. 6%、
1. 3%、1. 1%、1. 1%，表明供试品溶液中 7 个羟基萘
醌成分在室温放置下 8 h 内稳定，可满足定量分析
对溶液稳定性的要求．
2. 6 重复性试验
照 1. 3. 3 项下方法，平行制备新疆紫草供试品
溶液 6 份，以混合对照品外标法测定各羟基萘醌组
分的含量 (w t)． 结果显示:AK、ACAK、AOAK、
DAAK、MLAK和 IVAK的平均含量分别为 0. 981‰、
21. 829‰、2. 081‰、22. 594‰、10. 590‰、33. 296‰，
981
烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 29 卷
ＲSD 分别为 1. 2%、1. 3%、1. 8%、1. 4%、1. 9%、
1. 5%、1. 2%，表明本研究所建立的 ＲP － HPLC 方
法用于 7 种羟基萘醌组分的同时测定重复性良好．
3 指纹图谱分析
以 1. 4 项下色谱条件测定 10 批新疆紫草羟基
萘醌，并导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似
度评价系统(2012A)”软件进行处理，10 批药材的
HPLC色谱重合性处理结果见图 3． 测定结果表明，
其中有 4 个主要色谱峰是 10 批新疆紫草羟基萘醌
所共有，以 5 号峰作为参照峰 S，与参照物对照确定
为 DAAK，进行相似度评价，结果见表 2．新疆紫草的
指纹图谱具有相似度高特点，考虑到植物生长的差
异性，将紫草的相似度限定在 0. 99 ～ 1. 00 之间．
表 2 10 批新疆紫草相似度结果
Tab． 2 Similarity evaluation of 10 batches of Ｒadix Lithospermi
编号 相似度 编号 相似度
ZC － 01 0. 996 ZC － 06 0. 998
ZC － 02 1. 000 ZC － 07 0. 997
ZC － 03 0. 998 ZC － 08 0. 996
ZC － 04 0. 997 ZC － 09 0. 995
ZC － 05 0. 996 ZC － 10 0. 995
0 10 20 30 40 50 60
t/min
S10(2)
↑
S1(2)
图 3 10 批新疆紫草 HPLC指纹图谱
Fig． 3 HPLC fingerprint of 10 batches of radix arnebiae
对 10 批新疆紫草的共有峰的相对峰面积、相对
保留时间和各峰百分峰面积进行了分析． 从结果可
以看出，各批新疆紫草羟基萘醌指纹图谱中共有峰
的相对保留时间基本一致，ＲSD(n = 6)均小于 1%，
见表 3;由于样品来源不同，各批样品共有峰的相对
峰面积及百分峰面积存在一定差异，见表 4;各批样
品所含非共有峰峰面积均小于 5%，共有峰峰面积
均大于 95%，见表 5;10 批新疆紫草羟基萘醌指纹
图谱的相似度均大于 0. 995，根据研究结果并考虑
工业生产的复杂性暂定新疆紫草羟基萘醌指纹图谱
的相似度应大于 0. 990．
表 3 10 批新疆紫草羟基萘醌共有峰的相对保留时间
Tab． 3 Ｒelative retention time of common peak in 10 batches of Ｒadix Lithospermi
峰号 ZC － 01 ZC － 02 ZC － 03 ZC － 04 ZC － 05 ZC － 06 ZC － 07 ZC － 08 ZC － 09 ZC － 10 均值 ＲSD /%
2 0. 635 0. 635 0. 636 0. 636 0. 636 0. 637 0. 637 0. 637 0. 637 0. 638 0. 636 0. 15
5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0. 00
6 1. 180 1. 179 1. 179 1. 178 1. 178 1. 177 1. 177 1. 177 1. 177 1. 177 1. 178 0. 09
7 1. 247 1. 246 1. 235 1. 245 1. 245 1. 244 1. 244 1. 243 1. 244 1. 243 1. 244 0. 26
091
第 3 期 李方悦，等:新疆紫草指纹图谱的建立
表 4 10 批新疆紫草共有峰的相对峰面积
Tab． 4 Ｒelative peak area of common peak in 10 batches of Ｒadix Lithospermi
峰号 ZC － 01 ZC － 02 ZC － 03 ZC － 04 ZC － 05 ZC － 06 ZC － 07 ZC － 08 ZC － 09 ZC － 10 均值
2 0. 476 0. 436 0. 447 0. 438 0. 410 0. 418 0. 398 0. 389 0. 573 0. 591 0. 458
5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6 0. 281 0. 283 0. 281 0. 275 0. 235 0. 297 0. 284 0. 246 0. 345 0. 348 0. 288
7 0. 838 0. 870 0. 848 0. 836 0. 698 0. 836 0. 793 0. 735 1. 074 1. 081 0. 861
表 5 10 批新疆紫草各峰百分比面积
Tab． 5 Peak area of 10 batches of Ｒadix Lithospermi %
峰号 ZC － 01 ZC － 02 ZC － 03 ZC － 04 ZC － 05 ZC － 06 ZC － 07 ZC － 08 ZC － 09 ZC － 10
1 2. 575 － 1. 142 － 3. 255 2. 130 2. 412 0. 845 － －
2 17. 706 16. 680 17. 000 17. 029 16. 909 15. 638 15. 330 16. 151 18. 839 19. 268共有峰
3 － － － － － 1. 532 1. 450 － 0. 487 0. 481非共有峰
4 0. 966 0. 986 0. 956 0. 894 － 0. 804 0. 831 0. 818 1. 114 1. 031非共有峰
5 36. 162 37. 247 36. 995 37. 890 39. 285 36. 454 37. 511 38. 495 31. 881 31. 615共有峰
6 10. 456 10. 831 10. 676 10. 679 9. 720 11. 137 10. 935 10. 203 11. 353 11. 344共有峰
7 31. 134 33. 256 32. 233 32. 509 28. 831 31. 306 30. 530 30. 489 35. 326 35. 261共有峰
与文献报道的其他方法相比，本研究首次利用
C18色谱柱完成了新疆紫草中含量较高的同分异构
体 MLAK 和 IVAK 的有效分离，并且以 7 个羟基萘
醌化合物的对照品对其中的羟基萘醌化合物进行了
定性研究，以其中一个含量最高的羟基萘醌化合物
DAAK作为对照峰，利用国家药典委员会“中药指纹
图谱相似度评价系统(2012A)”软件建立了羟基萘
醌含量最高的新疆紫草的对照指纹图谱，以此作为
新疆紫草的指纹图谱(图 4)．



6
4
2
0 1 2 3 4 5 6
t/min
A/
m
AU
1
2
3 4
5
6
7
图 4 新疆紫草对照指纹图谱
Fig． 4 Ｒeference fingerprint of radix arnebiae
3 结 论
本研究发展了对 7 种常见紫草羟基萘醌成分的
ＲP － HPLC分离方法，该方法利用常见的 HPLC 法，
使用 C18色谱柱完成了新疆紫草中同分异构体
MLAK和 IVAK的有效分离，建立了紫草的 HPLC指
纹图谱，用于紫草药材的质量控制与鉴别检查，结果
可靠，操作可行性好，为紫草的质量控制提供了一种
有效的手段．
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Established HPLC Fingerprint of Arnebia euchroma(Ｒoyle)Johnst
LI Fang-yue1，CAO Xue-lin2，HAO Sheng-yuan1，LIU Hui1，XING Shao-rong1，XU Hui1
(1． School of Pharmacy，Yantai University，Yantai 264005，China;2． Brigade Two，Logistics University of People s Armed Police
Force，Tianjin 300309，China)
Abstract:To establish the ＲP-HPLC conditions for Arnebia euchroma(Ｒoyle)Johnst on fingerprint，using the ter-
nary mixed solvent elution system tetrahydrofuran-acetonitrile-formic acid (0. 17%)(43∶ 8∶ 49，v / v / v)as the mo-
bile phase at 518 mm，the HPLC test data of 10 batches of samples are imported into the Chinese Pharmacopoeia
Committee“traditional Chinese medicine (TCM)fingerprint similarity evaluation system (2012A)”software for
processing，and then the ZC-01’s data named S1 as the reference chromatogram generate the control fingerprint．
The similarity of 10 batches of samples in comparison with S1 is above 0. 995，the relative retention time of each
batch of Arnebia euchroma(Ｒoyle)Johnstfingerprint common peaks is basically the same，and the ＲSD(n = 6)is
less than 1% ． Due to the different origin of the samples，there are some differences of samples in their relative
peak areas and peak area percentages． Total peak area is more than 95% for these samples，and each samples fin-
gerprint similarity is larger than 0. 995． Considering the complexity of mass production，fingerprint similarity of
Arnebia euchroma(Ｒoyle)Johnst should be higher than 0. 990．
Key words:hydroxyl naphthoquinone;Arnebia euchroma(Ｒoyle)Johnst;fingerprint;ＲP-HPLC
(责任编辑 周雪莹)
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