全 文 ：·40· Chinese Journal of Information on TCM May 2011 Vol.18 No.5
新疆紫草羟基萘醌类成分
对炎症细胞因子的抑制作用
魏星 1,赵海青 1,邵萌 2,范华英 1,刘生生 2,刘珂 1,2
(1.烟台大学药学院,山东 烟台 264005；2.山东靶点药物研究有限公司,山东 烟台 264006)
摘要：目的 研究新疆紫草羟基萘醌化合物对炎症细胞因子的抑制作用。方法 采用酶联免疫法测定新疆紫草
羟基萘醌化合物对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7 释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β
(IL-1β)等炎症细胞因子的抑制作用。采用 Griess 法测定分离纯化的 6 种不同羟基萘醌化合物(紫草素、去氧紫草
素、乙酰紫草素、β’β-二甲基丙烯酰紫草素、α-甲基丁酰紫草素、异丁酰紫草素)对 LPS 诱导的小鼠腹腔巨噬细
胞 RAW264.7 释放炎症细胞因子一氧化氮(NO)的抑制作用。结果 新疆紫草羟基萘醌化合物对 LPS 诱导的小鼠腹腔巨
噬细胞 RAW264.7 释放 TNF-α和 IL-1β具有抑制作用；6 种紫草羟基萘醌化合物对 LPS 诱导的小鼠腹腔巨噬细胞
RAW264.7 释放 NO 具有抑制作用。结论 新疆紫草羟基萘醌成分对炎症细胞因子均有不同程度的抑制作用,为进一步
研发以炎症因子 TNF-α抑制剂为靶向的类风湿关节炎治疗药物提供了一定的理论依据。
关键词：新疆紫草；羟基萘醌化合物；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β；一氧化氮
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2011.05.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2011)05-0040-02
Effects of Hydroxynaphthoquinone Derivatives from Arnebia euchroma on Modulation of Pro-
inflomatory Cytokines WEI Xing1, ZHAO Hai-qing1, SHAO Meng2, FAN Hua-ying1, LIU Sheng-sheng2, LIU Ke1,2
(1.School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China；2.Shandong Target Drugs Co., Ltd., Yantai 264006, China)
Abstract：Objective To investigate the effects of hydroxynaphthoquinone derivatives from Arnebia euchroma
on modulation of pro-inflomatory cytokines. Method The effects of hydroxynaphthoquinone extractives from
Arnebia euchroma on modulation of pro-inflomatory cytokines TNF-α and IL-1β induced by LPS in RAW264.7
cells were checked by ELISA method. The effects of six different hydroxynaphthoquinone derivatives from
Arnebia euchroma on modulation of pro-inflomatory cytokine NO induced by LPS in RAW264.7 cells were
checked by Griess method. Result The effects of hydroxynaphthoquinone extractives from Arnebia euchroma
on modulation of pro-inflomatory cytokines TNF-α and IL-1β were checked. Six hydroxynaphthoquinones
were isolated and identified as：alkannin, deoxyalkannin, acetylalkannin, β’ β-dimethylacrylalkannin,
α-methybutyrylalkannin, isobutyrylalkannin. Their biological activities of the modulation of pro-inflomatory
cytokine NO were checked. Conclusion The hydroxynaphthoquinone extractives from Arnebia euchroma has
effect of modulation on different pro-inflomatory cytokines, which provide support to develop new drug to
cure rheumatoid arthritis with pro-inflomatory cytokine TNF-α inhibitor as target.
Key words：Arnebia euchroma；hydroxynaphthoquinone；TNF-α；IL-1β；NO
2005 年版《中华人民共和国药典》(一部)收载的紫草为
紫草科植物新疆紫草 Arnebia euchroma (Royle)Johnst.和内
蒙古紫草 Arnebia guttata Bunge 的根,其具有凉血活血、解
毒透疹之功能,用于血热毒盛,斑疹紫黑,麻疹不透,疮疡,湿疹,
水火烫伤[1]。近 30 年的研究表明,紫草及其衍生物和他们的天
然来源植株的根提取物具有治疗创伤愈合、抗肿瘤、抗菌、抗
炎和抗凝血的生物特性[2]。本研究从新疆紫草中提取羟基萘醌
物质,并分离纯化得到 6 个化合物,分别为紫草素、去氧紫草
素、乙酰紫草素、β’β-二甲基丙烯酰紫草素、α-甲基丁酰
紫草素、异丁酰紫草素。本实验力求验证紫草中羟基萘醌化合
物体外抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞 RAW264.7 释放
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和一氧化
碳(NO)等炎症细胞因子的作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 培养基、试剂及药物
RPMI1640 培养基、DMEM 高糖培养基(GenMed Scientifics
Inc.USA)；胎牛血清(Gibco)；青霉素-链霉素溶液(双抗,碧云
天生物技术研究所)；胰蛋白酶、噻唑兰(Amresco Inc.)；台盼
蓝(Sigma Inc.)；DMSO(碧云天生物技术研究所)；萘乙二胺盐
酸盐、磺胺(国药集团试剂厂)；亚硝酸钠(天津市瑞金特化学品
有限公司)；TNF-α ELISA 试剂盒、IL-1βELISA 试剂盒(南京
建成生物工程研究所)。新疆紫草羟基总萘醌及羟基萘醌化合物
单体为自制,以二甲基亚砜(DMSO)溶解,稀释至不同浓度备用。
1.2 细胞培养
小鼠巨噬细胞(RAW264.7)购自中国科学院上海细胞库(ATCC,
TIB-71)细胞株 RAW264.7 使用含 10%胎牛血清、100 µg/mL 链
2011 年 5 月第 18 卷第 5期 中国中医药信息杂志 ·41·
霉素及 100 U/mL 青霉素的 RPMI 1640 培养液,于 37 ℃、CO2
培养箱中常规培养,隔日传代,对于贴壁生长的 RAW264.7 细胞
株传代时使用 0.25%的胰蛋白酶消化。待细胞处于对数生长期
时进行实验。
1.3 新疆紫草总羟基萘醌对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞肿瘤坏
死因子-α和白细胞介素-1β的影响
取对数生长期的 RAW264.7 细胞,调整细胞密度为 5×
105 cells/mL,将细胞悬液加入到 96 孔培养板中(200 µL/孔),
放入 CO2培养箱中培养1 h后,加入 LPS(终浓度为1 µg/mL)和不
同浓度的紫草总羟基萘醌(终浓度为 0.15、0.30、0.60、1.20、
2.40 µg/mL),加药完成后,将 96 孔培养板放入 CO2培养箱中培
养 6 h,取细胞上清,按照 TNF-α和 IL-1β ELISA 试剂盒说明
书测定细胞上清液中 TNF-α和 IL-1β的活性。
1.4 羟基萘醌化合物对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞一氧化氮
的影响
取对数生长期的 RAW264.7 细胞,调整细胞密度为 5×
105 cells/mL,将细胞悬液加入到 96 孔培养板中(200 µL/孔),
放入 CO2培养箱中培养 1 h 后,加入 LPS(终浓度为 1 µg/mL)和
不同浓度的羟基萘醌化合物(终浓度为 0.1、0.3、1.0、3.0、
10.0 µmol/L),加药完成后,置 37 ℃培养箱中培养 24 h 后,吸
取培养液上清 100 µL 至酶标板中,加入等体积的 Griess 试剂
(Griess 试剂 A：1 g/L 的 N-萘乙二胺盐酸盐；Griess 试剂 B：
体积分数φ(H3PO4)＝5%,10 g/L 对氨基苯磺酰胺。使用前等体
积混合试剂 A 和 B,室温反应 5 min 后测定 540 nm 的吸光值。
绘制NaNO2标准曲线,根据标准曲线计算细胞培养上清液中NO2-
的浓度以及对 NO 释放的抑制率。
1.5 统计学方法
数据以—x±s 表示,组间比较采用 t检验,P＜0.05 认为具有
统计学意义。
2 结果
2.1 对肿瘤坏死因子-α的抑制作用
对于 RAW264.7 细胞,经过 1 µg/mL 的 LPS 刺激 6 h 后,细
胞均释放出大量的 TNF-α,与空白组比较差异有统计学意义
(P＜0.01)。不同浓度的新疆紫草总羟基萘醌可以明显抑制
LPS 诱导的巨噬细胞释放 TNF-α,并呈现良好的剂量依赖关系,
IC50为 0.58 µg/mL。见表 1。
表 1 各组对 LPS 诱导的小鼠巨噬细胞分泌 TNF-α抑制作用比较(—x±s)
组别 浓度(µg/mL) TNF-α(pg/mL) 抑制率(%)
空白组 0 80.8± 0.7
LPS 组 0 1 264.3±103.0##
LPS＋紫草总羟基萘醌组 0.15 994.9± 10.8 13.2
0.30 870.1± 20.6 30.1
0.60 671.7± 22.9 48.0
1.20 447.1± 34.9** 57.5
2.40 302.3± 19.2*** 94.4
注：与空白组比较,##P＜0.01,###P＜0.001；与LPS组比较,**P＜0.01,
***P＜0.001(下同)
2.2 对白细胞介素-1β的抑制作用
1 µg/mL 的 LPS 可以刺激 RAW264.7 细胞释放出大量的
IL-1β,与空白组比较差异有统计学意义,P＜0.001。不同
浓度的总羟基萘醌可以明显抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞
释放 IL-1β,并呈现良好的剂量依赖关系,P＜0.01。IC50 值
为 0.63 µg/mL。见表 2。
表 2 各组对 LPS 诱导的小鼠巨噬细胞分泌 IL-1β抑制作用比较(—x±s)
组别 浓度(µg/mL) IL-1β(pg/mL) 抑制率(%)
空白组 0 12.9± 0.1
LPS 组 0 801.8± 1.5###
LPS＋紫草总羟基萘醌组 0.15 719.2±36.1 17.5
0.30 662.5±51.2 28.4
0.60 470.0±72.0 42.6
1.20 440.4±44.8 64.0
2.40 247.6±48.4 87.3
2.3 对一氧化氮的抑制作用比较
通过抑制炎症因子 NO 的释放可以明显看出,不同的羟基
萘醌化合物都具有较好的抑制作用,11-位上酯基的改变对前
炎症细胞因子拮抗的影响不大,而β’β-二甲基丙烯酰紫草素
的 IC50值达到 0.27 µg/mL,说明其具有相对于其他羟基萘醌化
合物有较好的抑制活性。见表 3。
表 3 6 种羟基萘醌成分对 LPS 诱导的小鼠巨噬细胞分泌 NO 抑制作用比较
NO 抑制率(%)
样品
0.1 µmol/L 0.3 µmol/L 1.0 µmol/L 3.0 µmol/L 10.0 µmol/L
IC50
(µg/mL)
去氧紫草素 14.74 13.87 22.40 41.37 92.01 0.50
乙酰紫草素 8.69 15.79 23.02 58.03 86.56 0.63
紫草素 13.92 18.13 22.52 48.34 92.66 0.45
β’β-二甲基丙烯酰紫草素 20.69 26.61 39.61 84.92 91.07 0.27
α-甲基丁酰紫草素 10.40 22.56 37.83 74.71 87.17 0.44
异丁酰紫草素 8.08 15.47 32.18 72.38 89.75 0.51
3 讨论
一般说来,炎症过程是机体在受到内毒素刺激后产生炎症
性细胞因子,并由炎症性细胞因子进一步引发的一系列反应过
程。前炎症因子为炎症信号传导通路的源头,也是内毒素诱导的
炎症反应的初级因子。内毒素主要通过促使巨噬细胞、内皮细
胞、中性粒细胞等释放大量的炎症细胞因子,这些炎症性细胞因
子通过自分泌、旁分泌相互联系、相互影响,使病变得以发展。
TNF-α是一种促炎性细胞因子,在免疫反应、炎症和对损
伤反应中起重要作用,其主要影响细胞增殖和细胞凋亡的调
节,并与其他细胞因子一起形成复杂的免疫网络。紫草素和异
丁酰紫草素对 TNF-α启动因子激活作用的抑制作用呈剂量
依赖性。 (下转第 110 页)
·110· Chinese Journal of Information on TCM May 2011 Vol.18 No.5

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(收稿日期：2010-07-19,编辑：梅智胜)

(上接第 41 页) 台北学者 Chiu SC[3]等发现,紫草素可以
选择性阻滞TNF-α启动子的激活并且抑制TNF-αmRNA表达,
从而抑制 TNF-α的产生。Staniforth[4]等也发现,紫草中的
紫草羟基萘醌化合物(紫草素、乙酰紫草素、异丁酰紫草素、
β’β-二甲基丙烯酰紫草素、异戊酰紫草素),可以显著的阻滞
TNF-α前启动因子的活化,并呈剂量相关性,并证明紫草素及
其衍生物可以抑制人 TNF-α mRNA 的表达。本实验结果表明,
未经 LPS 诱导前,空白组 TNF-α浓度很低,经过 LPS 诱导之
后,TNF-α浓度显著升高,给药后,新疆紫草羟基萘醌提取物与
LPS 组之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。故可以得出结
论,紫草羟基萘醌提取物对 LPS 诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7
分泌的炎症因子 TNF-α和 IL-1β具有抑制作用,并呈剂量依
赖性。而通过抑制炎症因子 NO 释放的实验可以明显看出,不同
的新疆紫草羟基萘醌化合物都具有较好的抑制作用,11-位上酯
基的改变对前炎症细胞因子拮抗的影响不大。而β’β-二甲基丙
烯酰紫草素的IC50达到0.27 µg/mL,说明其具有相对于其化合物
有较好的抑制活性。
通过体外抗炎实验,验证了紫草羟基萘醌提取物和紫草羟
基萘醌化合物单体均可抑制炎症因子 TNF-α、IL-1β和 NO 的
释放,而前炎症细胞因子拮抗对慢性炎症和自身免疫疾病有重
要的治疗价值。为进一步研发以 TNF-α抑制剂为靶向的类风
湿关节炎治疗药物提供了一定的理论依据。
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(收稿日期：2010-04-08,编辑：华强)