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,华肿瘤杂志 2 0 6 年 12 i)J 第 2 8 卷第 12 期 C h i n J O n e o l , D e e e mb e : 2 0 6 , v ol 2 8 , N o . 12
· 基础研究
复方藤梨根制剂对荷人肺巨细胞癌裸鼠移植瘤生长及
C x4 3 基因表达水平的影响
杨维私 郭勇 姚庆华 戴伟春
【主题词】 复方藤梨根制剂 ; 肺癌细胞 ; 间隙连接蛋白 c x4 3
[ S u bj ec t w o r ds l 几F a n g eT n g L云G e n M ix t u r e ; 玩 n g e a n e e r e e ll ; C o n n e x in 43
细 胞 间 隙 连 接 通 讯 ( g a p j u , l e t i o n i n t e r e e l lu l ar
co ~ un
ic at io n
,
GJ CI )是细胞间的一种重要连接方式 , 在细胞
分化 、生长控制和维持体内环境平衡等方而起取要作用 。 近
年来研究表明 , 肿瘤和转化细胞中普遍存在 cJ CI 的缺陷 ,
GJ CI 在肿瘤的发生及转移过程中有着极为重要的作用 。 间
隙连接蛋白是由许多同源性基因编码的多基因家族 , 它们的
表达和分布异常与肿瘤的形成关系密切 。 在最近的一些实
验中 , 人们把野生型连接蛋白( c o l l ne xj n , C x )基因转染到肿瘤
细胞中 , 可见肿瘤的生长受到明显抑制 ,间隙连接通讯功能
上调 , 细胞恢复正常生长 ,认为连接蛋白基因是一类肿瘤抑
制基因家族〔’ 了。 c x4 3 是一种主要的细胞问隙连接蛋白 , 在
多种肿瘤细胞中都有 C x4 3 表达的下降 。 为此 ,许多学者正
在研究上调 C x4 3 表达的药物 , 以此来实现其抑制肿瘤生长 、
分化 、 转移等作用 。 目前 , 对环磷酸腺昔 ( 。 AM P ) 、 维甲酸 、 p -
胡萝 卜素上调 C x4 3 表达的研究较多 , 中药提取物如姜黄素
类似物 、茶多酚等上调 Cx4 3 表达的研究已有报道 。 我们在
体内观察复方藤梨根制剂 ( F畔 LG )对荷人肺巨细胞癌 ( PC )
裸鼠移植瘤的生长和瘤体组织 C x4 3 表达的影响 ,并进一步
探讨其作用机制。
一 、 材料与方法
1
. 试剂与药物 : R PM I一 164 0 细胞培养基 、 0 . 01 m 。护 L P B S
( p H 7
.
2 一 7 . 4) 和 0 . 25 % 的胰蛋白酶均为美国 S ig m a 公司产
品 , 10 % 灭活小牛血清为上海华美生物工程公司产品 ; 兔抗
人 c x4 3 m bA 和 AB c 试剂盒 均为美 国 z y m ed 公 司产品 。
比 CI A 显微摄影 D M I R B倒置显微镜为德国 I J EI C A 公司产
口口口 。
F FTL G 由党参 、获等 、 白术 、 藤梨根 、 水杨梅根等纯 中药
材组成 ,浙江中医学院制剂室提供 ,短毫升含生药 1 90
2
. 细胞来源及培养 : 高转移性人肺癌细胞株 ( P G ) 由浙
江省肿瘤研究所提供 ,在含 or % 灭活小牛血清的 R PMJ 一 164 0
培养液内培养并传代。
3
. 实验动物 : 6 周龄健康雄 J性 BAI B/ c 一 n叮 n u 裸小鼠 28
只 ,体重 ( 20 士 2) 9 。 由中科院 _ L海实验动物中心提供 ,在
SP F 条件下饲养。
作者单位 : 31 以刃6 杭州 , 浙江中医药大学附属第 一 氏院肿痛科
通讯作者 : 郭勇 , E 一m a i l : 群k@ m a i l一 12 . zj . 。 ; 1
4
. 瘤株复苏及传代 : 从细胞库中取出 P G 冷冻细胞 ,
37 ℃下溶解 ,将细胞悬液加人 s ml 培养基内 , 10 0 r/ m in 离
心 7 m in , 弃上清液 ,将细胞置于 RP M I一 164 0 培养基中 ,接种
于 T一25 培养瓶 。 在 5% C O : 培养箱内进行培养并传代 ;待细
胞 长满瓶后 ,弃培养基 , 用 0 . 25 % 胰蛋白酶消化 ; 当细胞变
圆 , 间距变大时 , 用含小牛血清的培养基终止消化 ,离心洗
涤 ,按 l 传 2 一 3 瓶比例接种备用 。
5
.
P G 荷瘤裸鼠模型的建立 : 台盼蓝染色 , 经细胞计数器
计数及计算活细胞比率后 , 收集浓度为 2 x 10 6 /血 细胞悬液
6 ml
。 每只裸鼠右前肢腋背部皮下注射 0 . 2 而 细胞悬液 ,
SP F 条件下饲养 , 所有饮用水、 饲料及笼具均经无菌消毒处
理 。
6
. 实验分组及给药 :将造模后裸鼠编号 ,按随机数字表
分为 4 组 ,每组 7 只 。 ( l) 空白对照组 :生理盐水 0 . 6 n l l / 20 m g
灌胃。 ( 2 ) F FT cL 低剂量组 : FF r LG 0 . 2 以 十 0 . 4 inl N S/ 20 mg
灌胃。 ( 3) F P r LG 中剂量组 : F门飞G 0 . 4 而 + 0 · Z inl N S / ZO mg
灌胃 。 ( 4) F FT LG 高剂量组 : F盯L G O . 6 n让/ 2 0 mg 灌胃。 造
模后第 2 天起灌 胃 , 每天 1 次 , 连续 21 d 。 全部裸鼠末次灌
药后第 2 天断颈处死 ,完整取出肿瘤 ,称重后 10 % 甲醛固定。
7
. 观察指标及方法 :接种后观察肿瘤移植成功率、 生长
潜伏期 、动物进食与活动度 、排泄物等 。 末次给药后第二天
将裸鼠断颈处死 , 剥离瘤体后称重 ( 平 ) ,计算抑瘤率 ( I ) 。
l( % )
二
(对照组 W 一治疗组 W ) /对照组 W x l o % 。
8
. 肿瘤组织 C x4 3 表达的检测 :瘤体取下后经 10 % 甲醛
固定 、 梯度酒精脱水 、 石蜡包埋后 ,行 C x4 3 单抗的免疫组化
染色 。 将切片常规脱蜡至水 ,用 P B S 液 (0 . ol m心L , p7H . 4)
冲洗 3 次 x s m s n 。 30% H Z o : l 份 + 蒸馏水 10 份混合 ,室温
10 m in 以灭活内源性酶。 热修复抗原 , 将切片浸人 0 . 01
m o F I
」
p B S ( p H 6
.
0 )
, 电炉加热至沸腾后断电 , 间隔 5 m in 重
复 , 反复 2 次 ,冷却后 p B S ( pH 7 . 2 一 7 . 6 )洗涤 2 次 。 滴加
10 % 的正常山羊血清封闭液 , 室温 30 m in 。 甩去多余液体 ,
不洗。 滴加 1: 50 比例稀释的 C x4 3 单克隆抗体 , 37 ℃孵育
l h
。
BP S 液冲洗 3 次 x 5 m in ,滴加生物素标记二抗工作液
( l
: 100 )
,
37℃孵育 30 m i n 。 再用 P B S 液冲洗 3 次 x s 而 n ,
滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 , 37 ℃孵育 10 m i。 。 DA B
显色 ,蒸馏水洗涤 ;苏木素轻度复染 ;脱水 ,透明 ,封片。 显微
镜观察 。
中华肿瘤杂志 2 06 0年 12 月第 2 8 卷第 21 期 C hi n JO n e ol , D e e e m b e r 2 0 0 6 , V o l 2 8 , N o . 12
9
.
c x4 3 的免疫组化判断 : c x4 3 蛋白呈现棕黄色颗粒分
布于相邻癌细胞之间的胞膜上 。 根据染色强度和范围 ,当 >
10 % 的癌细胞为阳性时 , 则认为该标本为阳性 , 否则为阴性 。
10
, 统计学分析 :上述每个实验均重复 3 次 ,用 s P S 9 . 0
软件包进行 t 检验 。
二 、结果
1
. 一般状况观察 : 裸鼠接种后第 7 天 , 空白对照组有
1只裸鼠右腋背部首先长出肿瘤结节 ,随后 3 d 内各用药组
裸鼠均长出肿瘤结节 。 空白对照组瘤体生长较快 , F F T LG 高
剂量组生长最慢 , 瘤体出现相对较晚 。 在后期 , 空白对照组
裸鼠较为消瘦 。 在饮食 、 活动方面 ,各组无明显差异 。
2
.
F T L G 对人肺 巨细胞癌的抑制作用 : F FT L G 的 3 个
剂量组对 P G 荷瘤裸鼠实体瘤均有抑制作用 ,其中 F F T LG 高
剂量组抑瘤率为 3 . 6% , 中剂量组为 27 . 6 % , 低剂量组为
25
.
6 %
。
F脚 LG 低剂量组和中剂量组与空 白对照组 比较 ,
差异有统计学意义 (尸 < 0 . 05 ) 。 F FT L G 高剂量组与空 白对
照组比较 ,差异有统计学意义 (尸 < 0 . 01 ) 。 F F T LG 抑瘤率似
呈剂量依赖性 。
3
.
F F T瑞 对 P G 荷瘤组织 Cx4 3 表达的影响 : Cx4 3 主要
在间质和肿瘤细胞膜上表达 ,少数胞浆着色 , 略呈细颗粒状 ,
着色普遍较强 。 高剂量组表达最多 , 空 白对照组几乎不表
达 。 FFT L G 的 3 个剂量组阳性例数均大于空白对照组 ,其中
F FT L G 低剂量组的 c x4 3 表达阳性率为 6 . 7% , 空白对照组
的 C x4 3 表达 阳性率为 28 6% , 差异有统计学意义 ( 尸 <
0
.
05 ) ; 中剂量组的 c x4 3 表达阳性率为 83 . 3% ,高剂量组的
c x4 3 表达阳性率为 85 . 7% , 与空白对照组比较 ,差异有统计
学意义 (尸 < 0 . 01 ) 。 提示 FF T L G 可上调 P G 荷瘤组织细胞
c x4 3 的表达量 , F F TL G 高剂量组更明显 。
三 、 讨论
GJ CI 是多细胞生物体内普遍存在的一种通讯方式 ,是细
胞群内信号传递的主要途径 。 它能够传输生长调控信号 ,调
节细胞的增殖与分化 , 在肿瘤的发生 、 发展和组织 自身稳定
的维持中具有重要作用 。 近几年来 , 国内外对 GJ CI 与癌变
的关系进行了大量的研究 ,发现多数肿瘤细胞无 GJ CI 功能 ,
其间隙连接 ( GJ )少或无 , 而邻近的正常组织或良比肿瘤的间
隙连接正常。 少数肿瘤细胞有脆弱的连接通讯 ,但很容易受
到破坏 ,其间隙连接数量很少 。 oT m ia 等图 用电传导法观察
人肺癌细胞株中 GJ CI 功能 ,结果显示 , 17 个肺癌细胞株中仅
有 2 个存在广泛的 GJ CI 功能 , 16 例新鲜肺癌组织中没有显
示 GJ CI 功能 , 而从同样肺癌组织 中分离的纤维细胞却存在
着广泛的 GJ cI 功能 。 GJ cI 在肿瘤的发生过程中有着极为重
要的作用 。
GJ 的结构单位是连接子 ( 。 on n xoe n) , 每个连接子又由
6 个蛋白亚单位即 xC 聚集而成 ,故间隙连接蛋 白是 GJ 基本
结构单位 。 xC 基因的表达与间隙连接通讯功能的相关性 已
被大量研究证实。 w iz一e e k e 等 [ 3 〕将鼠 e x犯 或 e料 3 m RN A 注
射进蟾蛛的卵母细胞内 , 两个相连的卵母细胞电偶联的强度
明显增加 ;将 C x3 2 和 C x4 3 分别注射进两个不同的卵母细胞
内 ,发现二者也能够形成功能性细胞间隙连接通道 ( C x3 2/
Cx4 3 )
。 以上研究结果提示 , xC 基因表达升高能够直接促进
组装功能性的间隙连接 , xC 基因的表达与 Gj CI 具有相关性 。
有研究显示 ,把 xC 基因转染到肿瘤细胞中 , 可见肿瘤的生长
受到明显的抑制 , GJ CI 功能上调 , 细胞恢复正常生长 。 某些
xC 基因 ( C x2 6 、 Cx4 3 和 C x3 2 ) 可能具有抑制肿瘤生长的特
点 ,所以 xC 基因被认为是一类肿瘤抑制基因家族 。 C x4 3 表
达减少或缺失与多种肿瘤的发生 、 发展及转移密切相关 ,许
多肿瘤细胞如肾上腺皮质瘤 、 肺癌 、 乳腺癌 、 神经胶质瘤 、 肝
癌 、 胃癌等均显示 c x4 3 表达减少或缺失川 。
经过长期 、大量的临床实践证实 , F T L G 对多种恶性肿
瘤有较好的疗效 。 细胞学 、 免疫学 、 分子生物学等前期研究
表明 , F rF L G 具有控制原发性肿瘤的生长 、控制肿瘤的远处
转移及广泛的免疫调控作用团 , 可逆转肿瘤细胞多药耐药
性 ,保护 DN A 损伤 ,促进 D NA 损伤修复 , 对化疗药物有减毒
增效作用 。 本实验结果显示 , F FT L G 各组抑瘤率均在 25 % 以
上 , 中 、 低剂 量 组 与 空 白对 照 组 差 异 有 统 计学 意 义
(尸 < 0
.
0 5 )
,高剂量组与空白对照组差异有统计学意义 (尸 <
0
.
01 )
,说明 F FT L G 有明显的抑瘤作用 。 C x4 3 染色定位于细
胞浆和细胞膜上 , 3 个 FF T L G 组的 C x4 3 表达普遍较强 , 而空
白对照组表达最少 ,表明未经用药的人肺巨细胞癌间隙连接
通讯最弱 。 F FTGL 各组的 C x4 3 表达均有增高 ,中 、 高剂量组
的 C x4 3 表达显著高于空 白对照组 (尸 < 0 . 01 ) ,提示 F T L G
能上调 P G 细胞 C x4 3 的表达量 。 由此说明 , F盯 LG 的抗肿瘤
作用与其调节 C x4 3 表达水平有关 , 通过上调肿瘤细胞 c x4 3
基因的表达 ,恢复肿瘤细胞的 GJ CI 功能 ,从而调控肿瘤细胞
的增殖分化和代谢等功能 。
我们初步探讨了 F F T LG 对 P G 荷瘤裸鼠肿瘤组织的生
长及肿瘤细胞 Cx4 3 基因表达水平的影响 , 显示间隙 Cx 是
F F TL G 抗肿瘤的作用靶点之一 ,但其作用的具体机制尚待进
一步深人研究 。
参 考 文 献
1 Y a m a d砍 i H , K rt d o v s k ih V , M e s n i l M , et al . oR le of e o n xnel
n
( g即
ju n e ti o n ) g
e n e s i n e e ll g or wt h o o n t or l
a n d e a cr i n o g e n e s i s
.
C R Ae a d
S e i l
,
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,
32 2 : 1 5 1
一
1 5 9
.
2 T o m a i E
,
B or w n el H
,
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s e u T
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.
Ga p j u n e t i o n fu n e t i o n a n d
e a n e e r
.
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R e s
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,
5 3 : 3 4 75召 4 85 .
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D祝 E , et 吐 . r r he di刃 e面 yt of c一 nge n e s e n e o d i n g g a l l ju n e it on al Port e i n s . E u r J Cel B i o l , 1卯 l , 56 : l 一 7 -
4 M u l l 习 , S A
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D a v i s K
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.
A lp h a l
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u n c t i o n s ar e de e re a s e d i n h u m a n a dr e n o e o rt i e a l t u m o r s
.
J C li n
E n do e ir n d M e t a b
,
2 0 0 0
,
8 5 : 8 9 0
一
8 9 5
.
5 马向东 ,隋延仿 , 王文亮 ,等 . 肝癌细胞及正常肝细胞中间隙连接
蛋白 Cx3 2 、 Cx4 3 的表达 . 中国癌症杂志 , 2 0 0 , 10 : 1一
(收稿 日期 : 2 00 6一 2一 2 8 )