全 文 ：份，每份 100 g，在 60℃加 12 倍量水温浸 3 次，每次 30 min，合并
提取液，上已处理好的 WLD型大孔吸附树脂柱(径高∶ 径宽 = 4
∶ 1)，用药材量 1 倍的树脂吸附，树脂量 3 倍的 70%乙醇洗脱，
收集洗脱液，用旋转薄膜蒸发器(温度控制在 60℃左右)回收，收
集浓缩液，取十分之一于 100 ml 量瓶并定容至刻度，分别按
“2． 1”项中方法制备供试品溶液，测定含量。结果见表 7。
表 7 延胡索水提取最佳工艺条件验证结果
试验号 药材量 / g 延胡索乙素量 /mg
1 100 55． 04
2 100 57． 62
3 100 56． 14
实验结果表明，优选的延胡索提取纯化工艺效果好，成本低、
稳定可行。
3 讨论
随着延胡索现代药理研究的不断深入，其在临床的应用也越
来越广泛，如何最大化的提取并保留延胡索的有效成分显得尤为
重要，本实验得出的延胡索有效成分最佳提取纯化工艺能高效提
取出延胡索中有效成分并能避免热敏性成分延胡索乙素的破坏，
为延胡索药用价值的最大化利用提供了参考。
在延胡索纯化工艺研究中，前期已作了大量的试验，对树脂
种类作了 NKA －9、AB － 8、D101、WLD 等的筛选;对洗脱剂的种
类、浓度也作了筛选，同时作了树脂饱和吸附率的测定、树脂漏泄
率等的测定，本实验所选的因素及水平数均是在前期实验的基础
上提出的。
在延胡索乙素含量测定中，由于样品经大孔吸附树脂纯化，
供试品溶液只需经微孔滤膜滤过，取续滤液直接注入高效色谱仪
测定，简化了样品处理过程，测定效果较佳，这也为其它有关延胡
索中延胡索乙索的含量测定提供了一定的方法参考。
参考文献:
［1］ 黄泰康．常用中药成分与药理手册［M］．北京:中国医药科技出版
社，1994:874．
［2］ 北京医学院．中草药成分化学［M］． 北京:人民卫生出版社，1984:
129．
［3］ 国家药典员会．中国药典，一部［S］． 北京:化学工业出版社，2005:
94．
收稿日期:2013-03-26; 修订日期:2013-10-16
基金项目:国家自然科学基金( No． 81102350) ;云南省教育厅重点项目( No． 2011Z049)
作者简介:张 桢( 1976-) ，男( 彝族) ，云南凤庆人，昆明医科大学附属儿童医院副教授，硕士学位，主要从事抗病毒天然药物有效成分分离与分析和
血药浓度研究工作．
华山松松塔体外抗 HIV活性的研究
张 桢1，3，李春艳3，郑永唐2，刘光明3
(1．昆明医科大学附属儿童医院 /昆明市儿童医院检验科中心实验室，云南 昆明 650028;
2．中国科学院昆明动物研究所 /云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室，云南 昆明 650223;
3．大理学院药学院，云南 大理 671000)
摘要:目的 筛选和评价华山松松塔体外抗 HIV － 1 活性。方法 采用 MTT比色法检测华山松松塔的细胞毒性; 采用细
胞病变法检测 HIV － 1 感染和未感染细胞之间的融合;细胞病变法检测化合物对 HIV － 1 急性感染的抑制活性。结果 样
品Ⅰ －Ⅲ对 C8166 细胞毒性不大，CC50在 656． 18 ～ 744． 67μg /ml之间;Ⅰ －Ⅲ对 HIV － 1 诱导 C8166 细胞形成合胞体有较
强的抑制作用，EC50在 3． 59 ～ 9． 21μg /ml 之间。Ⅰ － Ⅲ对 HIV － 1 感染 MT － 4 细胞无保护作用，其治疗指数分别为
78． 47、114． 40、182． 78。结论 Ⅰ －Ⅲ具有体外抗 HIV － 1 活性，多糖含量分别为 64． 69%、67． 14%、71． 85%。
关键词:华山松; 提取物; 人类免疫缺陷病毒; 抗 HIV － 1 活性
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 01． 011
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 01-0025-02
In Vitro Anti －HIV Activities of Extracts from Pinus armandii Franch．
ZHANG Zhen1，3，LI Chun-yan3，ZHENG Yong-tang2，LIU Guang-ming3
( 1． Laboratory Center of Children＇s Hospital of Kunming and Kunming Medical University，Kunming 650028，
China; 2． Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of Chinese Academy of Sciences
and Yunnan Province，Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650223，China;
3． College of Pharmaceutical Sciences，Dali University，Dali，671000 China)
Abstract: Objective To screen and evaluate the in vitro anti － HIV － 1 activities of extracts from Pinus armandii Franch．Meth-
ods The cytotoxicities of extracts from Pinus armandii Franch． were tested by MTT assay． The fusion between of HIV － 1 infected
and uninfected cells was evaluated by CPE． The anti － HIV activities of extracts in acute infection were evaluated by cytopathogen-
ic effect ( CPE) assay． Ｒesults Ⅰ －Ⅲ were not significantly cytotoxic in several T lymphocytes cell lines with CC50 range 656．
18 ～ 744． 67μg /ml． Meantime ，Ⅰ －Ⅲ inhibited the cell － to － cell fusion in co － culture with EC50 of 3． 59 ～ 9． 21μg /ml． Ⅰ －
Ⅲ markedly inhibited syncytium formation with selective indexes of 78． 47，114． 40and 182． 78，respectively． Conclusion Ⅰ －
Ⅲ show potential anti － HIV － 1 activities and the contents of polysaccharides of Ⅰ －Ⅲ were 64． 69%，67． 14% and 71． 85% ．
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期
Key words: Pinus armandii Franch． ; Extracts; Human immunodeficiency virus; Anti － HIV － 1 activity
艾滋病(获得性免疫缺陷综合症，acquiredimmune deficiency
syndrome /AIDS)，其病原体为人免疫缺陷病毒(human immunod
eficiency virus，HIV)。HIV感染将导致机体免疫细胞功能衰退
和数量衰竭，增加各种恶性肿瘤发生或机会性感染，感染者最终
死亡，它严重威胁着人类的健康，阻碍社会和全球经济的发
展［1］。
松科松属植物全世界约 100 种，分布于北半球直达北极圈。
我国松科松属植物资源丰富，有 22 种，10 个变种，另引进 16 种，
又 2 个变种，合计 50 余种，分布极广［2］。但松属的松塔主要作为
农家燃料，药用开发很少。根据云南省医学信息研究所的调查报
告，国内未见松塔抗艾滋病的报导。目前，美国 FDA批准上市的
治疗 HIV的药物有 23 种，尽管它们对 HIV 有较强抑制作用，但
是存在毒副作用大，价格昂贵，易出现耐药性，作用环节单一［3］
等缺点。本研究对松科(Pinaceae)松属(Pinus)华山松 Pinus ar-
mandii Franch．多糖含量［4］大于 50%的松塔提取物进行体外抗
HIV － 1 活性研究。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 Elx800 酶标仪(Bio － Tek 公司);Nikon TS100 倒置显
微镜(Nikon公司);HW SY11 － K恒温水浴锅(北京市长仪仪表
公司);Termo － 3111 CO2 培养箱(Termo公司);Termo － A2 －
1287 二级生物安全柜(Termo 公司)，Hair － DW － 86L628 超低
温冰箱(海尔公司);DHG － 9075A 型电热恒温鼓风干燥箱(上
海一恒科技有限公司);FA2004N 电子天平(上海精密科学仪器
有限公司)。
1． 2 试剂与培养基 HEPES (N －2 (2 － Hydroxyothyl)piperazine
－ N＇－(2 － ethanesufonic acid)、MTT (3，(4，5 － dimethylthiazol － 2
－ yl) － 2，5 － diphenyl tetrazolium bromide)、DMF (N，N＇－ Dime-
thyl formamine)、青霉素(Penicillin)、硫酸链霉素(Streptomycin
sulfate)、谷氨酰胺(Glutamine)均购自 Sigma 公司;2 －巯基乙醇
(2 － Mercaptoethanol)为 Bio － Ｒad 公司产品。ＲPMI － 1640 和新
生小牛血清为 Gibco 公司产品。ＲPMI － 1640 完全培养基，含有
10 %新生小牛血清，2 mmol /L L －谷氨酰胺，10 mmol /L HEPES，
50 μmol /L 2 －巯基乙醇，100 000 IU青霉素，100μg /ml 链霉素。
1． 3 细胞和病毒 人 T 淋巴细胞系 C8166、MT － 4 以及 HIV － 1
实验株 HIV － 1IIIB均由英国 Medical Ｒesearch Council，AIDS Ｒe-
agent Project惠赠。所有细胞和病毒均以含 10%小牛血清的 ＲP-
MI － 1640 完全培养基进行培养。按常规方法制备 HIV － 1ⅢB，滴
定并计算出病毒的 TCID50。病毒贮存液分装后，置 － 70℃保存。
细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。
2 方法
2． 1 对 C8166 细胞的毒性实验 4 × 105 /ml C8166 细胞悬液
100μl与不同的待测药物溶液混合，设 3 个重复孔。同时设置不
含药物的对照孔，37℃，5% CO2 培养 3 天，采用 MTT 比色法检
测细胞毒性。ELx800 酶标仪测定 OD值，测定波长为 595 nm，参
考波长为 630 nm。计算得到 CC50值(50% Cytotoxic Concentra-
tion)，即对 50%的正常 T 淋巴细胞系 C8166 产生毒性时的药物
浓度［5］。
2． 2 HIV － 1 感染性滴定 HIV － 1ⅢB按 Johnson ＆ Byington
(1990)所述方法改良进行滴定，简述如下:将 HIV － 1 贮存液在
96 孔板上作 4 倍稀释，10 个梯度，每梯度 6 个重复孔，同时设置
对照孔 6 孔。每孔加入 C8166 细胞 50 μl，每孔终体积为 200 μl。
37℃，5% CO2 培养。第 3 天补加新鲜 ＲPMI － 1640 完全培养基
100μl，第 7 天在倒置显微镜下观察每孔中 HIV － 1 诱导的细胞病
变效应(Cytopathic Effect，CPE)，以每孔是否有合胞体(Syncyti-
um)的形成确定;按 Ｒeed＆Muench 方法计算病毒的 TCID50(50%
Tissue Culture Infection Dose)。
2． 3 对 HIV － 1ⅢB致细胞病变 CPE 的抑制实验 在被测物质存
在的条件下，用 HIV － 1 病毒感染正常的 C8166 或 MT2 细胞，进
行培养;3 天后在显微镜下观测 HIV － 1 感染的致细胞病变;计算
出被测物质对 HIV － 1 致细胞病变的抑制作用(EC50)
［6］。
2． 4 对 HIV － 1ⅢB感染 MT － 4 细胞死亡的保护实验 在被测物
质存在的条件下，用 HIV － 1 病毒感染正常的 C8166 或 MT4 细
胞，进行培养;6 ～ 7 天后用MTT方法测定感染细胞和正常细胞的
存活率;计算出被测物质对细胞的毒性作用(CC50)和对 HIV － 1
感染细胞的保护作用(EC50)。
3 结果
采用 CPE法及MTT比色法测定了细胞毒性作用及其体外抗
HIV － 1 活性。Ⅰ －Ⅲ的对 C8166 细胞的毒性均 ＞ 3μg /ml，对合
胞体形成均有较强抑制作用(见表 1)。治疗指数分别为 78． 47，
114． 40，182． 78，均对 HIV － 1 感染 MT －4 细胞无保护作用。
表 1 Ⅰ －Ⅲ对 C8166 细胞的毒性作用，对合胞体形成
的抑制作用和保护实验结果(珋x ± s)
样品
细胞毒性
CC50 /μg·ml － 1
抗 HIV －1ⅢB活性
EC50 /μg·ml － 1
治疗指数
(TI)
HIV －1 感染
MT －4
Ⅰ 722． 67 9． 21 78． 47 无保护作用
Ⅱ 660． 09 5． 77 114． 40 无保护作用
Ⅲ 656． 18 3． 59 182． 78 无保护作用
AZT 1497 0． 00151 991390
4 讨论
艾滋病的危害席卷全球，蔓延之势十分迅猛。据联合国艾滋
病规划署和世界卫生组织联合发布的艾滋病流行状况报告显示，
目前全球有大约 3340 万艾滋病感染者，200 万人死于与艾滋病
相关的疾病。而我国存活的艾滋病感染者和病人达 74 万人，这
将使中国的 GDP 未来 10 年累计减少 400 亿元收入。现有治疗
药物价格，昂贵。中国经济发展的现状决定，开发高效低毒、价廉
的抗 HIV药物是迫切需要的。
本实验为华山松松塔抗 HIV － 1 活性成分筛选及作用机制
的研究，提供了初步的理论依据，但提取物抑制 HIV 活性的确切
成分和机制有待于进一步深入研究。
致谢:感谢中国科学院和云南省动物模型与人类疾病机理重
点实验室郑永唐研究员及研究小组的帮助!
参考文献:
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分析［J］．时珍国医国药，2010，21(10):2435．
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 1