全 文 ：基于反溶剂冻干技术穗花杉双黄酮的制备和分析表征
任秋霞1，2，周 喆2，王升启2
［摘要］ 目的 采用反溶剂冻干法制备穗花杉双黄酮微粉，以解决该药水溶性差的问题，提高药物口服生物利用度。方
法 通过考察反溶剂冻干法反应溶剂与水的比例、药物溶液浓度、反应温度、搅拌速度和搅拌时间对颗粒粒径的影响，得到适
宜的微粉化条件。在此基础上分别利用激光粒度分析、扫描电镜、傅立叶转换红外光谱、粉末 X 线衍射和体外溶出实验对原
料药和微粉进行分析表征。结果 最佳处方制备的微粉颗粒粒径在 0. 08 μm 左右，冻干后样品为无定形。结论 本方法制
备的穗花杉双黄酮微粉溶解度和溶出速率显著提高，为改善药物的口服生物利用度提供了基础。
［关键词］ 穗花杉双黄酮;反溶剂冻干;微粉化
［中图分类号］ R943 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1674-0440(2013)02-0237-05
Preparation and analytical characterization of micronized
amentoflavone by antisolvent freeze-drying method
REN Qiu-xia1，2，ZHOU Zhe2，WANG Sheng-qi2
(1． Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China;2． Department of Biotechnology，
Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medicine Sciences，Beijing 100850，China)
［Abstract］ Objective The micronized amentoflavone was prepared by the anti-solvent freeze-drying method in order to im-
prove water solubility of the drug． Methods The effects of the proportion of the reaction solvent with water，drug concentration，preci-
pition temperature，stirring rate，and stirring time on particle sizes were investigated，and the optimum conditions were obtained． The
microsized amentoflavone and the raw amentoflavone were well characterized by laser particle size analyzer，scanning electron microsco-
py，Fourier transform infrared spectrometry，powder X-ray diffraction and the in vitro dissolution experiment． Results The particle
size of the optimal formulation was around 0. 08 μm，and the microsized amentoflavone was amorphous after freeze-drying． Conclusion
The solubility and dissolution rate of the amentoflavone was significantly increased after micronization，which provides a basis for impro-
ving the oral bioavailability．
［Key words］ amentoflavone;anti-solvent freeze drying;micronization
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81172981)
作者简介:任秋霞，女，在读硕士研究生，研究方向:药物分析学，Tel:010-66931422，E-mail:ren_qiuxia@ 126． com
作者单位:1． 300193 天津，天津中医药大学(任秋霞) ;2． 100850 北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所(任秋霞，周 喆，王升启)
通讯作者:王升启，男，研究员，博士生导师，研究方向:中药现代化，Tel:010-66932211，E-mail:sqwang@ nic． bmi． ac． cn
穗花杉双黄酮是卷柏中的一种有效成分。它具
有抗肿瘤［1］、抗病毒［2］、抑菌抗炎［3］、抗氧化［4］、舒
张血管［5］和保护神经［6］等多种药理活性，在化妆
品、保健品和医药领域有着广阔的前景。由于其由
两分子的芹菜素组成，在空间上为平板结构(图 1) ，
分子堆砌紧密;而且在 4，4，5，5″，7，7″位有 6 个酚
羟基，可形成分子间氢键。因此，晶格的排列和氢键
的形成使得穗花杉双黄酮的分子间作用力增大，造
成脂溶性和水溶性均较差，从而限制了药物吸收并
降低了其口服生物利用度［7］。
根据 Noyes-Whitney方程，药物的溶出速率与药
物颗粒的表面积成正比。因此，通过将药物微粉化，
减小药物粒径，增大其比表面积，可以有效提高药物
的溶解速率和生物利用度［8］。目前，常用的药物微
图 1 穗花杉双黄酮结构式
Fig． 1 Molecular structure of amentoflavone
·732·国际药学研究杂志 2013 年 4 月 第 40 卷 第 2 期 J Int Pharm Res，Vol． 40，No． 2，April，2013
DOI:10.13220/j.cnki.jipr.2013.02.009
粉化技术包括球磨法、低温气流粉碎法［9］、高压均
质［10］等机械粉碎方法，以及超临界流体技术［11］、微
乳模板和液相沉淀［12］等物理化学方法。机械粉碎
方法容易造成药物损失，引进杂质造成污染，且加工
产品颗粒粒度分布较宽;超临界流体技术和微孔模
板法过程较复杂，设备投资大，难以形成工业化。相
比较而言，液相沉淀技术具有成本低、工艺简单和易
于工业化等优点，呈现出良好的应用前景［13］。
本文采用反溶剂沉淀法，通过考察不同制备条
件对微粉颗粒粒径的影响，优化制备了穗花杉双黄
酮微粉，并经激光粒度分析、扫描电镜、傅立叶转换-
红外光谱、X 线衍射和体外溶出实验等对其进行分
析表征。研制的穗花杉双黄酮微粉呈无定形态，粒
度均匀、分散性好、溶出速率显著提高，为改善穗花
杉双黄酮的口服生物利用度提供了基础。
1 药品与仪器
1. 1 药品与试剂
穗花杉双黄酮原料，本实验室自制，批号:
111218，纯度 98. 26%;乙腈为色谱纯，美国 Fisher公
司;三氟乙酸为色谱纯，美国 Acros Organics公司;水
为超纯水，由美国 Millipore超纯水器制备。
1. 2 仪器
Waters 2695 高效液相色谱仪，美国 Waters 公
司;ZRS-8G 智能溶出实验仪，天津大学无线电厂;
SIGMA 1-13 型离心机，德国 Sigma 实验室离心机公
司;Nano -ZS90 型马尔文激光粒度仪，英国 Malvern
公司;S -3400N型扫描电子显微镜，日本 Hitachi 日
立公司;Q2000 型差示扫描量热仪，美国 TA 公司;
D8 ADVANCE 型 X射线衍射仪，德国 Burker 公司;
Nicolet - 6700 型傅里叶红外光谱仪，美国 Thermo
Fisher Scientific 公司;Modulyo 冷冻干燥仪，美国
Thermo Savant公司;DZF -6050 型真空干燥箱，上海
一恒科学仪器有限公司;85-2A 型数显测速恒温磁
力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。
2 方法与结果
2. 1 穗花杉双黄酮微粉的制备
配制一定浓度的穗花杉双黄酮乙醇溶液，用孔
径 0. 45 μm的有机滤膜过滤除去可能存在的不溶
物。实验在恒温水浴中带有搅拌装置的烧杯中进
行。以水为反溶剂，将穗花杉双黄酮的无水乙醇溶
液迅速加至搅拌着的去离子水中，形成沉淀后，再将
所得混悬体系冷冻干燥(－ 70℃预冻 4 h，－ 40℃减
压冷冻干燥 24 h，再于 50℃减压干燥 4 h)即得微粉
化的穗花杉双黄酮。通过改变穗花杉双黄酮乙醇浓
度、乙醇与去离子水的体积比、搅拌温度、搅拌速度
与搅拌时间等参数，以微粉粒径为指标选择最优试
验条件。
2. 2 穗花杉双黄酮微粉化粒径的影响因素
2. 2. 1 溶剂和反溶剂体积比 在 25℃，1000 r /min
的搅拌速度下将浓度为 0. 05 mol /L 的穗花杉双黄
酮的无水乙醇溶液迅速加入去离子水中，实验分别
以乙醇溶液与水体积比为 1∶ 5、1∶ 10、1∶ 20，照“2. 1”
项下制备穗花杉双黄酮微粉，平行制备 3 份，室温条
件下，测定混悬液的平均粒径。结果显示，平均粒径
分别为(0. 11 ± 0. 02)、(0. 08 ± 0. 02)和(0. 08 ±
0. 01)μm。考虑到冷冻干燥时有机溶剂不宜过多，
因此选定体积比为 1∶ 20。
图 2 药物浓度对颗粒粒径的影响(珔x ± s，n =3)
Fig． 2 Effect of drug concentration on particle size(珔x ± s，
n =3)
2. 2. 2 溶液浓度 穗花杉双黄酮微粉颗粒形态受
溶液浓度影响很大。在 25℃，1000 r /min 的搅拌速
度下，分别将浓度为 0. 02、0. 05、0. 10 和 0. 20 mol /L
的穗花杉双黄酮乙醇溶液，按照 1∶ 20 的体积比加入
水中，平行制备 3 份，测定混悬液的平均粒径，结果
如图 2 所示。可见，随着溶液浓度的提高，平均颗粒
粒径有增大的趋势，且粒径分布均匀度降低。高浓
度溶液会增加体系过饱和度，加快成核速率，从而产
生细小晶核;但是过饱和度的增加也加快了颗粒生
长速率，从而导致颗粒团聚和结块。因此，浓度过高
不利于生成细小颗粒［14］。本实验中溶液浓度过低
后平均粒径减小不明显，综合考虑选择穗花杉双黄
酮溶液的浓度为 0. 05 mol /L。
2. 2. 3 反应温度 分别设置体系温度为 5℃、25℃
和 40℃，穗花杉双黄酮溶液浓度为 0. 05 mol /L，与
水的体积比是 1 ∶ 20，搅拌速度为 1000 r /min，照
“2. 1”项下平行制备 3 份微粉颗粒，测定平均粒径。
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结果在上述实验温度下，穗花杉双黄酮微粉的平均
粒径分别为 (0. 10 ± 0. 05)、(0. 08 ± 0. 01)和
(0. 08 ± 0. 01)μm。可见温度对制备的微粉粒径影
响不大，考虑到方便实验操作，选择 25℃为反应温
度。
2. 2. 4 搅拌速率 搅拌速度分别设置为 200、500、
1000、1500 r /min，反应温度为 25℃，穗花杉双黄酮
的无水乙醇溶液浓度为 0. 05 mol /L，与水的体积比
是 1∶ 20，照“2. 1”项下制备穗花杉双黄酮微粉，平行
制备 3 份，测定混悬液的平均粒径，结果如图 3 所
示。实验结果表明，转速在 200 ～ 1000 r /min 时，其
粒径随转速的提高而减小，继续提高搅拌速度，粒径
变化不明显。因此确定搅拌速度为 1000 r /min。
图 3 搅拌速度对颗粒粒径的影响(珔x ± s，n =3)
Fig． 3 Effect of stirring rate on particle size(珔x ± s，n =3)
2. 2. 5 搅拌时间 控制反应温度为 25℃，乙醇浓
度为 0. 05 mol /L，与水的体积比是 1 ∶ 20，转速为
1000 r /min，考察搅拌时间对所得产品微粉粒度的
影响。当搅拌时间由 30 s 延长到 5 min 时，颗粒粒
径由(0. 30 ± 0. 06)μm 减小到(0. 10 ± 0. 02)μm;当
搅拌时间为 5 ～ 10 min时，颗粒粒径减小到(0. 08 ±
0. 01)μm，继续延长搅拌时间到 40 min，颗粒粒径变
化不明显。可见，延长搅拌时间有利于将尺寸较大
的颗粒打碎，易于形成粒径小，且粒度分布窄的颗
粒。本实验选择适宜的搅拌时间为 10 min。
综上所述，选择的最优工艺条件为:反应溶剂为
无水乙醇，浓度为 0. 05 mol /L，反应溶剂与水的体积
比为 1∶ 20，反应温度为常温 25℃，反应时间为10 min，
搅拌速度为 1000 r /min。
2. 3 微粉产品的表征分析
按照最优条件制备微粉化的穗花杉双黄酮，共
3 批，冷冻干燥后得到淡黄色疏松粉末。
2. 3. 1 激光粒度分析 采用马尔文激光粒度仪测
量冻干前混悬液中穗花杉双黄酮的颗粒粒径及粒度
分布信息。如图 4 所示，所得混悬液粒度分布均匀，
98. 1%分布在 60 ～ 110 nm 之间，粒径分布跨度为
37. 5 nm。
图 4 穗花杉双黄酮混悬液的粒径分布
Fig． 4 Particle size distributions of amentoflavone sus-
pension
2. 3. 2 X线衍射分析 用 X 线衍射仪在 5° ～ 55°
范围内，以 0. 015°步长对样品进行扫描，分析原料
药与冻干样品的晶体结构。由图 5 可见，原料药的
衍射峰为结晶型，而微粉化后的衍射峰为无定形。
研究表明，无定形粉末有利于促进药物的溶出速率
及在体内的吸收，并提高药物生物利用度［15］。
图 5 穗花杉双黄酮原料药与微粉的 X线衍射分析图
Fig． 5 Powder X-ray diffractin of the raw amentoflavone
and the microsized amentoflavone
2. 3. 3 红外光谱分析 采用 KBr 压片法，用傅里
叶红外光谱仪在 450 ～ 4000 cm －1范围内进行红外
扫描，红外光谱图如图 6 所示。结果显示，微粉化的
穗花杉双黄酮的红外光谱谱图与原料药的光谱图的
吸收峰的基本一致，由此推断微粉化的穗花杉双黄
酮的化学结构并没有发生改变。
2. 3. 4 扫描电镜分析 将原料药和冻干样品用双面
导电胶粘在观察台上，喷金，用扫描电子显微镜观察
颗粒的外观形貌。结果可见(图 7) ，穗花杉双黄酮原
料药为方形晶体，微粉化处理后的样品为无定形。
2. 4 溶解度和体外溶出速率的测定
2. 4. 1 HPLC分析方法的建立 采用 HPLC测定药
物含量。色谱柱:Kromasil C18柱(4. 6 mm × 250 mm，
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图 6 穗花杉双黄酮原料药与微粉的红外光谱谱图
Fig． 6 IR spectra of the raw Amentoflavone and the mi-
crosized amentoflavone
图 7 穗花杉双黄酮原料药(A)与微粉(B)的扫描电镜图
(×1000)
Fig． 7 Scanning electron microscopy image of the raw
amentoflavone(A)and the microsized amentoflavone(B)
(×1000)
5 μm) ，流动相:乙腈-0. 02%三氟乙酸水溶液(40 ∶
60) ，检测波长 337 nm，流速 1. 0 ml /min，柱温 30℃，
进样量 20 μl。分别精密配制浓度为 0. 267、0. 533、
1. 067、5. 33、10. 66 和 21. 32 μg /ml的穗花杉双黄酮
对照品溶液，以峰面积(A)对溶液质量浓度(C)进
行线性回归，得回归方程为 A = 162180 C-11997，相
关系数 r = 0. 9999。分别取低、中、高质量浓度
(0. 533、5. 33、21. 32 μg /ml)穗花杉双黄酮对照品溶
液进行分析，结果表明低、中、高 3 个质量浓度对照
品溶液的精密度分别为 0. 67%、0. 39%和 0. 75%(n
= 6) ，12 h内稳定性 RSD 分别为 1. 12%、0. 71%和
0. 83% (n = 6) ，方法回收率分别为 99. 12%、
98. 96%和 101. 3%(n = 3)。精密度、稳定性与回收
率均符合方法学要求。
2. 4. 2 溶解度的测定 分别将过量的穗花杉双黄
酮原料药和微粉置于 10 ml 的具塞试管中，加入
2 ml的水，在 25℃摇床振摇 72 h，离心(6810 × g，
10 min) ，取上清液 20 μl 注入 HPLC 仪，记录峰面
积，由标准曲线计算原料药和微粉在水中的饱和溶
解度(n = 3)分别为(0. 29 ± 0. 11)和(7. 89 ± 0. 54)
μg /ml，结果表明微粉化后穗花杉双黄酮在水中的
溶解度有了显著的提高。
2. 4. 3 体外溶出速率的测定 根据《中国药典》
2010 年版二部附录中溶出度测定法第二法(浆法) ，
对原料药和冻干样品进行体外溶出实验。以 900 ml
的 0. 5%十二烷基硫酸钠为溶出介质，溶出仪搅拌
桨转速和水温分别设定为 75 r /min 和(37 ±
0. 5)℃。分别在投入原料药和冻干微粉 10. 0 mg后
的 5、10、15、20、30、45、60、90 和 120 min 取样 5 ml
(同时补充同温等量的空白介质) ，离心(6810 × g，
10 min) ，取上清液 20 μl注入 HPLC仪，记录峰面积，
由标准曲线计算穗花杉双黄酮的浓度，绘制溶出曲线
(图 8)。实验表明，微粉化后的样品溶出速率明显加
快，5 min 内穗花杉双黄酮微粉就溶出 65%，30 min
时微粉的溶出就达到了 90%;而原料药 30 min 时只
溶出了 32. 7%，120 min的时候仅溶出了 60%。可见
微粉化明显提高了穗花杉双黄酮的溶出速率。
图 8 原料药与微粉的体外溶出曲线(珔x ± s，n =3)
Fig． 8 Dissolution profiles of the raw amentoflavone and
the microsized amentoflavone(珔x ± s，n =3)
3 讨论
穗花杉双黄酮具有较强的疏水性，限制了其口
服制剂溶出速率。本研究采用反溶剂冻干法制备了
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穗花杉双黄酮微粉，并确定了微粉的最佳制备条件。
实验表明，微粉化前后穗花杉双黄酮化学结构没有
改变，晶型由方型晶体转变为无定形粉末;并且微粉
在水中饱和溶解度和溶出速率较原料药有显著提
高，为提高体内生物利用度奠定了基础。
【参 考 文 献】
［1］ Pan X，Tan N，Zeng G，et al． Amentoflavone and its derivatives
as novel natural inhibitors of human Cathepsin VB［J］． Bioorg
Med Chem，2005，13(20) :5819-5825．
［2］ 龚金炎，张 英，吴晓琴． 黄酮类化合物抗病毒活性的研究
进展［J］． 中草药，2008，39(4) :623-627．
［3］ Jung HJ，Sung WS，Yeo SH，et al． Antifungal effect of amento-
flavone derived from Selaginella tamariscina［J］． Arch Pharm
Res，2006，29(9) :746-751．
［4］ 吴 洪，高平章． 11 种黄酮类化合物抗氧化活性与结构关系
的 DFT研究［J］． 医用化学，2009，22(4) :434-436．
［5］ Yin MH，Kang DG，Choi DH，et al． Screening of vasorelaxant
activity of some medicinal plants used in Oriental medicines［J］．
J Ethnopharmacol，2005，99(1) :113-117．
［6］ Cardoso CR，de Syllos Cólus IM，Bernardi CC，et al． Mutagenic
activity promoted by amentoflavone and methanolic extract of Byr-
sonima crassa Niedenzu［J］． Toxicology，2006，225(1) :55-63．
［7］ Stegemann S，Leveiller F，Franchi D，et al ． When poor solubili-
ty becomes an issue:from early stage to proof of concept［J］． Eur
J Pharm Sci，2007，31(5) :249-261．
［8］ 平其能． 纳米药物和纳米载体系统［J］． 中国新药杂志，
2002，11(1) :42-46．
［9］ 秦军伟，陈 彬，陈 岩，等． 气流粉碎技术在生物材料微
细化处理中的应用研究［J］． 食品工业科技，2012，33(10) :
423-426．
［10］ Donsi F，Wang Y，Li J，et al． Preparation of curcumin sub-mi-
crometer dispersions by high-pressure homogenization［J］． J Ag-
ric Food Chem，2010，58(5) :2848-2853．
［11］ Kang Y，Wu J，Yin G，et al． Preparation，characterization and
in vitro cytotoxicity of indomethacin-loaded PLLA /PLGA microp-
articles using supercritical CO2 technique［J］． Eur J Pharm Bio-
pharm，2008，70(1) :85-97．
［12］ Zhang HX，Wang JX，Zhang ZB，et al． Micronization of atorvas-
tatin calcium by antisolvent precipitation process［J］． Int J
Pharm，2009，374(1 /2) :106-113．
［13］ Wang Z，Chen JF，Le Y，et al． Preparation of ultrafine beclometha-
sone dipropionate drug powder by anti-solvent precipitation［J］．
Ind Eng Chem Res，2007，46(14) :4839-4845．
［14］ 谢玉洁，王洁欣，乐 园，等． 反溶剂重结晶法制备阿奇霉素
超细粉体［J］． 北京化工大学化学学报，2011，38(3) :17-21．
［15］ 欧阳辉，易 涛，郑 琴，等． 吲哚美辛微观结晶机制及纳
米包衣的影响［J］． 药学学报，2011，46(4) :707-712．
(收稿日期:2012-12-10 修回日期:2013-01-04)
(上接第 236 页)
their use as drug carriers for a controlled delivery system［J］．
Biomaterials，2003，24(20) :3563-3570．
［7］ 康红梅，刘朋生，吴 静． N，N-二甲氨基甲基丙烯酸乙酯的
原子转移自由基聚合［J］． 高分子材料科学与工程，2005，
21(6) :88-90，94．
［8］ Storey RF，Sherman JW． Kinetics and mechanism of the stannous
octoate-catalyzed bulk polymerization of epsilon-caprolactone［J］．
Macromolecules，2002，35(5) :1504-1516．
［9］ Kolb HC， Finn MG， Sharpless KB． Click chemistry:diverse
chemical function from a few good reactions［J］． Angew Chem Int
Ed，2001，40(11) :2004-2021．
［10］ Hsiue GH，Wang CH，Lo CL，et al． Environmental-sensitive mi-
celles based on poly(2-ethyl-2-oxazoline)-b-poly(L-lactide)
diblock copolymer for application in drug delivery［J］． Int J
Pharm，2006，317(1) :69-75．
［11］ 王辰允，刘燕，曲恒燕，等． 紫杉醇长效缓释微球的制备与
评价［J］． 军事医学科学院院刊，2004，28(6) :549-551．
［12］ Sezgin Z，Yuksel N，Baykara T． Preparation and characterization
of polymeric micelles for solubilization of poorly soluble antican-
cer drugs［J］． Eur J Pharm Biopharm，2006，64(3) :261-268．
(收稿日期:2012-12-27 修回日期:2013-01-29)
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·142·国际药学研究杂志 2013 年 4 月 第 40 卷 第 2 期 J Int Pharm Res，Vol． 40，No． 2，April，2013