全 文 ：收稿日期:2015-08-07; 修订日期:2015-12-23
基金项目:国家自然科学基金 (No． 81102350;No． 81260632)
作者简介:李春艳(1983-)，女(白族)，云南云县人，大理大学药学与化学
学院讲师，硕士学位，主要从事中药药效学研究工作．
* 通讯作者简介:刘光明(1952-)，男(汉族)，云南泸西人，大理大学药学
与化学学院教授，硕士学位，主要从事中药药效学研究工作．
云南松松塔提取物体外抗 HIV － 1 活性初步研究
李春艳1，刘 熙1，丁 云1，李冬梅1，郑永唐2，刘光明1*
(1．大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000;
2．中国科学院昆明动物研究所
动物模型和人类疾病机理重点实验室 分子免疫药理学实验室，云南 昆明 650223)
摘要:目的 研究云南松松塔提取物(C:醇提水沉后经碱提酸沉法得到的沉淀;D:滤液 1 倍醇沉得到的沉淀;F:滤液 2 倍
醇沉过滤后再 5 倍醇沉得到的沉淀;H:醇提水沉后水溶液五倍醇沉得到的沉淀)体外抗 HIV － 1 活性，明确云南松松塔提
取物活性组段。方法 采用细胞毒性实验、合胞体形成抑制实验、HIV － 1 感染细胞保护实验筛选云南松松塔提取物体外
抗 HIV － 1 活性组段。结果 云南松松塔提取物对 C8166 细胞毒性小，其 CC50均大于 5000μg·ml
－1;云南松松塔提取物
C、D、F、H抑制 C8166 细胞合胞体形成的 EC50分别为 232． 59，56． 46，47． 44，1687． 72μg·ml
－1。云南松松塔四个提取物对
MT4细胞毒性小，均大于 1000μg·ml －1，在 1000μg·ml －1时，云南松松塔提取物对 HIV － 1 感染的 MT4 细胞的保护率分
别为(42． 39 ± 0． 36)%、(15． 94 ± 6． 15)%、(29． 86 ± 3． 41)%、(14． 98 ± 10． 75)%。结论 云南松松塔提取物 C、D、F均有
体外抗 HIV － 1 活性;云南松松塔提取物 H无体外抗 HIV － 1 活性;云南松松塔四个提取物对 HIV － 1 感染 MT －4 细胞保
护作用弱。
关键词:云南松松塔; 提取物; 抗 HIV － 1 活性
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 04． 003
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)04-0774-03
艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征 (acquired immunodefi-
ciency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒 (human immu-
nodeficiency virus，HIV)引起，以全身免疫系统严重损害为特征
的传染性疾病。截至 2013 年底，全球获得抗病毒治疗的人数
1300 万人;新发感染自 2002 年的 330 万人下降到 2012 年的 230
万人;艾滋病相关的死亡率从 2005 年的 230 万人下降到 2012 年
的 160 万人。但艾滋病防治在全球范围内仍面临严峻的挑战［1］。
虽然抗病毒治疗和疫苗研发取得一定的进展，临床使用的高效抗
逆转录病毒疗法(HAAＲT 即“鸡尾酒疗法”)提高了患者生活质
量，延长了 HIV 感染者寿命，但由于 HIV 变异产生耐药，加之药
物毒副作用大、服药繁琐等问题［2］及我国至今没有一种具有自
主知识产权的抗 HIV药物获准上市，促使人们不断从传统中药、
植物和真菌资源等天然资源中寻找抗 HIV 新药或先导化合
物［3］。
松科松属(Pinus)植物全世界约 100 种，分布于北半球至北
极圈［4］。云南松主要分布于云南，资源丰富，松塔是其球果，《本
草纲目》记载了松塔具有抗病毒、祛痰、止咳平喘、祛风、润肠、安
神等功效［5］。现代药理研究发现，松属植物松塔所含化学成分
多，药理作用广泛，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和增强免疫等作
用［6 ～ 9］。迄今，国内外已有多位学者对不同松科植物进行了研究
且发现松塔提取物含有抗肿瘤、抗 HIV、抗菌活性［10 ～ 12］。而对云
南松松塔的抗 HIV － 1 药效物质基础及其机制方面的研究少有
报告。故本文采用细胞毒性实验、合胞体形成抑制实验、HIV － 1
感染细胞保护实验对云南松松塔提取物进行体外抗 HIV － 1 活
性初步研究，以明确活性部位，为后续活性单体追踪及阐明抗
HIV － 1 机制奠定基础。
1 材料与仪器
1． 1 云南松松塔和提取物 云南松松塔采自云南松松塔采自云
南省大理州漾濞县，经大理学院生药教研室夏从龙教授鉴定为松
科松属植物云南松 Pinus yunnanensis Franoh．的松塔，样品标本保
存在大理学院有机药化教研室。将 10 kg 云南松松塔粗粉，以
85%乙醇提取 2 次，每次用乙醇 4000ml，每次浸泡 24 h。过滤除
去乙醇提取液，并回收乙醇。将残渣用热水提取，得残渣及热水
提取液两部分，其中残渣部分在室温条件下，加碱液并过滤得到
碱性提取液后调 pH值至 5，浓缩、过滤，得沉淀 C(得率 5． 2%)。
将滤液用 1 倍量醇溶，过滤，得沉淀 D(得率 3． 4%)。再将滤液
用 2 倍量醇溶，过滤后继续将滤液用 5 倍量醇溶，过滤，得沉淀 F
(得率 1． 3%)。热水提取液部分浓缩，过滤后用 5 倍量醇溶，过
滤，得沉淀 H(得率 8． 8%)。在本实验中，样品 C、D、F、H 均用
ＲPMI － 1640 培养基溶解。
1． 2 试剂 培养基 ＲPMI － 1640 及胎牛血清(FBS)(Gibco 公
司) ;双抗(100 ×)，噻唑蓝(MTT)、齐多夫定(AZT)、SDS (Sodi-
um dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)、DMF (N，N＇－ Dimethyl for-
mamine，N，N －二甲基甲酰胺)、HEPS(Sigma 公司)。0． 22 μm
微孔滤膜(MiLLipore公司)。
1． 3 细胞与病毒 人 T 淋巴细胞系 C8166 细胞、MT － 4 细胞及
HIV － 1 实验株 HIV － 1ⅢB 英国 MＲC，AIDS Ｒeagent Project 惠
赠。按实验室常规方法培养细胞和病毒，病毒滴度 TCID50(50%
tissue culture infection dose)采用 Ｒeed ＆ Muench 方法确定，病毒
小量分装于冻存管，－ 70℃保存。本研究所有涉及 HIV 操作的
实验按照国际和国家有关生物安全操作规程在生物安全三级
(BSL － 3)实验室进行。
1． 4 仪器 倒置相差显微镜(OLympus IX － 7 型);水套式 CO2 细
胞培养箱，Termo － A2 － 1287 二级生物安全柜(美国 Thermo 公
司);Es － 315 型高压灭菌器(日本 Tomykogyo 公司);ELx800
·477·
时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 4 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 4
ELISA酶标仪(BIO － Tek 公司);Hair － DW － 86L628 超低温冰
箱(海尔公司)。
2 方法
2． 1 云南松松塔提取物对 C8166 细胞毒性实验 将 4 × 105·
ml －1细胞悬液 100μl与不同浓度的云南松松塔提取物混合，每个
质量浓度设 3 个重复孔，同时设置阴性对照组、空白对照组及
AZT药物对照。37℃、5% CO2 培养箱培养 3 d后，每孔加入 20μl
MTT(4mg·ml －1)，37℃，5% CO2 培养箱培养 4h 后吸走 100μl
上清，补加 100μl SDS － DMF溶液，37℃过夜，于 λ595 /630 BIO － Tek
ELx800 酶标仪测定 A值并按下式计算出存活率，计算出细胞毒
浓度 CC50值。
存活率(%)= 100% ×(A实验孔 － A空白孔)/(A阴性孔 － A空白孔)
2． 2 云南松松塔提取物对 HIV － 1 诱导 C8166 细胞形成合胞体
的抑制实验 在 96 孔板中，将 50μl C8166 细胞(8 × 105·ml －1)
接种到 5 倍倍比系列稀释的云南松松塔提取物溶液(100μl·
孔 － 1)中的细胞培养板上，然后每孔加入 50 μl 的 HIV － 1IIIB 稀
释上清(MOI值 0． 03)，每个质量浓度设 3 个重复孔，同时设置阴
性对照组，AZT 阳性对照组。37℃，5% CO2 培养箱培养 3 d，倒
置显微镜下(100 ×)计数合胞体。按下式计算抑制率，并计算出
EC50及治疗指数(TI)
［13］。
抑制率(%)=(1 －实验孔合胞体数 /对照孔合胞体数)×
100%
2． 3 云南松松塔提取物对 HIV － 1 感染 MT －4 细胞的保护作用
在 96 孔细胞培养板上，对云南松松塔提取物及 AZT 进行 5 倍倍
比稀释(每孔 100μl)，然后每孔加 4 × 104 个 MT － 4 细胞与 HIV
－ 1IIIB 病毒上清(MOI 值 0． 03)，每孔总体积 200μl。同时设置
细胞对照孔和病毒感染细胞对照孔，置 37℃、5% CO2 培养箱中
培养，培养 6 天后用，用 Bio － Tek EL × 800 在 λ595 /630测定 A值，测
定云南松松塔提取物对正常细胞的毒性作用和对 HIV － 1IIIB 感
染细胞的保护率，计算得到 CC50、EC50和 TI
［13］。
药物对 HIV － 1 感染细胞的保护率(%)= (A实验孔 ﹣
AHIV感染细胞对照孔)/(A正常细胞对照孔﹣ AHIV感染细胞对照孔)× 100%
2． 4 统计学处理 实验数据均采用 SPSS(17． 0)统计软件进行
处理，数据以 珋x ± s表示，各组数据进行 t检验。
3 结果
3． 1 云南松松塔提取物对 C8166 细胞的毒性作用 从图 1 中可
知:云南松松塔提取物 C、D、H对 C8166 细胞毒性小，CC50均大于
5000μg·ml －1，在 5000μg·ml －1时，C8166 细胞存活率分别为
(59． 93 ± 2． 75)%、(67． 57 ± 0． 32)%、(71． 67 ± 1． 36)%，而云南
松松塔提取物 F在 5000μg·ml －1时，仅有(16． 11 ± 2． 29)%细胞
存活，其 CC50为 2792． 54μg·ml
－1。
图 1 云南松松塔提取物 对 C8166 细胞的毒性作用(珋x ± s，n = 3)
3． 2 云南松松塔提取物对 HIV － 1 诱导 C8166 细胞形成合胞体
的抑制作用 本实验中，云南松松塔提取物 C、D、F、H 抑制 HIV
－ 1IIIB 诱导 C8166 细胞病变的 EC50分别为 232． 59μg·ml
－1、
56． 46μg·ml －1、47． 44μg·ml －1、1687． 72μg·ml －1。云南松松塔
四个提取物中，D、F对 HIV － 1 诱导 C8166 细胞形成合胞体的抑
制作用较好，H 对 HIV － 1IIIB 诱导 C8166 细胞形成合胞体的抑
制作用弱，云南松松塔四个提取物的治疗指数(TI)分别为 ＞
21． 49、＞ 88． 56、＞ 105． 40、＞ 2． 96(表 1)。
表 1 云南松松塔提取物对 HIV － 1IIIB诱导
C8166 细胞病变的抑制作用
组别
浓度
/μg·ml － 1
抑制率 ± SD
/%
EC50
/μg·ml － 1
TI
(CC50 / EC50)
阴性对照组 0． 00 0． 00 ± 0． 27
松塔提取物 C 5000 100． 00 ± 0． 00＊＊ 232． 59 ＞ 21． 49
1000 99． 03 ± 0． 84＊＊
200 44． 93 ± 2． 90*
40 34． 30 ± 6． 85*
8 25． 12 ± 2． 21*
1． 6 17． 39 ± 1． 45
松塔提取物 D 5000 100． 00 ± 0． 00＊＊ 56． 46 ＞ 88． 56
1000 100． 00 ± 0． 00＊＊
200 73． 91 ± 7． 67＊＊
40 43． 48 ± 9． 05*
8 42． 75 ± 3． 07*
1． 6 40． 20 ± 3． 07*
松塔提取物 F 5000 100． 00 ± 0． 00＊＊ 47． 44 ＞ 105． 40
1000 100． 00 ± 0． 00＊＊
200 92． 75 ± 2． 90＊＊
40 44． 93 ± 2． 90*
8 19． 32 ± 7． 44
1． 6 15． 94 ± 4． 10
松塔提取物 H 5000 94． 20 ± 4． 42＊＊ 1687． 72 ＞ 2． 96
1000 28． 70 ± 10． 57*
200 16． 40 ± 2． 68
40 14． 40 ± 3． 65
8 9． 1 ± 3． 51
1． 6 4． 1 ± 3． 51
AZT 1 99． 22 ± 0． 78＊＊ 0． 00401 498753． 12
0． 2 92． 76 ± 0． 45＊＊
0． 04 78． 04 ± 4． 27＊＊
0． 008 60． 21 ± 0． 90＊＊
0． 0016 36． 43 ± 2． 80*
0． 00032 14． 34 ± 4． 93
与阴性对照组比较，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01;n =3
3． 3 云南松松塔提取物对 HIV － 1 致 MT －4 细胞死亡的保护作
用 从表 2 的实验结果中可知:云南松松塔提取物 C、D、F、H对体
外未感染 HIV － 1 的MT4 细胞毒性小，CC50均大于 1μg·ml
－1，在
此浓度下 C、D、F、H 对体外感染 MT4 细胞的保护率分别为
·577·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 4 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 4 期
(42． 39 ± 0． 36)%、(15． 94 ± 6． 15)%、(29． 86 ± 3． 41)%、(14． 98
± 10． 75)%。
表 2 云南松松塔醇取物对 HIV － 1
感染 MT －4 细胞死亡的保护作用(珋x ± s)
组别
浓度
/μg·ml － 1
存活率 ± SD
/%
CC50
/μg·ml － 1
保护率 ± SD
/%
EC50
/μg·ml － 1
阴性对照组 0． 00 100． 00 ± 3． 25 0． 00 ± 2． 41 无保护作用
松塔提取物 C 1000 102． 64 ± 8． 43 ＞ 1000 42． 39 ± 0． 36 ＞ 1000
200 92． 22 ± 3． 51 1． 35 ± 2． 05
40 94． 04 ± 7． 49 5． 25 ± 6． 89
8 100． 80 ± 2． 11 1． 18 ± 3． 30
1． 6 100． 15 ± 6． 32 6． 94 ± 11． 41
0． 32 100． 13 ± 5． 39 5． 58 ± 6． 48
松塔提取物 D 1000 111． 23 ± 4． 18 ＞ 1000 15． 94 ± 6． 15 ＞ 1000
200 100． 24 ± 8． 97 14． 01 ± 3． 42
40 100． 91 ± 1． 02 10． 14 ± 10． 25
8 100． 43 ± 0． 00 9． 42 ± 3． 07
1． 6 100． 22 ± 2． 05 5． 56 ± 14． 01
0． 32 100． 45 ± 8071 1． 69 ± 4． 44
松塔提取物 F 1000 112． 33 ± 6． 90 ＞ 1000 29． 86 ± 3． 41 ＞ 1000
200 99． 27 ± 4． 72 18． 01 ± 2． 66
40 100． 31 ± 8． 69 0． 54 ± 5． 46
8 100． 73 ± 11． 63 6． 27 ± 3． 66
1． 6 100． 93 ± 1． 58 3． 05 ± 2． 17
0． 32 100． 39 ± 3． 32 2． 51 ± 1． 89
松塔提取物 H 1000 82． 80 ± 5． 42 ＞ 1000 14． 98 ± 10． 75 ＞ 1000
200 82． 70 ± 3． 73 10． 75 ± 9． 15
40 84． 16 ± 2． 61 9． 22 ± 8． 33
8 87． 78 ± 4． 93 8． 60 ± 1． 16
1． 6 90． 62 ± 8． 66 7． 99 ± 4． 73
0． 32 92． 52 ± 3． 11 4． 61 ± 7． 17
AZT 1 86． 24 ± 7． 92 66． 28 ± 1． 08
0． 2 90． 32 ± 8． 02 ＞ 1 71． 46 ± 6． 77 0． 0036
0． 04 97． 30 ± 2． 05 86． 49 ± 1． 76
0． 008 100． 28 ± 1． 27 82． 76 ± 4． 88
0． 0016 100． 85 ± 2． 84 16． 09 ± 10． 02
0． 00032 100． 85 ± 2． 84 4． 77 ± 0． 68
n =3
4 讨论
我国的中药资源丰富，且研究表明中药具有稳定和提高免疫
功能、消除和缓解症状、改善生活质量、价格低廉，效果明显，易
于普及等优点［14］。从我国国情出发，利用中医药的独特性及经
济性，开发传统的具有我国特色的抗 HIV 药物或抗艾滋病辅助
药物是完全可能和可行的。
近年来，国内外已有多位学者对不同松科药理作用进行了研
究。如发现日本五针松 Pinus parviflora 松塔、赤松 Pinus densiflo-
ra、湿地松 Pinus elliottii var． elliottiib．、火炬松 Pinus taeda、加勒比
松 Pinus caribaea以及樟子松 Pinus sylvestris松塔中的成分具有良
好的体内抗肿瘤和抗菌活性［15］。国内则对红松松塔、樟子松松
塔的药理活性进行了研究［16 ～ 18］。但对云南松松塔的抗 HIV 活
性少有报道，故本文对云南松松塔的提取物进行了体外抗 HIV －
1活性研究。从实验结果中可知，云南松松塔提取物 C、D、F 对
C8166 细胞毒性小，CC50均大于 5mg·ml
－1。同时，云南松松塔提
取物 C、D、F对 MT －4 细胞毒性也小，CC50均大于 1mg·ml
－1，但
对 HIV － 1 感染的 MT － 4 细胞保护作用弱。云南松松塔提取物
D、F抑制 HIV － 1IIIB诱导 C8166 细胞病变的效果较好，其 EC50
分别为 56． 46μg·ml －1、47． 44μg·ml －1;云南松松塔提取物 C、
D、F、H的治疗指数分别为 ＞ 21． 49 ＞ 88． 56 ＞ 105． 40 ＞ 2． 96。初
步得出云南松松塔提取物 C、D、F 具有体外抗 HIV － 1 活性，且
D、F体外抗 HIV － 1 活性较好，进而明确其云南松松塔提取物活
性组段为 D、F。另有文献报告从日本五针松 Pinus parviflora
Sieb． et Zucc．中分离获得的松塔多糖具有抑制 HIV － 1 逆转录酶
的活性［19］，提示云南松松塔活性部位(D、F)抗 HIV － 1 活性成分
有可能为松塔多糖，其抗 HIV － 1 机制可能与抑制 HIV － 1 逆转
录酶有关。目前，本课题组正在对云南松松塔提取物的活性部位
进行进一步的分离纯化，以期从中筛选出具有抗 HIV 活性的化
合物，并阐明其作用机制。
致谢:感谢中国科学院昆明动物研究所，动物模型与人类疾
病机理重点实验室郑永唐研究员及研究小组的帮助!
参考文献:
［1］ 中国艾滋病性病杂志编辑部． 第二十届世界艾滋病大会快报［J］．
中国艾滋病性病，2014，20(8):628．
［2］ 杨柳萌，王睿睿，张高红，等．中药有效部位复方奇士乐体外抗 HIV
－ 1 活性研究［J］．中国药理学通报，2011，27(4):566．
［3］ 李春艳，曾艳波，彭 芳，等．蒲葵籽提取物体外抗 HIV － 1 活性及
机制的初步研究［J］．中草药，2008，39(12):1833．
［4］ 郑万均．中国树木志［M］．北京:中国林业出版社，1983:148．
［5］ 国家中医药管理局． 中华本草［M］． 上海:上海科学技术出版社，
1999:306．
［6］ 吕小满，胡艳芬，刘光明，等．松塔化学成分及生物活性的研究进展
［J］．医学综述，2010，16(7):1071．
［7］ 刘中禄，吕铁钢，张永亮．松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的
影响［J］．中国比较医学杂志，2010，20(10):33．
［8］ Süntar I ，Tumen I，Ustün O，et al． Appraisal on the wound healing
and anti － inflammatory activities of the essential oils obtained from the
cones and needles of Pinus species by in vivo and in vitro experimental
models［J］． J Ethnopharmacol，2012，139(2) :533．
［9］ 吕永俊，王士贤，彭 芳，等． 红松与油松松塔及松子壳的抗癌活
［J］．大理学学报，2008，7(2):1．
［10］ Lai PK，Donovan J，Takayama H，et al． Modification of human immu-
nodeficiency viral replication by pinecone extracts［J］． AIDS Ｒes Hum
Ｒetroviuses，1990，6(2) :205．
［11］ Eberhardt TL，Young ＲA． Assessment of the anti － HIV activity of a
pinecone isolate［J］． Planta Med，1996，62(1) :63．
［12］ Sakagami H，Hashimoto K，Suzuki F，et al． Molecular requirements of
lignin － carbohydrate complexes for expression of unique biological ac-
tivities［J］． Phytochemistry，2005，66(17) :2108．
［13］ Wang Ｒ Ｒ，Gu Q，Yang L M，et al ． Anti － HIV － 1 activities of ex-
tracts from the medicinal plant Ｒhus chinensis［J］． J Ethnopharmacol ，
2006，105:269．
［14］ 张 旋，黄宁，郑永唐．我国中药来源的抗HIV天然化合物研究进展
［J］．药学学报，2010，45 (2):151．
［15］ Sakagami H，Kushida T，Oizumi T，et al． Distribution of lignin － car-
bohydrate complex in plant kingdom and its functionality as alternative
medicine［J］． Pharmacol Ther，2010，128(1) :91．
［16］ 吕永俊，王士贤，彭 芳，等． 松果有效成分研究Ⅳ．红松与油松松
塔及松子壳的抗癌活性［J］．大理学院学报(综合版)，2008，7(2) :
1．
［17］ 李艳省，谢芳钦，金新文，等． 红松球果鳞片多糖抗肿瘤作用［J］．
中国公共卫生，2010，26(4):390．
［18］ 王 莉，张 宇，赵 艳． 樟子松松塔化学成分初步研究［J］．黑龙
江医药科学，2008，31(6):10．
［19］ Sun HD，Qiu SX，Lin LZ，et al． Nigranoic acid，a triterpenoid from
Schisandra sphaerandra that inhibits HIV － 1 reverse transcriptase［J］． J
Nat Prod，1996，59(5) :525．
·677·
时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 4 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 4