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穗花杉双黄酮在大鼠体内的药动学研究
王彦志， 张 萌， 刘 阳， 赵会丽， 郑晓珂*
(河南中医学院药学院 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046)
收稿日期:2014-12-12
基金项目:“十二五”国家重大新药创制科技重大专项“降糖新药卷柏黄酮的研究”(2013ZX09102-022)
作者简介:王彦志 (1976—) ，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为中药药效物质基础。Tel: (0371)65962746，E-mail:wang-
yzlb@ 126． com
* 通信作者:郑晓珂 (1961—) ，女，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药药效物质作用机理。E-mail:zhengxk． 2006@ 163． com
摘要:目的 建立测定大鼠血清中穗花杉双黄酮含有量的方法，并计算其药动学参数。方法 血清样品甲醇液 HPLC
分析采用 C18色谱柱 (250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ;流动相为乙腈-水 (含 0. 1%三氟乙酸) ，梯度洗脱;体积流量 1. 0
mL /min;检测波长 330 nm;柱温 30 ℃;进样量 20 μL。大鼠灌胃给予穗花杉双黄酮 (60 mg /kg)后，在不同时间点
取血，测定血清中该成分的含有量，并计算其药动学参数。结果 穗花杉双黄酮在0. 010 04 ～ 0. 803 2 μg /mL 范围内
的线性关系良好 (r2 = 0. 999 1) ，血清中该成分在各质量浓度下的回收率均大于 80%，Tmax为 90 min，Cmax为
(0. 469 ± 0. 046)μg /mL，AUC0 － t为 (27. 731 ± 1. 128)mg /(L·min) ，AUC0 －∞为 (24. 944 ± 1. 093)mg /(L·min) ，
t1 /2为 (57. 008 ± 2. 765)min，V/F 为 (198. 36 ± 17. 422)L /kg，CL /F 为 (2. 408 ± 0. 103)L /(min·kg)。结论 该
方法准确、可靠，可用于大鼠血清中穗花杉双黄酮的测定及药动学研究。
关键词:穗花杉双黄酮;大鼠血清;药动学参数;HPLC
中图分类号:Ｒ969. 1 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)11-2397-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 11. 013
Pharmacokinetics study on amentoflavone in rats
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WANG Yan-zhi， ZHANG Meng， LIU Yang， ZHAO Hui-li， ZHENG Xiao-ke*
(School of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine;Collaborative Innovation Center for Ｒespiratory Disease Diagnosis and Treatment
and Henan Provincial Chinese Medicine Development，Zhengzhou 450046，China)
ABSTＲACT:AIM To establish a method for determining amentoflavone in rat serum and calculate its pharmaco-
kinetics parameters． METHODS HPLC analysis of serum methanolic extract of AME was performed on C18 col-
umn (250 mm × 4. 6 mm，5 μm)with acetonitrile-water (including 0. 1% trifluoroacetic acid)as mobile phase
at a flow rate of 1. 0 mL /min，the detection wavelength of 330 nm，the column temperature of 30 ℃ and the sample
injection volume of 20 μL． After intragastric administration of amentoflavone (60 mg /kg)，rat serum was collected
and checked for the plasma concentration at different intervals，then the pharmacokinetics parameters were ob-
tained． ＲESULTS Amentoflavone had a good linear relationship within the range of 0. 010 04 － 0. 803 2 μg /mL
(r2 = 0. 999 1) ，whose recovery at different concentrations in rat serum was more than 80%，and the Tmax，Cmax，
AUC0 － t，AUC0 －∞，t1 /2，V /F and CL /F were 90 min， (0. 469 ± 0. 046)μg /mL， (27. 731 ± 1. 128)mg /
(L·min) ， (24. 944 ± 1. 093)mg /(L·min) ， (57. 008 ± 2. 765)min， (198. 36 ± 17. 422)L /kg and
(2. 408 ± 0. 103)L /(min·kg) ，respectively． CONCLUSION This accurate and reliable method can be ap-
plied to determining amentoflavone and conduct pharmacokinetics research in rat serum．
KEY WOＲDS:amentoflavone;rat serum;pharmacokinetics parameters;HPLC
卷柏为卷柏科植物卷柏 Selaginella tamariscina
(P． Beauv．)Spring或垫状卷柏 Selaginellaf pulvina-
ta (Hook． ＆ Grev．)Maxim的干燥全草，具有活血
通经之功效，中医临床常用于治疗经闭通经、癥瘕
痞块、跌扑损伤等症［1］，其主要有效物质为双黄
酮类成分，而其中最主要的是穗花杉双黄酮
(amentoflavone，AME)［2］。目前，国内外对穗花杉
双黄酮的抗炎、抗氧化、抗病毒［2］、抗肿瘤［3］、
降血糖［4］和扩张血管等多种生物活性均有所研究，
而且它还具有显著的抗微生物［5］、抗抑郁及抗焦
虑作用［6］。正由于穗花杉双黄酮具有显著的药理活
性，故国内外正开展针对它的一系列新药研究。
穗花杉双黄酮在化学结构上属于双黄酮类化合
物，虽然该类成分在自然界的分布非常广泛，有关
其体内代谢的文献也有不少，但其药代动力学研究
主要集中在黄酮 (醇)类［7-8］、二氢黄酮 (醇)
类［9］、异黄酮类［10-11］、查尔酮类［12-13］等，而对双
黄酮类化合物的相关研究则相对较少。龚雯等［14］
对穗花杉双黄酮在家兔体内的药代动力学进行研
究，建立了 HPLC法测定家兔血清中该成分浓度的
方法，但在处理血清时，需要经过一次沉淀和两次
萃取，再吹干溶解，过程相对复杂，回收率不高，
因此有待作进一步优化。本实验考察了穗花杉双黄
酮在大鼠体内的药动学特征，并优化血清样品的处
理过程。
1 材料与仪器
1. 1 试剂与药品 甲醇和乙腈均为色谱纯 (美国
VBS公司);三氟乙酸为色谱纯 (天津科密欧化学
试剂有限公司);乙酸乙酯为分析纯 (天津市天力
化学试剂有限公司) ;娃哈哈纯净水 (杭州娃哈哈
集团有限公司)。穗花杉双黄酮对照品 (成都曼思
特生物科技有限公司) ;穗花杉双黄酮纯品 (自
制，纯度 ＞ 98%)。
1. 2 动物 SD大鼠，雄性，体质量 (220 ± 20)g
(济宁市任城区鲁康动物饲料经销中心，许可证号
SCXK ［鲁］ 20140001)。
1. 3 仪器 Waters2695 HPLC 色谱仪，包括 Wa-
ters2489 紫外检测器、Empower 色谱工作站 (美国
Waters公司);Starsorius BSI 电子分析天平 (精度
0. 01 mg，北京赛多利斯天平有限公司) ;KQ3200B
超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;TDL-
40B离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;氮气吹干仪
(北京八方世纪科技有限公司) ;XW-80A涡旋混合
仪 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 C18色谱柱 (250 mm × 4. 6 mm，
5 μm);流动相为乙腈 (A)-水 (B) (含 0. 1%
三氟乙酸) ，梯度洗脱 (0 ～ 5 min，25% A;5 ～ 12
min，25% ～ 35% A;12 ～ 17 min，35% ～ 45% A;
17 ～ 25 min，45% ～ 50% A;25 ～ 40 min，50% ～
55% A);体积流量 1. 0 mL /min;检测波长 330
nm;柱温 30 ℃;进样体积 20 μL。
2. 2 对照品溶液的配制 精密称取穗花杉双黄酮对
照品 10. 04 mg，置于 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度
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线，配成 1. 004 mg /mL的对照品贮备液，用甲醇稀释
成 0. 100 4、0. 502 0、1. 004 0、2. 008 0、4. 016 0、
8.032 0 μg/mL一系列对照品溶液，4 ℃冰箱保存，即得。
2. 3 血清样品预处理 取血清 200 μL，置于 5 mL
离心管中，加入 1 mL乙酸乙酯，涡旋混合 2 min，
超声 1 min，离心 5 min (转速 4 000 r /min)，吸取
上层有机相至另一离心管中，下层血清相重复萃取
一次，合并，40 ℃空气流吹干，残留物用 200 μL
甲醇溶解，取 20 μL进样分析。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 专属性试验 分别取按 “2. 3”项下方法
制成的大鼠空白和给药后的血清溶液 20 μL，注入
HPLC色谱仪，在“2. 1”项色谱条件下进行测定，
结果见图 1。
1． 穗花杉双黄酮
1． amentotaxus biflavone
图 1 大鼠血清中穗花杉双黄酮色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of amentoflavone in rat serum
由图可知，该方法处理空白和含药血清时，色
谱条件适宜，样品中的内源性物质不干扰穗花杉双
黄酮的测定，专属性较好。
2. 4. 2 标准曲线 取大鼠空白血清适量，分别加
入按“2. 2”项下方法制得的不同质量浓度的穗花
杉双黄酮对照品溶液，涡旋混合，制成血清中含对
照品质量浓度为 0. 010 04、0. 050 2、0. 100 4、0. 200
8、0. 401 6、0. 803 2 μg /mL 的含标血清，按
“2. 3”项下方法进行血清样品前处理，在 “2. 1”
项色谱条件下进样分析。以穗花杉双黄酮的峰面积
为纵坐标 (y)，血清中 对照品的质量浓度
(μg /mL)为横坐标(x)作标准曲线，得到回归方
程 y = 106 725x + 1 023. 7，r2 = 0. 999 1，线性范围
0. 010 04 ～ 0. 803 2 μg /mL。
2. 4. 3 精密度试验 取大鼠空白血清适量，分别加
入不同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，涡旋
混合，配成低、中、高 3 个质量浓度的样品进行分
析，连续测定3 d，与标准曲线同时进行，按“2. 3”
项下方法进行血清样品前处理，进样分析，计算其
日内和日间精密度。结果显示，该方法精密度良好，
符合药物代谢动力学研究中的样品测定要求，见
表 1。
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表 1 精密度试验结果 (x ± s，n =5)
Tab. 1 Ｒesult of precision tests (x ± s，n =5)
穗花杉双黄酮 /
(μg·mL －1)
平均值 /
(μg·mL －1)
日内 ＲSD /% 日间 ＲSD /%
0. 010 04 0. 009 73 ± 0. 000 5 2. 95 2. 87
0. 100 4 0. 099 5 ± 0. 002 5 2. 66 2. 54
0. 803 2 0. 789 8 ± 0. 003 7 2. 13 2. 98
2. 4. 4 回收率试验 取大鼠空白血清适量，分别加
入不同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，涡旋
混合，配成低、中、高 3 个质量浓度的样品，按
“2. 3”项下方法进行血清样品前处理，进样分析，
记录峰面积 ＲSD，计算相对回收率。另外，配制相
同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，进样分析，
记录峰面积 ＲSD，计算两种峰面积的比值，即绝对
回收率。结果显示，该方法回收率良好，见表 2。
表 2 回收率试验结果 (x ± s，n =5)
Tab. 2 Ｒesult of recovery tests (x ± s，n =5)
加入量 /(μg·mL －1) 测得量 /(μg·mL －1) 相对回收率 /% ＲSD /% 绝对回收率 /% ＲSD /%
0. 010 04 0. 008 97 ± 0. 000 23 89. 34 ± 2. 29 2. 54 80. 36 ± 2. 32 2. 89
0. 100 4 0. 084 5 ± 0. 001 0 84. 13 ± 0. 99 1. 18 79. 87 ± 2. 06 2. 58
0. 803 2 0. 786 3 ± 0. 008 9 97. 89 ± 1. 11 1. 13 86. 85 ± 3. 26 3. 75
2. 4. 5 稳定性试验 配制质量浓度为 0. 401 6
μg /mL的含标血清样品，考察其置于 4 ℃冰箱 5、
15、30 d后的质量浓度。结果，测出平均质量浓
度为 0. 390 4 μg /mL，ＲSD为 2. 41%，表明血清样
品在低温下放置 30 d内的稳定性良好。
2. 5 药动学研究
2. 5. 1 试验方案与血样采集 称取穗花杉双黄酮
纯品适量，加入含 0. 1%羧甲基纤维素钠 (CMC-
Na)的水溶液，超声混匀，按 6 mg /mL 的剂量制
成混悬液。然后，取 SD 大鼠 5 只，灌胃给予混悬
液，分别于 0、10、15、30、45、60、90、120、
180、240、300、420 min 时断尾取血 0. 5 mL，置
于离心管中离心 5 min (转速 12 000 r /min)，分离
血清， － 20 ℃冰箱中保存备用。
2. 5. 2 未知血清样品的测定 按 “2. 3”项下方
法进行血清样品前处理，HPLC 法进行分析。然后
测得的数据经 DAS 2. 1. 1 版药代动力学软件处理
后，采用非房室模型进行拟合，得到穗花杉双黄酮
的药-时浓度曲线和药动学参数 (n = 5)。
2. 5. 3 药动学结果 大鼠灌胃给予穗花杉双黄酮
(60 mg /kg)后，其主要药物动力学参数见表 3，
平均血药浓度-时间曲线见图 2。
表 3 药动学参数 (n =5)
Tab. 3 Pharmacokinetics parameters (n =5)
房室参数 参数值
t1 /2 /min 57. 01 ± 2. 765
Tmax /min 90
Cmax /(min·L －1) 0. 469 ± 0. 046
AUC0 － t /(mg·L －1·min －1) 27. 731 ± 1. 128
AUC0 － ∞ /(mg·L
－1·min －1) 24. 944 ± 1. 093
MＲT0 － t /min 122. 809 ± 1. 611
MＲT0 － ∞ /min 126. 074 ± 2. 325
V /F /(L·kg －1) 198. 36 ± 17. 422
CL /F /(L·min －1·kg －1) 2. 408 ± 0. 103
图 2 穗花杉双黄酮的血药浓度-时间曲线
Fig. 2 Serum concentration-time curve for amentoflavone
3 讨论
3. 1 洗脱条件的选择 由于检测的是单一化合物，
本实验前期曾采用等度洗脱，但因血清中内源性物
质的干扰，无法测出穗花杉双黄酮的确切浓度。因
此，根据文献 ［13］报道，采用梯度洗脱，结果
较为理想，故确定洗脱条件为梯度洗脱。
3. 2 给药量的确定 根据 《中国药典》规定，以
成人每次服用江南卷柏 10 g 的剂量 (按成人体重
60 kg算，即 0. 166 7 g /kg) ，并根据人与大鼠的体
表面积换算，得出 200 g大鼠每次给予卷柏原药材
的量为 0. 166 7 g (即 0. 826 7 g /kg) ，相当于穗花
杉双黄酮纯品 3 mg /kg (所用卷柏药材中穗花杉双
黄酮的含有量为 1. 8%)。在预试验中发现，将此
给药量扩大至 30 mg /kg 后，仍有多个采血时间点
的血药浓度无法测出，故根据实验前期对穗花杉双
黄酮降血糖活性量效关系的考察结果［6］，将给药
量扩大至 60 mg /kg。
3. 3 药物的配制 在前期实验中，发现穗花杉双
黄酮粉末的脂溶性较强，难溶于水，无法灌胃给
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药，通过查阅文献，分别应用 0. 1%羧甲基纤维素
钠 (CMC-Na)和 0. 5%吐温-80 配制。结果显示，
该方法有利于灌胃，而且灌胃剂量准确可靠。
3. 4 血样预处理方法的比较 本实验采用甲醇、
丙酮沉淀、乙酸乙酯萃取这 3 种方法处理血清样
品，发现用甲醇沉淀蛋白后，虽然空白干扰少，但
是回收率较低;用丙酮沉淀蛋白后，回收率较高，
但是与空白干扰峰的分离效果不理想;用乙酸乙酯
萃取 2 次后，回收率较高，空白干扰少，操作过程
简单，所以选用乙酸乙酯萃取 2 次进行血样预
处理。
3. 5 药动学研究 实验结果表明，大鼠口服穗花
杉双黄酮后，在 90 min 时达到最高血药浓度，与
文献 ［14］报道的 75 min 相近，而且表观分布容
积 (V /F)为 (198. 36 ± 17. 422) L /kg，表明大
鼠口服穗花杉双黄酮后，药物大量分布或储存在某
些组织器官中。
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