全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod ResDev 2006 , 18:896-899
文章编号:1001-6880(2006)06-0896-04
收稿日期:2005-03-31 接受日期:2005-07-22
基金项目:黑龙江省青年专项基金项目(QC05C83)
＊通讯作者 Tel:86-451-86418326;E-mail:lwh@hit.edu.com
大孔吸附树脂分离纯化香叶木苷
卢卫红1＊ ,王 静2 ,于晓敏2
(1.哈尔滨工业大学 ,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学 ,哈尔滨 150040)
摘 要:比较了 D-101、D-140、AB-8 、XAB-8、D312 、聚酰胺等 6 种吸附树脂对蓬子菜中活性成分香叶木苷 diosmin
的吸附和洗脱条件 ,在静态吸附研究的基础上 , 进行了动态实验 , 并且利用二次吸附对该成分进行了纯化。 结
果表明AB-8 树脂对 diosmin 的吸附量大 、吸附速度快 、解吸容易 、富集分离效果好。利用聚酰胺进行二次纯化 ,
得到纯度 95%以上的 diosmin。
关键词:香叶木苷;大孔吸附树脂;聚酰胺
中图分类号:R284.2;TQ028 文献标识码:A
Separation and Purification of Diosmin of Galium verum by
Macroporous Resins
LU Wei-hong1＊ ,WANG Jing2 ,YU Xiao-min2
(1.Harbin Institute of Technology ,Harbin 150001 , China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine ,Harbin 150040 , China)
Abstract:Adsorption and desorption characteristic of macroporous resins D-101 , D-140 , AB-8 , XAB-8 and D312 for diosmin in
Galium verum was investigated.On the basis of static adsorption , the AB-8 was selected to finish the dynamic adsorption experi-
ment.Draw a conclusion that the best resin to separate diosmin was AB-8 and the pure(95%)diosmin were obtained.
Key words:diosmin;macroporous resins;separation;purification
蓬子菜(Galium verum L.)为茜草科猪殃殃属植
物[ 1] ,在我国东北 、内蒙等地蕴藏丰富 ,多生于田间
而被视为杂草。在东北民间药用历史悠久 ,具有清
热祛湿 、活血止痒的功效 ,近十余年来临床应用不同
剂型治疗下肢静脉炎疗效显著 。在对其化学成分研
究过程中 ,首次在该植物中分离得到大量的香叶木
苷(diosmin ,地奥斯明)。
Diosmin为黄酮苷类化合物 ,具有较强的生理功
能 ,能够增强静脉的张力 ,对静脉有特异的亲和性而
不影响动脉系统;还能够减少微循环淤滞 ,改善淋巴
回流 ,减轻水肿[ 2] 。法国施维雅公司最近获批准以
diosmin为活性成分的静脉亲和性药物“爱脉朗 500
mg”口服片剂在我国上市[ 3] ,但价格较昂贵 。本实
验室模拟空间微重力环境下 ,diosmin 对于大鼠静脉
系统作用显著。
大孔吸附树脂具有良好的吸附性能 ,在天然产
物的分离纯化方面具有广泛的应用和良好的分离效
果。本文利用大孔树脂在蓬子菜中首次富集 、分离 、
并纯化了含量较大 、纯度较高的 diosmin ,工艺路线
成熟 ,成本较低 ,回收率高 ,适于工业化生产。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
waters600E-2487高效液相色谱仪(美国 waters
公司);导津 UV-2450可见-紫外分光光度计 ,AB204-
N分析天平 ,HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨市东联电
子技术开发有限公司);恒温水浴锅 ,玻璃层析柱色
谱纯试剂(美国 dima 公司产品);分析纯试剂(天津
化学试剂公司产品);AB-8 、D-101大孔吸附树脂(天
津南开大学化工厂产品);XAB-8 、D312 、D-140大孔
吸附树脂(山东东大化学工业集团产品);聚酰胺(浙
江台州市四甲生化塑料厂产品)。
蓬子菜样品采自黑龙江省镜泊湖地区和哈尔滨
市郊区 ,由黑龙江中医药大学药学院于加宾教授鉴
定 。Diosmin对照品为实验室自制 ,经北京微量化学
所 ESI-MS和13C NMR 、1H NMR波谱分析确定结构。
1.2 树脂参数
树脂的吸附性能与被吸附分子的极性 、分子量
大小 、吸附剂的比表面积等有密切的关系 ,依据分离
富集纯化的目的 ,选择以下大孔树脂进行分离 。
表 1 树脂参数
Table 1 Parameters of macroporous resin
树脂型号
Type
粒径
Diameter
(mm)
比表面积
Specifi c area
(m2/ g)
平均孔径
Average aperture
(nm)
极性
Polarity
D～ 101 0.2～ 0.6 400～ 600 10.0～ 12.0 非极性
Apolar
D～ 140 0.2～ 0.3 490～ 600 非极性
Apolar
AB～ 8 0.3～ 1.25 480～ 520 13.0～ 14.0 弱极性
Low pole
XAB ～ 8 0.315～ 1.25 400～ 500 弱极性
Low pole
D312 0.315～ 1.25 500～ 650 10～ 20 非极性
Apolar
聚酰胺
Polyamide
0.1～ 0.6 120～ 400 极性
Polarity
1.3 大孔树脂预处理
大孔树脂用 95%乙醇浸泡 24 h ,充分溶胀 ,置
圆底烧瓶内以 95%乙醇回流提取 5 h ,湿法装柱 。
95%乙醇以 2 BV/h流速通过树脂层至流出液加水
不变白色混浊为止。用水以同样流速洗尽乙醇 ,后
用5%HCl以 5 BV体积 、4 ～ 6 BV/h流速淋洗 ,用蒸
馏水洗至 pH 6 ～ 7 ,再用2%NaCl以5 BV体积 、4 ～ 6
BV/h流速淋洗 ,最后用蒸馏水洗至 pH 7 ～ 8 ,备用 。
1.4 样品预处理
取一定量干燥的蓬子菜全草 ,以 70%乙醇回流
提取 2次 ,每次 2 h ,料液比分别为 1:10 、1:8。提取
液过滤 ,减压浓缩回收乙醇 ,浸膏备用 ,上样前溶于
水为树脂上样液 。
1.5 Diosmin的含量测定
高效液相法。色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS2 5
um(200 mm×4.6 mm i.d.),流速 1.0 mL/min ,检测
波长 340 nm ,柱温 26 ℃,灵敏度:0.2 UFS;流动相:
甲醇-水-磷酸(30∶70∶0.20)。进行精密度试验 、重现
性试验 、加样回收率试验 ,最后进行含量测定 ,计算
峰面积 ,得到 diosmin的回归方程和线性范围如下:
C =0.3046×10-4 A+0.0747 , R=0.9999。线性范
围为 0.6010 ～ 1.510μg 。
1.6 静态吸附试验
准确称取经预处理的 6种树脂各 2.500 g ,置于
具塞锥形瓶中 ,分别精密加入已知 diosmin含量的蓬
子菜上柱液 ,25 ℃150 rpm 振荡 2 h ,测定其平衡浓
度 Ce ,除去蓬子菜溶液后 ,以 50%乙醇进行解吸 ,测
定洗脱液中 diosmin的含量 。按下式计算吸附量和
吸附率 ,选择出效果较好的大孔吸附树脂 。
(1)Q=(C0-C e)VA/m , A%=(C0-C e)/C0×100%
(2)D %=CDVD/(C0-Ce)VA , R %=CDVD/C0VA ×
100%
式中 Q-吸附量(mg/g);C0-初始浓度(mg/L);
Ce-平衡浓度(mg/ l);VA-吸附液体积(L);m-树脂重
量(g);A-吸附率;D-解析率;CD-洗脱液浓度(mg/
L);VD-洗脱液体积(L);R-回收率 。
1.7 动态吸附试验
在一定温度下 ,取蓬子菜上柱液以一定流速通
过装有树脂的层析柱 ,测定洗脱液中 diosmin 的含
量 ,做树脂的动态吸附曲线 。
对已吸附样品的树脂进行脱附试验 ,正交试验
考察脱附剂的浓度 、流速 、温度等对树脂脱附性能的
影响。
1.8 二次吸附纯化试验
将富集 diosmin的洗脱液减压回收乙醇 ,同 2.6 、
2.7进行静态吸附试验和动态吸附试验 ,选择最佳
纯化树脂及工艺。
2 结果与讨论
2.1 大孔树脂的静态吸附试验结果
表 2 树脂的吸附性能
Table 2 Adsorbable power of macroporous resin
树脂型号
Type
Diosmin吸附量
Adsorbance of
diosmin(mg/ g)
Diosmin吸附率
Adsorption rate of
diosmin(%)
D-101 20.5 76.5
D-140 16.8 59.3
AB-8 27.0 87.2
XAB-8 23.2 80.5
D312 14.8 51.1
聚酰胺 Polyamide 29.5 89.9
图 1 香叶木苷(diosmin)的结构式
Fig.1 Structure of diosmin
897Vol.18 卢卫红等:大孔吸附树脂分离纯化香叶木苷
表 2结果表明:AB-8 、XAB-8 、聚酰胺对于 dios-
min的吸附量较高 ,diosmin为连接有两个糖的黄酮
苷类化合物 ,极性较大。在实际操作中综合树脂的
极性 、骨架结构 、空间结构 、比表面积和实际分离效
果 ,认为AB-8树脂更适合于将蛋白 、多糖 、色素等与
diosmin进行有效富集和分离 , 确定 AB-8为最佳树
脂 ,并利用其进行动态吸附性能试验。
图 2 静态吸附动力学曲线及吸附等温线
Fig.2 Static adsorb curve and isochone
图2A 表明:diosmin 在 AB-8 树脂上前 150 min
吸附速率较大 ,在 150 ～ 350 min吸附速率逐渐缓慢 ,
到350 min左右达到平衡。
图2B表明:随着溶液中 diosmin的浓度增加 ,树
脂的吸附量逐渐增加 ,至 diosmin 浓度到 750 ～ 850
mg/L 时 ,吸附逐渐缓慢。
2.2 大孔树脂的动态试验结果
根据室温以及考虑到工业化生产的要求分别考
察了 30 、25 、20 ℃, C =850 mg/L 时 ,对树脂吸附性
能的影响 ,结果以 20 ℃为最佳 ,这与大孔树脂吸附
放热相关 。
结合静态吸附试验结果 ,在 20 ℃下 ,分别以上
柱液浓度 850 、425 、213 mg/L 上样 ,结果以 850 mg/
L ,洗脱剂处理量 9 BV左右得到最佳结果 ,而上柱液
浓度过低 ,则需要消耗大量的树脂处理溶液。
在20 ℃、C =850mg/L条件下 ,选取 2 、4 、6 BV/
h的流速进行考察 ,结果 2 、4 BV/h 的曲线接近 ,但
以2 BV/h为最佳 ,流速过快不利于上柱液在树脂中
的扩散。
根据所药洗脱的化合物性质为极性较大的黄酮
苷 ,以及溶剂安全考虑 ,选取乙醇-水系统进行洗脱 ,
结果以 50%的乙醇水溶液洗脱 ,达到最佳富集和分
离效果。
综上 ,AB-8答孔吸附树脂对 diosmin的吸附条
件为:20 ℃、流速 2 BV/h ,溶液处理量 9 BV ,上柱液
浓度850 mg/L。脱附条件为:50%乙醇水溶液为脱
附剂 ,流速 1 BV/h ,溶液处理量 5 BV。
图 3 动态试验结果
Fig.3 Results of dynamic examination
2.3 二次吸附纯化试验结果
由于蓬子菜中还含有其它与 diosmin结构类似
的黄酮苷类化合物 ,所以AB-8大孔吸附树脂富集分
离的粗品经液相色谱检查 ,为三个化合物的混合物 ,
diosmin的含量仅占 42%,故又经二次吸附层析 ,得
到纯度为95%以上的 diosmin单体化合物。
经静态吸附试验以及动态试验 ,得到的最佳纯
化条件是选用聚酰胺为吸附剂 , 20 ℃下 ,上柱液浓
度 C =1200 mg/L ,流速为 4 BV/h ,洗脱剂浓度为
30%乙醇水溶液 。(图略)
从相同洗脱条件下得到的液相色谱可知 ,经过
二步树脂吸附 ,得到了纯度较高的单体化合物 ,工艺
简单 ,可操作性强 。
图 4 蓬子菜上柱液及纯化后产品色谱图
Fig.4 Chromatogram of diosmin
898 天然产物研究与开发 Vol.18
3 结论
在蓬子菜中首次发现 diosmin的基础上 ,首次用
大孔树脂进行富集分离 ,尤其经二次纯化后可以得
到纯度 98%的单体化合物。研究方法可行 ,使用乙
醇水为溶剂较安全 、用量较少 ,成本较低 ,适合于工
业化生产 ,有望解决 diosmin 依赖进口 、价格较昂贵
的问题。
参考文献
1 Chen WQ(陈伟球).Galium(Rubiaceae)in China.Acta Phy-
totaxonomica Sinica(植物分类学报), 1990 , 28:299-306.
2 Michele CMD , Glauco MMD.Heparan sulfate vs diosmin , ef-
fects on microcirculation in chronic venous.Insufficiency of the
Lower Extremities , 1996 , 3:178-190.
3 广东省卫生统计信息中心 http:// gdwstyl.gdhealth.net.
cn/ drug/detaillist2355.htm.
4 Chen GR(陈冠荣).Cyclopaedia of Chemical Engineering and
Chemical Technology(化工百科全书).Beijing:Chemical In-
dustry Publishing House.
899Vol.18 卢卫红等:大孔吸附树脂分离纯化香叶木苷