全 文 ：藤壶研究的某些新途径
摘要 :近来 , 随着在实验室控制条件下孵化和培养大量藤壶幼虫的 技 术 的 发
展 , 现在有可 能对有关附着和防附着 的问题开展广泛的研究 。 本文就目前在海军应
用科学实验室和纽约水族馆的沃兹伯恩海洋科学实验室正在进行的研究做了论述 。
讨论内容包括 : 用一种新的生物鉴定措施来对含有毒料的涂料做出估价 , 对可能影
响海洋生物附着的一些因素进行讨论 , 谈一谈一项关于粘着物质的研究计划 , 这种
物质是由变态的 、 正在成长的藤壶和藤壶的幼虫分泌的 。
有毒防污涂料的研究
在实验室内培养的藤壶幼虫当前用途之一是做为鉴定毒物的有机体来测定防 污 涂 料 的 、
效果 。 正在进行努力来缩短对涂料估价 的时间 , 业增加防附着材料研究的精确 性 。 D “ W “ lf l
( 1 9 6 4) 关于涂料快速渗出的研究 , M il le r ( 1 9 6 4 ) 用饱和的多孔碳估价毒料和 其 他 一些
人的研究指出 , 有必要用标准的 、 能进行重复的实验方法来代替 (或至少是补充 ) 港湾试验
板的研究方法 。 C ol og e r和 F r e i be r g e r ( 1 9 6 7) 曾经描述过的这种研究 , 近来在美国海军应
用科学实验室正在进行之中 。
在佛罗里达比斯开湾的岩石上采集活的成熟的藤壶 , 用飞机运到纽约水族馆的实验室 。
当发现胚胎时 , 就把它从藤壶的外套腔 中取出来 , 放入盛有海水的培养杯内 , 胚胎就在这里
孵化和发育 , 经过六个无节幼 虫期和金星幼虫期 ; 然后 , 它们附着业变态成为附 着 的 藤 壶
( F r e i b e r g e r和 C ol o g e r , 1 9 6 6 ) 。 选择这样一些新附着的藤壶做为鉴定毒物的生物是 由于它
们是固着的 , 易于观察 , 喂养方便 , 以一定的速度生长和按照一种可以认得出来的格式对毒
料起反应 。 事实上 , 某一种防污涂料的生物鉴定包括几种实验室培养的年轻的 藤 壶 群 体 ,
它们的生 长速度和行为在没有毒料存在的情况下是能够预测的 ( C ol o g e r 和 F r e i b e r g e r ,
1 9 6 7)
, 它们的个体成员表现了可以认得出来的活动格式 。 这样一些群体一碰到新配制的和新
应用的涂料可以很快导致高度 的死亡率 , 但这种涂料的寿命短 , 这使它不宜用来防附着 。 因
此认识到 , 估价含有毒物的涂料一定要用某种方式处理过的样品 , 它好像 已经长期暴露在海
水中 。 这样 , 实验室培养的藤壶对这些涂料的反应能够与已知的藤壶对已知期限和已知效能
的涂料的反应相比较 。 因为这样一种涂料的有效期可能临近结束业且该膜有一个临界的防附
着能力 , 所以需要一个精确的和灵敏的实验来鉴别这种效力 。 对老化的防污涂料样品的效力
进行这种的试验就可 以与已知使用寿命的涂料的类似试验的结果相比较 。 对这些资料的说明
将指明试验中的涂料有多长的有效期限 。
藤壶反应的等级
估价防污涂料试验样品的方法是 : 把试验样品暴露给在实验室里培养 出来的新附着的年
轻藤壶群体 。 把实验的涂料涂在一平方时的玻璃板 ( 载玻片的盖玻璃 ) 上然后暴露到 自然情
况下或实验室所需要的程度 。 接着把这老化了的涂料样品放在盛有 自然海水的培养皿中 , 海
水中含大约30 个年轻的藤壶群体 。 于是有规律地每24 小时观察一次 , 以便测定它们对试验涂
料的反应 。 下面是我们设计的藤壶反应的十个等级 , 作为用生物鉴定毒物的灵敏而又可重复
的试验根据 :
表 1 . 藤 壶 对 毒 物 反 应 的 等 级
反应等级 描 述
1
2
正常
吸水状态
蔓足活动缓慢
壳板封闭 , 蔓足不外伸
5 壳板封闭 , 蔓足外伸
壳板张开 , 蔓足不外伸
7
8
9
壳板张开 , 蔓足外伸
身体外翻
外套外翻
死亡
蔓足充分伸展 。 活动正常协调 。
动物做有规律的运动 。 雕板轻微张开 。
蔓足卷曲或活动不协调或活动迟缓 。 当收
缩时蔓足进入壳内。
庵板关闭 。 蔓足被关在壳 内。 动物对振动 ,光线和轻微的针刺反应敏感 。
庵板关闭 。 蔓足外伸 。 壳板对针刺有反应 。
庵板张开 。 蔓足卷曲在壳内 。 壳板对针刺没有反应 。
峰板张开 。 蔓足外翻 。
动物体和蔓足外翻 。
外套 、 身体和蔓足均外翻 。
第 9 级后 2 4小时动物死亡 。
初步的试验结果
表 2 中的资料是我们对两种涂料的生物鉴定所观察到的平均反应数。 这两种涂料一种是
氧化亚铜涂料 , 另一种是含有氧 化三丁基锡的涂料。 表中也提供了对照资料 , 以便把这些结
果与藤壶对无毒的实验环境的正常反应做一比较 。
藤壶对无毒的对照条件超过 四天的反应情况表明 , 3 . 0 或接近 3 . 0 的平均反应数可以 作
为在实验室的条件下藤壶的正常行为的指标 。 对于防污涂料来说在所有的试验的样品中第一
天就超过了这个正常的反应数 。 值得注意 , 氧化亚铜的防污效力 , 在六个月的暴露过程中 ,
实际上是增加 了。 检查一下防污实验样品可以知道 , 在完全暴露的时间里所有的试验样品对
于防除附着生物的附着都有效 。 另外的一些研究 , 其 中有些现在正在进行中 , 是关于各种各
样的防污涂料和延长其暴露时间以致防污涂料不再有效的研究 , 这些研究将最后在充分的范
围内提供资料表明使用期和实验室内反应数 目的相关性 。
加速老化 ( 加速渗出 )
为了完成应用科学实验室提 出的发展一种估价防止海洋生物附着的方法这一目标就必须
发明一种使防污涂料加速老化 ( 即加速渗出 ) 的技术 。 这样一种试验的程序应该加速防污涂
料的老化 ( 即渗出 ) 至少 10 0倍 , 使毒物在三年的自然浸泡下的渗出量能够在不超过两周 的
夭手 叽笋尹叮
表 2 .两 种 涂 料 的 生 物 鉴 定
涂 料 自然的暴露 藤壶的数量 平 均 反 应 数
时间 (月 ) 开始 1 天 2天 3 天 4天
氧化亚铜配 05 9 1 。 1 3 。 8 4。 7 5 。 7 6 . 8
方 1 21
1 1 4 0
。
2 4
。
7 6
。
27
。
8 8
。
4
27 81
。
1 5
。
0 6
。
4 8
。
1 8
.
6
3 6 41
。
3 3
。
85
。
l 6
。
07
。
3
4 61 0
。
1 4
。
9 7
。
1 8
。
69
。
4
5 1 6 4
。
O 4
。
7 6
。
5 8
。
9 8
.
6
5 6 61
。
O 4
。
4 6
。
5 8
。
7 9
。
4
氧化三丁基 01 1 0。 0 4。 5 0。 1 8。 6g 。 8
锡 Be n ja m i n
M
o o e r防附着 1 l 01 。 03 。 7 4。 1 5 。 8 8。 7
涂料 2 l 01 。 3 0。 6 4。 67 。 2 8。 3
4
}
1 。 1 。 3 0。 85 。 6 6。 4 8 . 8
!
_
_ — — - 一对 照 … 5 0 l。 03 。 03 。 0 2。 8 2。 9
时间内产生出来 。 此外 , 这样一种过程应当表现涂料自然老化的特微。 将要单一地或结合地
进行研究的加速涂料老化的一些实验室技术 , 包括 : 增加试验板周围海水的温度 , 改变海水
的 p H值 , 海水在试验涂料表面上的高速运动 , 用高频率的超声波搅动涂料 , 用强烈的 紫 外
线辐射照射涂料表面活化剂和溶剂的应用以及蒸馏和吸收技术的应用 。
测定藤壶粘着机制的一些初步研究
引起 蔓足 类金星幼虫的胶质分泌和附着的生理学机制至今仍不清楚 。 对合成粘着物质向
那些组织的组织学特微也知道的很少 , 而正是这些组织及其分泌物使金星幼虫在变态前附着
于底质上 。 尽管在蔓足类变态的过程中出现的显著的形态学变化 已 有 过 报 告 ( D ar iw 。 ,
1 5 5 1和 1 8 5 3 , D o o e h i n , 19 5 1 ) , 但只有W a l l e y ( 1 9 6 4 ) 描述过在 B a l a n u s b a l a n o i d e s 变
态中所发生的某些组织学变化。 然而 , W al le y 的这个报告主要是与噬菌作用前的组织溶 解
现象有关 , 而这一现象以前在昆虫的变态中曾被描述过 , 但从未见于甲壳类。
早期的某些甲壳类的研究者 ( L a n k e s t e r , 一9 0 9 , 和 S rn i t h等 , 19 0 9 ) 曾概括地讨 i仑过
金星幼虫的小触角分泌物的粘着性质 , 而金星幼虫就是 用这种分泌粘着于各种各样 的 底 质
上 。 然而 , 尽管在成体基板上方的部分寻找粘质腺的工作中做出了些图解式的说明 , 可是没
有对能分泌粘着物质的腺体进行过组织学描述 。 也没有见到有关粘着胶质的化学 性 质 的 报
道 。 对合成 、 分泌和输送藤壶粘质的细胞 , 组织和结构做了第一次详细说明 的 是 L ac o m be
(9 6 6 1 )
。 他描述了一个与腺体性质 的组织相连接的由辐射管和环形管组成的系统 。
下面讨论的是关于藤壶胶质的生物学和化学研究 以及可能负责合成藤壶的胶质的有关的
细胞和结构方面的研究 。
藤壶幼虫的采集和培养
本研究利用的方法就是Fr eib er 息。r 和Co l雌 er (9 16 6 )曾经描述过的方法 , 即 采 集 和 大
量地培养藤壶幼虫经过无节幼虫 、 金星幼虫而达到年轻的成体阶段 。 当附着板收进实验室以
后即被各种各样的无脊椎动物所附着 , 其中包括几种藤壶 。 因为在附着板上占优势的藤壶种
类是 B al a n us e b u r n e us , 因此 , 在本研究中只 用了这一物种的胚囊 。
组织学研究
浮游 、 爬行和固着的各期金星幼虫用 10 % 的福尔马林 , Z e n k e r 氏或 C ar n o y 氏固定液固
定 , 石腊包埋 , 以 5 一 10 微米的厚度连续切片 , 用 M al lo r y 氏磷钨酸苏木精染色法 , 海氏偶
氮胭脂红结缔组织染 色法 , 酞花青铜兰酸性碳水化合物 , 马氏三三染 色法 , 苏木精一伊红和
对胺柳酸染色法来描述与粘着物质和小触角有关的组织 。
按照同样的程序对附着在各种底质上的年轻的成体藤壶进行固定 , 切片和染 色。
附着的研究
让爬行阶段的金星幼虫附着在各种底质上 , 然后把介质和动物一齐切片 。 含有 6 毫升过
滤海水的塑料多孔的培养皿 ( 50 毫米 欠 10 毫米 ) 用来容纳各种底质 以做试验 。 每一种试验重
复三次 , 每一个培养皿内有 10 个金星幼虫 。 含有吸水的纸垫 ( 多孔膜支持着纸 垫 ) , 玻 璃
纸 , 1% 蛋 白胰的海水培养基 ( p H 7 . 2 ) , 多孔膜滤器 ( H A 0 . 45 件 ) 和石腊的各种培养皿被放
在 20 O C 的恒温培养箱内培养业每天检查附着情况 。 大的玻璃培养皿 ( 1 4 0 x 2 0毫米 ) , 皿 内
涂以石腊 , 皿中 1 50 升的过沪海水和 15 个金星幼虫也被用来进行附着的研究 。
生理介质
利用一种生理介质来研究正在成长的金星幼虫所产生的任何一种分泌物 。 把金星幼虫从
正常地培养着它的过滤海水中转移到另一种介质中 , 这种介质由下列成分组成 : 氯化钠 2 4 . 4
克 ; 氯化钾 0 . 8 6克 ; 氯化钙 1 . 4 2克 ; 氯化镁 1 . 6 克和葡葡糖每公升 1 克 。 p H 值用碳酸氢 钠
调整到 7 . 5 ( N i e o , 1 9 6 0 ) 。
观察
对金星幼虫连续切片的初步检查表明 , 小触角的最前面的部分对于粘阮和多糖产生正常
的阳性反应 。 阳性的对氨柳酸 ( P . A . 5 . ) , M al lo r y和 M as s o n 氏反应既出现在小触角伸出
壳板以外的那些切片上 , 也出现在小触角缩进去的那些切片止 。 因为在阳性显微 化学反应的
那部分内没有辨别出细胞的成分 , 看来这种反应是由小触角所分泌而又依附于小触角上的物
质 。 在金星幼 虫切片的几个部分 , 在小触角的基部可以发现具有颗粒状的细胞质 和 多 态 核
的两组侧生的细胞群 ; 变态以后 2 一 3 天的年轻的藤壶成体的某些切面也有类似的细胞明显
地出现在退化的大触角的背面 。 这些细胞可能就是合成粘着物质的地方 。
表 3 表明了藤壶对几种类型的实验室基质附着的亲合力 。 藤壶在 1% 蛋白谏的海水 培 养
基上附着的百分比最大 , 但它们只活了一天 , 设有一个幼虫变态而成为年轻的成体 。 在多孔
膜沪器上的附着是比较成功的 。 金星幼虫在整个的试验期都活着 , 有 10 % 的金星幼虫变态进
入年轻的成体阶段 。 已经证明 , 对于我们的研究来说石腊是最合适的附着基质 。 在一组试验
中 , 利用小的培养皿和 6 毫升过滤的自然海水附着率是 23 % , 整个试验期间都活着 , 有 10 %
的金星幼虫变态成为年轻的成体。 在第二组试验中 , 利用大的衬以石腊的玻 璃 培 养 皿 , 其
内含有 1 50 毫升的海水 , 这样 , 金星幼虫的附着率达 46 % 。 此数 中的 25 %变态成为年轻的成
体 。 利用明胶和冻粉 ( p H 7 . 2) 做为附着底质 , 但没有出现附着 。
浮游的金星幼虫从过滤的海水中转移到 p H为 7 . 5的一种生理介质 中 , 生活的时间是 5 一
10 天 , 这个时间就是我们试验的时间范围 。 通常最后一批游泳的金星幼虫在这种介质中变的
不活泼 , 身体透 明 , 但小触角和胸肢的运动好像和在过滤的自然海水的情况相类似 。 在这种
介质中没有出现附着 。
表 3 . 藤 壶 幼 虫 附 着 的 百 分 比
( 过滤海水的温度是 20 O C )
….竺贡整整
} 3 0
生活的时间
( 天 ) 变
态至成体的比率
塑料盘 50 毫米 x lo 毫米
吸水纸垫 , 多孔纸
玻璃纸 3 6 1 0 0 。 3
l %蛋 白脏海水培养基 p H 7 . 2 6 0
多孔膜滤 H A 0 . 4 5协 2 6 1 0
衬石腊的培养皿 50 x lo 毫米 2 3 1 0
衬石腊的培养皿 1 4 0 x 2 0毫米 4 6 2 0 2 5
明胶
冻粉 ( p H 7 . 2 )
展望
本文报道的方法披露了目前正在沃兹伯恩海洋科学实验室进行的一个研究项 目 , 目的是
研究藤壶的粘着物质及其合成这种物质的组织 。 让金星幼虫在底质上附着亚变态 , 然后把附着
的底质连同生物体一块切片 , 这为粘着物质和底质接合处的组织进行显微和显微化学研究提
供了一种手段 。 利用这种技术来寻找分泌粘着物质的组织 , 业用饿酸固定塑料包埋的方法也
可以研究细胞的亚显微结构 。 如果在一种已知其成分的生理介质中培养金星幼虫 , 那末 , 就
可用化学的方法检查金星幼虫分泌到介质中去的物质 。 按照这种理论 , 现在正把金星幼虫放
在生理介质中培养 , 同时不断地摇动介质使它不能附着 。 在几天的摇动期结束时 , 把金星幼
虫除去 , 把介质低压冻干 , 加水到已知的容积 , 用来进行分光光度测定和 色层分离 。 这项工
作的结果将与组织及其粘着物质和附着底质接合处的研究联系起来 。 这样 , 就展现了一幅全
面的图画 , 它描述了藤壶的组织和有关合成和输送这种粘着物质的组织 。 另外 , 关于藤壶粘
着物质的化学性质方面的一些基本资料将会由此得到 。
译自 A . F r e b e i r g e r , C . P . C o l o g e r ,
V
.
R
.
L i g u o r i 和 R . F . N i g r e l l i
《 O e e a n E n g . ) , 1 9 6 9 , V o l . l ,
N o
。
4 , 4 6 9一 4 7 4