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复方藤梨根制剂对裸鼠荷人肺巨细胞癌细胞E-钙黏附素影响的研究



全 文 :起局部组织坏死的新兴治疗手段。有研究表明 ,金丝桃素光
动力治疗乳腺癌是有效的 [ 6] , 金丝桃素还具有一定的抗转移
活性 [ 7] , 因此用于治疗乳腺癌有良好的开发应用前景。本实
验结果也证实了金丝桃素对乳腺癌细胞有良好的光动力杀
伤活性 , 其效果呈明显的剂量依赖性和光照依赖性。而且本
实验采用了低纯度的金丝桃素提取物进行研究 ,结果表明其
与金丝桃素纯品一样具有良好的抗肿瘤效果 , 甚至抑制活性
更高。这预示着在进行肿瘤的光动力治疗时 , 可能并不需要
高纯度的金丝桃素作光敏剂 ,仅用粗提物就能达到较好的生
长抑制作用 , 这将可能大大降低治疗成本 , 产生良好的社会
效应。
HY是荧光物质 ,进入细胞后可积累在细胞内 , 使细胞产
生橘红色荧光。因此给药后不同时间细胞内的相对荧光强
度 , 间接反映了细胞摄入的 HY量。细胞在不加药的情况下
(即时间原点)也能发出橘红色荧光 , 这是肿瘤细胞自身分泌
内源性卟啉而自体发荧光的正常现象。
高温具有选择性抑癌效应 ,正常细胞能较长时间耐受 42
~ 43℃高热 , 而癌细胞对温度较敏感 ,在 42℃以上很快灭活。
高温治癌已有百余年的历史 , 但单用高热治疗癌症 ,瘤体内
的温度必须达到足够高并维持一段时间才能保证癌细胞全
部被杀死 , 在临床上往往不易实现 [ 8] , 故多与其他抗癌方法
联用。 Chen等 [ 9]将荷瘤小鼠用金丝桃素光动力治疗后立即
进行 43℃高温处理 , 实验证明两者的结合对直接杀死肿瘤细
胞有促进效应 , 大大增强了金丝桃素的抗肿瘤作用。本实验
对乳腺癌细胞采用 PDT后 43℃热处理 30min,结果证明热疗
实验对金丝桃素的抑制作用确实起了一定的促进作用。对
于像乳腺癌这样的体表肿瘤 ,在临床上较容易进行光照处理
和能使肿瘤组织达到并维持预定的治疗温度 ,因此 PDT法与
热疗法联用治疗乳腺癌在临床上较容易实现。 本实验结果
可为临床上用金丝桃素 PDT法 ,并辅以热疗治疗乳腺癌提供
重要依据。
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收稿日期:2006-11-07
基金项目:浙江省中医药管理局课题(2000C78)
作者简介:作者简介:郭勇 ,男 ,教授 ,主任医师 ,博士生导师  E-mail:gyk@mail.hz.zj.cn
复方藤梨根制剂对裸鼠荷人肺巨细胞癌细胞 E-钙黏附素影响的研究
郭勇 ,戴伟春 ,姚庆华 ,杨维泓(浙江中医药大学附属第一医院肿瘤内科 ,杭州 310006)
摘要:目的 研究复方藤梨根制剂对荷人肺巨细胞癌(PG)裸鼠移植瘤的抗癌效应 ,并初步探讨其对瘤体细胞 E-钙黏附素(E-
cad)表达水平的影响。方法 建立 PG裸鼠移植瘤模型;复方藤梨根制剂灌胃 21 d, 称瘤重;采用免疫组化 ABC法检测 E-cad
的表达。结果 复方藤梨根制剂三个剂量组与对照组对比 , 均能明显抑制肿瘤生长 ,并提高 E-cad表达。结论 复方藤梨根
制剂对 PG裸鼠移植瘤具有的抑瘤效果 ,明显上调 PG细胞 E-cad的表达。
关键词:复方藤梨根制剂;肺癌细胞;抑瘤;E-钙黏附素
中图分类号:R289;R979.1   文献标识码:A   文章编号:1007-7693(2008)01-0004-04
·4· ChinJMAP, 2008February, Vol.25 No.1               中国现代应用药学杂志 2008年 2月第 25卷第 1期
DOI :10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2008.01.018
TheStudyonEfectsofFuFangTengLiGenPreparationRegulatingtheExpressionofE-cadofTransplanta-
tionTumorofPGCel
GUOYong, DAIWei-chun, YAOQing-hua, YANGWei-hong(TheFirstAfiliatedHospitalofZhejiangT.C.M.University,
Hangzhou310006, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE TostudytheanticancereffectofChineseCompoundRecipeFuFangTengLiGen(FFTLG)anginstTrans-
plantationTumorofPGCelandpreliminarilyexploretheconnectionwithE-cad.METHODS Modelratsoftransplantationtumorof
humanlargecelcancerPGwereestablished.Thelow, mediumandhighdosegroupsofFFTLG, theblankcontrolgroupweresetup.
After21 daysadminstrationofFFTLGthroughgastrogavage, theantitumoreffectofeachgroupwascompared.ThegeneexpressofE-
cadineachgroupwerequantitativelydetectedandcomparedbytheapplicationofimmunohistochemistrytechnique.RESULTS The
FFTLGcouldsignificantlyinhibitthegrowthoftransplantationtumor, FFTLGcanobviouslyup-regulatetheexpressofE-cad, whichin
thelow/mediumandhighdosegroupswasseparatelyhigherthanthatintheblankgroup.CONCLUSION FFTLGhasdefiniteanti-
tumoreffectagainsthumanlargecellcancerandcanobviouslyup-regu] atatheexpressofE-cad.
KEYWORDS:FFTLG;lungcancercell;antlcancer;E-cad
  间隙连接(gapjunction, GJ)是细胞间信息交换的重要通
道 , 它所介导的细胞间隙连接通讯(gapjunctionintercelular
communication, GJIC)对细胞的增殖和分化调控及维持组织
器官内细胞间的协调稳定等方面起重要作用。E-钙黏附素
(Epithelialcadherin)属依赖细胞外 Ca2+的经典 CD亚族成
员 , 介导同种亲和性的细胞-细胞间黏附 , 并参与建立和维持
细胞间隙连接。研究证实 [ 1-2]许多肿瘤中存在 E-钙黏附素表
达下降或缺失 , 细胞间连接通讯功能中断 , 因此 ,上调 E-钙黏
附素的药物 , 有可能其抑制肿瘤生长 、分化 、转移 , 但复方中
药上调 E-钙黏附素的研究少见报道。本实验观察复方藤梨
根制剂对高转移性人肺癌细胞生长及其对 E-钙黏附素表达
的影响 , 并进一步探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 试剂与药物
RPMI-1640细胞培养基 、PBS0.01 mol· L-1 pH 7.2 ~
7.4磷酸盐缓冲液 、 0.25%的胰蛋白酶 , 购于美国 SIGMA公
司产品;10%灭活小牛血清为上海华美生物工程公司产品;
E-钙黏附素单抗和 ABC试剂盒为美国 Zymed公司产品。
复方藤梨根制剂(FFTLG)由党参 、茯苓 、白术 、藤梨根 、
水杨梅根等纯中药材组成 , 浙江中医药大学制剂室提供 , 每
毫升含生药 1 g。
1.2 细胞来源及培养
高转移性人肺癌细胞株(PG细胞)由浙江省肿瘤研究所
提供 , 用含 10%灭活小牛血清的 RPMI-1640培养液内培养并
传代。
1.3 实验动物
6周龄健康雄性 BALB/C-nu/nu裸小鼠 28只 , 体重(20
±2)g。由中国科学院上海实验动物中心提供 , 在 SPF条件
下饲养。
1.4 瘤株复苏及传代
复苏:从细胞库中取出 PG冷冻细胞 , 37 ℃下溶解 , 将细
胞悬液加入 5 mLRPMI-1640培养基内 , 1 000 r· min-1离心 ,
7 min后弃上清液 , 将细胞置于 RPMI-1640培养基中 , 接种于
T-25培养瓶。在 5℅二氧化碳培养箱内进行培养并传代。
待细胞长满瓶后 , 弃培养基 , 用 0.25℅胰蛋白酶消化 , 当细
胞变圆 , 间距变大时 ,用含小牛血清的培养基终止消化 , 离心
洗涤 , 按 1传 2 ~ 3瓶比例接种备用。
1.5 PG裸鼠模型的建立
参照文献 [ 3] , 台盼篮染色 , 经细胞计数器计数及计算活
细胞比率后 , 收集浓度为 2 ×106 /mL细胞悬液 6 mL。每只
裸鼠右前肢腋背部皮下注射 0.2 mL细胞悬液。 SPF条件下
饲养 , 所有饮用水 、饲料及笼具均经无菌消毒处理。
1.6 实验分组及给药
将造模后裸鼠编号后按随机数字表分为如下 4组并给
药 , 每组 7只。空白对照组:生理盐水(NS)0.6 mL·次 -1·
d-1灌胃;低剂量组:FFTLG0.2mL+0.4 mLNS·次 -1· d-1
灌胃;中剂量组:FFTLG0.4 mL+0.2 mLNS·次 -1· d-1灌
胃;中药高剂量组:FFTLG0.6 mL·次 -1· d-1灌胃。低 、中 、
高给药组用药量各相当于成人临床用药量的 5倍 、10倍 、20
倍。造模后第 2天起灌胃 , 每日一次 ,连续 21d。
1.7 观察指标及方法
接种后观察肿瘤移植成功率 、生长潜伏期 , 动物进食与
活动度 , 排泄物等。 全部动物末次灌药第 2天断颈处死 , 完
整取出肿瘤 , 剥离瘤体后称重(W), 计算抑瘤率(I):I=(对
照组 W-治疗组 W)/对照组 W×100%。
1.8 肿瘤组织 E-钙黏附素的检测
瘤体取下后经 10%福尔马林固定 、梯度乙醇脱水 、石蜡
包埋后 , 行 E-钙黏附素单抗的免疫组化染色。免疫组化 ABC
法具体操作按试剂盒说明进行 [ 4-5] , E-cad呈棕黄色染色 , 阳
性数 >60%为阳性 , 否则为阴性。
1.9 统计学方法
计量资料以均数 ±标准差( x±s)表示 , 计数资料以百分
率表示。计量资料两组间比较用 t检验 , 计数资料两组间比
较用 Fisher sExactTest检验。以 P<0.05为显著性差异 , P
·5·中国现代应用药学杂志 2008年 2月第 25卷第 1期               ChinJMAP, 2008February, Vol.25No.1
<0.01为非常显著性差异。使用 SPSS9.0统计软件包。
2 结果
2.1 一般状况观察
裸鼠接种后第 7天 , 生理盐水组有一只裸鼠右腋背部首
先长出肿瘤结节 , 随后 3 d内各用药组均有裸鼠长出肿瘤结
节。生理盐水组瘤体生长较快 , FFTLG高剂量组生长最慢 ,
瘤体出现相对较晚。在后期 , 生理盐水组裸鼠较为消廋。饮
食 、活动方面各组无明显差异。试验过程中 , 实验组的低 、中
剂量组各 1只裸鼠因灌胃不当死亡。
2.2 各组用药对人肺巨细胞癌的抑制作用
FFTLG三个剂量组对裸鼠 PG实体瘤均有抑制作用 , 抑
瘤率均大于 25%, 低剂量用药组和中剂量用药组与生理盐水
组对比有显著性差异(P<0.05)。高剂量用药组与生理盐水
组对比有非常显著性差异(P<0.01)。 FFTLG抑瘤率似呈
剂量依赖。结果见表 1。
表 1 各组裸鼠瘤重及抑瘤率比较( x±s)
Tab1 Wightoftumorandtherateofanticancercomparedbe-
tweeneachgroup( x±s)
组 别 动物数 瘤重 /g 抑瘤率 /%
NS组 7 1.15±0.22 --
低剂量组 6 0.85±0.161) 25.57
中剂量组 6 0.83±0.111) 27.63
高剂量组 7 0.76±0.132) 33.64
注:与 NS组比较 , 1)P<0.05;与 NS组比较 , 2)P<0.01
Note:ComparedwiththeNSgroup, 1)P<0.05;ComparedwiththeNS
group, 2)P<0.01
2.3 各组用药对人肺巨细胞癌 E-钙黏素表达的影响
E-cad呈棕黄色染色 , 以间质和胞膜着色为主 , 有的胞膜
及近胞膜的胞浆均着色。高 、中剂量组表达较多 , NS组表达
较少或几乎不表达 , 各给药组阳性例数与 NS组比较均与统
计学意义 , 其中低剂量组与 NS组对比无显著性差异(P>
0.05), 中 、高剂量组与 NS组对比有显著性差异(P<0.05)。
结果见表 2。提示FFTLG可以上调人肺巨细胞癌 E-cad的表
达 , 高剂量作用更明显。试验中发现 , E-cad有表达的标本其
Cx43都有表达 , E-cad表达高的标本其 Cx43表达也相对较
强(已另文报道)。
表 2 各组裸鼠种植瘤 E-钙黏附素表达比较
Tab2 ExpressionofE-cadcomparedbetweeneachgroup
组 别 例数 E-cad阳性例数 阳性率 /% P值
NS组 7 1 16.7
低剂量组 6 4 66.7 P>0.05
中剂量组 6 5 83.3 P<0.05
高剂量组 7 6 85.7 P<0.05
3 讨论
复方藤梨根制剂是作者在前人经验的基础上 , 又经过长
期的临床实践并通过实验研究证实治疗多种实体肿瘤有效
的经验方 , 它符合中医学有关肿瘤治疗需扶正祛邪并用的理
论 , 它的药效机制很广泛 [ 6-7] , 对原发肿瘤的生长抑制作用 ,
有一定的抗肿瘤转移 、部分逆转肿瘤细胞的多药耐药等
作用。
E-cad(epithelialcadherin)是相对分子质量为 1.2 ×105
的细胞黏附跨膜糖蛋白 , 普遍存在于各类上皮细胞 , 是介导
同型细胞连接的钙依赖性黏附分子。它在胚胎发育 、形态发
生 、上皮极性和维持上皮完整性等方面起着重要作用。大量
研究表明 , E-cad低表达或缺失使肿瘤细胞丧失接触抑制 ,可
导致细胞无限制增殖 ,失去分化 , 细胞之间连接松散 , 易于从
局部脱落 , 有较强的侵袭能力 , 极易扩散和转移 [ 8] 。
本试验研究 E-cad呈棕黄色染色 , 以胞膜着色为主 , 有
的胞膜及近胞膜的胞浆均着色。高 、中剂量组表达较多 , NS
组表达几乎没有。各给药组与 NS组比较均与统计学意义 ,
其中低剂量组与 NS组对比无显著性差异(P>0.05), 中 、高
剂量组与 NS组对比有显著性差异(P<0.05)。提示 FFTLG
可以上调人肺巨细胞癌 E-cad的表达 , 并与用药量呈正相关
趋势。试验中发现 , 所有 E-cad表达阳性的标本都有 Cx43免
疫阳性反应 , E-cad表达越多 Cx43表达愈强 , Cx43的表达与
E-cad表达有正相关趋势 , 提示 FFTLG可能通过上调 E-cad
表达促进 Cx43的表达;这与体外研究结果一致 [ 9] 。 而少数
有 Cx43表达阳性的标本却没有 E-cad阳性表达 ,提示在介导
黏附和建立通讯功能中除了 E-cad外 , FFTLG还可能通过其
他一些黏附分子或物质在起作用 [ 10] , 其具体机制有待进一
步探讨。
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收稿日期:2007-01-26
作者简介:关利新 ,男 ,在读博士 ,教授  E-mail:glx1960@yahoo.com.cn  *通讯作者:苏云明 ,男 ,教授 ,博士生导师  Tel:(0451)
82196314
蒺藜皂苷对血管平滑肌细胞增殖的影响
关利新 1 ,李孟全 1 ,衣欣 1 ,苏云明2 ,杨世杰 3(1.牡丹江医学院药学系 ,黑龙江牡丹江 157011;2.黑龙江中医药大学药理教研室 ,哈
尔滨 150040;3.吉林大学基础医学院药理教研室 ,长春 130021)
摘要:目的 观察蒺藜皂苷(GSTT)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及相关因素的影响。方法 采用培养的牛 VSMC, 以血管
紧张素Ⅱ(AngⅡ)为刺激因子 , 应用 MTT法检测细胞增殖;以 H2O2为刺激因子 , 应用激光扫描共聚焦显微镜检测 VSMC内钙
离子浓度;应用硝酸还原酶法检测培养的牛血管内皮细胞 NO释放量。结果 GSTT能明显抑制 AngⅡ刺激的 VSMC增殖 ,具
有剂量依赖性;GSTT也能抑制 H2O2所致的 VSMC内钙离子浓度升高 ,使血管内皮细胞释放的 NO明显增多。结论 GSTT能
抑制 AngⅡ诱导的 VSMC增殖 , 此作用可能与抑制活性氧激活钙离子信号转导途径 、增加血管内皮细胞 NO含量等因素有关。
关键词:蒺藜皂苷;血管平滑肌细胞;血管紧张素Ⅱ;活性氧;钙;一氧化氮
中图分类号:R972;R931.6   文献标识码:A   文章编号:1007-7693(2008)01-0007-04
EfectofGrossSaponinsfromTribulusTerrestrisontheProliferationofVascularSmoothMuscleCels
GUANLI-xin1 , LIMeng-quan1 , YIXin1 , SUYun-ming2 , YANGShi-jie3(1.DepartmentofPharmacy, MudanjiangMedical
Colege, Mudangjiang157011, China;2.DepartmentofPharmacology, HeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, Chi-
na;3.DepartmentofPharmacology, SchoolofBasicMedicalSciences, JilinUniversity, Changchun130021, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE Toinvestigatetheefectsofgrosssaponinsfromtribulusterrestris(GSTT)ontheproliferationofvascu-
larsmoothmusclecells(VSMC).METHODS ThebovineVSMCwereculturedandtheefectofGSTToncelularproliferationin
VSMCstimulatedbyangiotensionⅡ (AngⅡ )wereassayedbyMTTmethod, andtheefectofGSTTonintracelularfreecalcium
([ Ca2+] i)inVSMCstimulatedbyH2O2 werealsoassayedbylaserscanningconfocalmicroscope.Thereleaseofnitricoxide(NO)in
bovinevascularendotheliacellweredetectedbythemethodofnitricacidreductase.RESULTS GSTTcouldsignificantlyinhibitthe
proliferationofVSMCstimulatedbyAngⅡ , whichhasthedose-dependenteffects.GSTTalsoshowntobeabletodepressincreaseof
[ Ca2+] istimulatedbyH2O2 , andincreasethereleaseofNO.CONCLUSION TheinhibitioneffectofGSTTontheproliferationof
VSMCstimulatedbyAngⅡ mayberelatedwiththesuppressionofreactiveoxygenactivatedCa2+signalpathandincreasetherelease
ofNO.
KEYWORDS:grosssaponinsfromtribulusterrestris;Vascularsmoothmusclecels;angiotensionⅡ;reactiveoxygen;calcium;nitric
oxide
  血管平滑肌细胞(VSMC)增殖是动脉粥样硬化 、原发性
高血压和血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病发生的关
键因素 , 如何抑制 VSMC增殖已成为人们研究的热点。蒺藜
皂苷(grosssaponinsfromtribulusterrestris, GSTT)是从蒺藜科
植物蒺藜的全草中提取的甾体皂苷 ,临床上主要用于缺血性
心脑血管疾病的治疗。采用家兔动脉粥样硬化模型 , 一些研
究证明 GSTT可从多方面起到抗动脉粥样硬化的作用 [ 1-3] ,
但有关 GSTT对血管平滑肌细胞增殖的影响尚未见报道。本
实验采用体外培养的 VSMC, 探讨 GSTT对 VSMC增殖及相
关因素的影响 ,为 GSTT的临床应用提供实验依据。
·7·中国现代应用药学杂志 2008年 2月第 25卷第 1期               ChinJMAP, 2008February, Vol.25No.1