全 文 ：· 484· 第二军医大学学报
2012 年 5 月第 33 卷第 5 期 http:/ /www． ajsmmu． cn
Academic Journal of Second Military Medical University，May 2012，Vol． 33，No． 5
DOI:10． 3724 /SP． J． 1008． 2012． 00484 ·论 著·
土槿皮乙酸对大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖的抑制作用
陈振军* ，孙冬弢，袁 媛
沈阳医学院沈洲医院神经外科，沈阳 110002
［摘要］ 目的 研究土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)对大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖的抑制作用。方法 采用 MTT
法检测 0、0． 1、0． 2、0． 4、0． 8、1． 6、8、16 μg /ml PAB对 C6 细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测碘化丙啶(PI)染色后细胞周期
的变化;皮下注射 C6 细胞建立 C6 种植瘤大鼠模型并测量种植瘤体积;免疫组化法测定大鼠脑胶质瘤 C6 细胞种植瘤组织中增
殖细胞核抗原(PCNA)的表达变化。结果 体外实验结果表明，PAB 呈剂量依赖性地抑制胶质瘤 C6 细胞生长，半数致死剂
量(IC50)为 0． 03 μg /ml，同时，可使 C6 细胞周期阻滞于 G2 /M期;体内实验结果表明，PAB给药后大鼠种植瘤体积有所降低，种
植瘤组织中 PCNA表达呈下降趋势。结论 PAB可抑制大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖，阻滞细胞周期中 G2 /M期、下调 PCNA表
达为其可能的作用机制。
［关键词］ 土槿皮乙酸;神经胶质瘤;细胞增殖;增殖细胞核抗原
［中图分类号］ R 739． 41 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 0258 － 879X(2012)05 － 0484 － 04
Inhibitory effect of pseudolaric acid B on proliferation of rat glioma C6 cells
CHEN Zhen － jun* ，SUN Dong － tao，YUAN Yuan
Department of Neurosurgery，Shenzhou Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang 110002，Liaoning，China
［收稿日期］ 2012 － 01 － 16 ［接受日期］ 2012 － 03 － 22
［基金项目］ 沈阳市科技计划项目(F10 － 149 － 9 － 31)． Supported by Shenyang Science and Technology Plan Project (F10 － 149 － 9 － 31)．
［作者简介］ 陈振军，硕士，主任医师，硕士生导师．
* 通信作者(Corresponding author)． Tel:024 － 22824430，E － mail:szchenzhenjun@ 163． com
［Abstract］ Objective To observe the inhibitory effects of pseudolaric acid B (PAB)on the proliferation of rat glioma C6 cells
in vivo and in vitro． Methods MTT assay was used to examine the inhibitory effect of 0，0． 1，0． 2，0． 4，0． 8，1． 6，8，and 16 μg /
ml PAB on C6 cells;the distribution of cell cycle was determined by flow cytometry． C6 cells were injected subcutaneously to establish
glioma － bearing rat model and the tumor volume was measured． The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)was
detected immunohistochemically in the implanted glioma． Results In vitro results showed that PAB inhibited C6 cell growth in a dose
－ dependent manner，with the IC50 being 0． 03 μg /ml． It also arrested the cells in G2 /M phase． In vivo results showed that the tumor
size of PAB group was decreased compared with the control group;moreover，PCNA expression was also decreased by PAB．
Conclusion PAB can inhibit rat glioma C6 cell growth，which might be associated with cell arrest in G2 /M phase and down －
regulation of PCNA expression．
［Key words］ pseudolaric acid B;glioma;cell proliferation;proliferating cell nuclear antigen
［Acad J Sec Mil Med Univ，2012，33(5) :484 － 487］
脑胶质瘤是中枢神经系统肿瘤，其恶性程度高，
具有向周围组织浸润性生长的特征，与正常脑组织
无明显分界，因其较高的致死率成为众所周知的恶
性肿瘤。此肿瘤常常生长在中枢神经系统深部，目
前临床上采用的手术切除术和放射疗法对患者都具
有潜在的危险性，因此，寻找新的有效药物及治疗方
法尤为重要。
土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是从松科
植物金钱松的根皮中分离出的有效成分，现代药理
学实验研究表明，PAB具有明显的抗肿瘤活性，对胃
癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有抑制作
用［1 － 2］。本研究从体外和体内两方面探讨了 PAB
对胶质瘤的作用，为抗癌药物的研发提供了一条新
的思路。
1 材料和方法
1． 1 材料 F12K 培养液购自 AppliChem 公司，胎
牛血清和马血清购自 Hyclone 公司;大鼠胶质瘤 C6
细胞购自中国科学院上海细胞库;PAB 购自中国药
品生物制品检定所，批号 110880 － 200502，纯度 ＞
第 5 期．陈振军，等．土槿皮乙酸对大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖的抑制作用 · 485·
98%;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自 Sigma 公司;Wist-
ar大鼠，4 周龄，体质量 150 ～ 200 g，购自中国医科
大学实验动物中心;增殖细胞核抗原(proliferating
cell nuclear antigen，PCNA)抗体购自 Santa Cruz 公
司。
1． 2 细胞培养 大鼠胶质瘤 C6 细胞培养于含
10%胎牛血清、2% 马血清的 F12K 培养液中，在
37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。
1． 3 MTT法检测细胞增殖能力 将大鼠胶质瘤 C6
细胞以每孔 200 μl接种于 96 孔培养板，细胞密度为
每孔 104个，培养 12 h，使其充分贴壁，然后换为终浓
度分别为 0、0． 1、0． 2、0． 4、0． 8、1． 6、8、16 μg /ml PAB
的 F12K培养液培养，每个浓度设 5 个复孔，置 CO2
培养箱中孵育 36 h。每孔加入 5 mg /ml MTT 20 μl，
继续放入 5% CO2培养箱中染色 4 h，吸去上清，加入
200 μl DMSO 溶解细胞内形成的结晶，用酶标仪
(BioTek ELX － 800，USA)测定 490 nm 处光密度
(D)值，计算 PAB 对 C6 细胞的抑制率。抑制率
(%)=(空白孔 D 值 －实验孔 D 值)/空白孔 D 值
× 100%。
1． 4 碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期变化 以 0、
0． 15、0． 3、0． 6 μg /ml PAB 处理 C6 细胞 36 h 后，消
化、收集各组细胞，小心吸除上清，PBS 漂洗，70%乙
醇 4℃固定过夜，加入 PI 染色液，37℃避光温浴 30
min，进行流式细胞术检测，分析细胞周期变化
情况。
1． 5 C6 种植瘤大鼠模型的建立及给药 取健康雄
性 Wistar大鼠，在各大鼠右前肢皮下接种处于对数
生长期的 C6 细胞，每只 1 × 107个细胞。接种 C6 细
胞后，实验组Ⅰ灌胃给药 7 mg /kg(PAB)、实验组Ⅱ
灌胃给药 15 mg /kg(PAB)、实验组Ⅲ灌胃给药 30
mg /kg(PAB) ，对照组灌胃给予相应剂量的生理盐
水，每天 1 次，每组 10 只大鼠。20 d后，将对照组和
不同浓度梯度给药组大鼠皮下的细胞瘤完整取下，
拍照，测量肿瘤体积，设长径为 a，短径为 b，体积计
算公式为 a × b2 /2，而后用 10%甲醛溶液固定用于
免疫组化检测。
1． 6 免疫组化法检测种植瘤组织中 PCNA 的表
达 将对照组和各实验组大鼠种植瘤组织常规石蜡
包埋，5 μm 厚连续石蜡切片，微波加热修复，3%
H2O2阻断内源性过氧化物酶后，滴加 PCNA
(1∶50)抗体，4℃过夜，滴加二抗，37℃孵育 30 min，
DAB显色、苏木精复染，脱水、透明、封片，显微镜下
拍照，观察染色效果，呈棕黄色或黄色为阳性反应。
1． 7 统计学处理 采用 SPSS 16． 0 软件进行数据
分析，数据以 珋x ± s 表示，组间差异比较采用单因素
方差分析。检验水平(α)为 0． 05。
2 结 果
2． 1 PAB对大鼠胶质瘤细胞 C6 体外增殖的抑制作
用 图 1 所示为 PAB 对 C6 细胞增殖的抑制作用，
PAB作用于 C6 细胞 36 h 后，细胞增殖能力明显受
到抑制，当 PAB浓度为 0． 4 μg /ml时，增殖抑制率达
到 61． 4%，并且随着 PAB 浓度的增加，抑制率呈现
上升趋势。PAB处理 C6 细胞 36 h条件下的半数致
死剂量(IC50)值为 0． 30 μg /ml。
图 1 PAB作用 36 h对胶质瘤 C6 细胞
体外增殖的抑制作用
Fig 1 Inhibitory effect of pseudolaric acid B(PAB)
on proliferation of glioma C6 cells
after 36 h incubation in vitro
n = 5，珋x ± s
2． 2 PAB 对大鼠胶质瘤 C6 细胞周期变化的影
响 由图 2 可见，经 0． 15、0． 3、0． 6 μg /ml PAB 作用
36 h 后，G0 /G1期和 S 期细胞比例有所下降;G2 /M
期有所增加，分别由对照组的 7． 13% 增加至
31． 78%、57． 58%和 82． 46%;同时，G0 /G1期前出现
凋亡小峰，说明 PAB可使 C6 细胞周期阻滞于 G2 /M
期，同时诱导 C6 细胞凋亡，0． 15 μg /ml PAB 作用下
细胞凋亡比例为 8． 23%。
2． 3 PAB对大鼠种植瘤的抑制效应 PAB 给药后
大鼠种植瘤体积变化如图 3 所示，对照组肿瘤体积
为(1． 003 ± 0． 36)cm3，经 7、15 和 30 mg /kg PAB 给
药治疗后，肿瘤体积(cm3)分别降低至(0． 381 ±
0． 06)、(0． 218 ± 0． 08)和(0． 326 ± 0． 09) ，与对照组
比较差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)。灌胃给药 15
mg /kg PAB 20 d，抑瘤率达到 78． 26%。
2． 4 各组大鼠种植瘤组织中 PCNA 的表达 对照
· 486· 第二军医大学学报 2012 年 5 月，第 33 卷
组种植瘤中可见棕黄色颗粒，PAB 治疗组中棕黄色
颗粒减少，说明与对照组相比，PAB治疗组大鼠种植
瘤中 PCNA表达呈下降趋势(图 4) ，表明 PAB 可降
低种植瘤组织中 PCNA高表达。
图 2 PAB对胶质瘤 C6 细胞作用 36 h后的细胞周期变化
Fig 2 Effect of pseudolaric acid B (PAB)on the cycle of glioma C6 cells after 36 h incubation
A:Control group;B:0． 15 μg /ml PAB group;C:0． 3 μg /ml PAB group;D:0． 6 μg /ml PAB group
图 3 大鼠种植瘤组织体积变化
Fig 3 Size of implanted glioma in rats of different groups
PAB:Pseudolaric acid B． A:Control group;B:7 mg /kg PAB group;C:15 mg /kg PAB group;D:30 mg /kg PAB group
图 4 大鼠种植瘤组织中 PCNA表达的免疫组化染色结果
Fig 4 Expression of PCNA by immunohistochemical method in implanted glioma in rats
PCNA:Proliferating cell nuclear antigen;PAB:Pseudolaric acid B． A:Control group;B:7 mg /kg PAB group;C:15 mg /kg PAB group;D:30 mg /
kg PAB group． Original magnification:× 400
3 讨 论
脑胶质瘤亦称神经胶质细胞瘤，由神经上皮组
织衍化而来，具有发病率高、病死率高和治愈率低的
特点，手术切除是当前最主要的临床治疗手段。由
于胶质瘤本身固有的浸润性生长的病理特点，手术
后的复发仍不可避免，采用安全有效的方法进行胶
质瘤的治疗成为亟待解决的问题［3 － 5］。天然药物单
体化合物可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞
分化或凋亡从而发挥抗肿瘤作用［6］。研究表明，
PAB可通过调节 Th1 和 Th17 平衡进行炎症疾病的
治疗［7］，同时可作为抗血管生成试剂治疗癌症［8］;可
通过促进微管蛋白解聚、干扰二极纺锤体形成、阻滞
有丝分裂等抑制人乳腺癌细胞 MCF － 7 增殖，促进
其凋亡［9］;同时，PAB还可通过 Chk － Cdc25C和 p53
途径诱导人黑素瘤细胞凋亡，抑制其增殖［10 － 11］;也
有报道发现 PAB 可通过上调 bax 和下调 bcl － 2 表
达，导致线粒体膜电位下降，激活 caspase，最终导致
胃癌细胞凋亡［12 － 13］。
本研究体外实验结果显示 PAB 可抑制大鼠胶
第 5 期．陈振军，等．土槿皮乙酸对大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖的抑制作用 · 487·
质瘤细胞 C6 增殖，同时，用流式细胞术分析经 PI 染
色的 C6 细胞，发现 G2 /M 期所占比例有所升高，说
明 PAB可诱导 G2 /M 期阻滞，从而达到抑制肿瘤细
胞增殖的作用。皮下注射 C6 细胞建立种植瘤 Wist-
ar大鼠模型并进行 PAB灌胃给药治疗，发现治疗组
肿瘤体积有所减小，说明 PAB 可有效抑制肿瘤发
展;并且，经免疫组织化学染色发现，PAB 治疗组中
PCNA表达量有所降低。PCNA参与调节肿瘤形成，
在 DNA合成和细胞增殖方面起重要作用［14］。综上
所述，PAB可抑制大鼠脑胶质瘤 C6 细胞增殖，阻滞
细胞周期中 G2 /M 期、下调 PCNA 的表达为其可能
的作用机制，但 PAB 对 C6 细胞生长影响的确切作
用机制还有待于进一步的深入研究。
4 利益冲突
所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
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［本文编辑］ 尹 茶