全 文 ：［文章编号］ 1000-4718(2014)04-0603-06
［收稿日期］2013-11-18 ［修回日期］2014-03-06
* ［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No． 81201671);吉林省教育厅资助项目(No． 2013347) ;吉林省卫生厅资助项目
(No． 2013Z203)
△通讯作者 Tel:0432-64560027;E-mail:qiling1718@ 163． com
越桔原花青素调控脑胶质瘤细胞生长的机制研究*
钟 越， 齐 玲△， 沈 楠， 王玮瑶， 田 晶， 王艳春
(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)
［摘 要］ 目的:探讨越桔原花青素对脑胶质瘤细胞生长的影响。方法:培养脑胶质瘤 C6 细胞，将其分为对
照组以及 10、20 和 40 μg /L越桔原花青素组，MTT法检测药物对 C6 细胞生长的影响，倒置显微镜观察细胞生长的
变化，Annexin V /PI染色检测细胞凋亡率的变化，免疫细胞化学法检测 Bcl-2 与 Bax蛋白表达，Western blotting检测
Bcl-2、Bax和 caspase-3 蛋白表达。结果:在 24、48 和 72 h时，10、20 和 40 μg /L 越桔原花青素均抑制 C6 细胞的生
长，24 和 48 h 时 40 μg /L 越桔原花青素组、72 h 时 20 和 40 μg /L 越桔原花青素组细胞生长明显受抑制
(均 P ＜ 0． 01);倒置显微镜观察发现，各药物组细胞密度随药物浓度升高而减少;Annexin V /PI 分析显示，细胞的
凋亡率亦随着药物浓度的增加而明显增加;细胞免疫组化结果显示，10、20 和 40 μg /L越桔原花青素组中，C6 细胞
表达 Bcl-2 蛋白减少，表达 Bax蛋白增加，但均无明显差异;Bax /Bcl-2 的比值随着药物浓度升高而增加(P ＜ 0. 05 或
P ＜ 0. 01);Western blotting结果显示，10、20 和 40 μg /L越桔原花青素组中，随着药物浓度升高，细胞表达 Bcl-2 蛋
白减少(P ＜ 0． 01)而 Bax和 caspase-3 蛋白表达均增加，Bax /Bcl-2 的比值也明显增加(P ＜ 0． 01)。结论:越桔原花
青素抑制脑胶质瘤 C6 细胞的生长，其作用机制与调控 Bax蛋白增加和 Bcl-2 蛋白减少，使 Bax /Bcl-2 比值增加，从
而激活 caspase-3，诱导凋亡发生有关。
［关键词］ 越桔原花青素;神经胶质瘤;Bax蛋白;Bcl-2 蛋白;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3
［中图分类号］ Ｒ739． 4 ［文献标志码］ A doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4718． 2014． 04． 005
Effect of Vaccinium vitis procyanidin on regulation of glioma cell growth
ZHONG Yue，QI Ling，SHEN Nan，WANG Wei-yao，TIAN Jing，WANG Yan-chun
(Jilin Medical College，Jilin 132013，China． E-mail:qiling1718@ 163． com)
［ABSTＲACT］ AIM:To explore the effect of Vaccinium vitis procyanidin on the growth of glioma cells． METH-
ODS:Glioma C6 cells were cultured and divided into control and 10，20 and 40 μg /L Vaccinium vitis procyanidin groups．
The influence of Vaccinium vitis procyanidin on the growth of C6 cells was measured by MTT assay and the observation un-
der inverted microscope． The apoptotic rate was detected by Annexin V /PI staining． The protein expression of Bcl-2 and
Bax was determined by immunocytochemistry． The protein levels of Bcl-2，Bax and caspase-3 were also examined by West-
ern blotting． ＲESULTS:The growth of C6 glioma cells was inhibited by Vaccinium vitis procyanidin at concentrations of
10，20 and 40 μg /L． The growth was significantly inhibited in 40 μg /L Vaccinium vitis procyanidin group at 24 h and 48
h，and in 20 and 40 μg /L Vaccinium vitis procyanidin groups at 72 h (P ＜ 0． 01)． The density of the cells was decreased
when the concentration of Vaccinium vitis procyanidin increased． The apoptotic rate was increased when the concentration of
Vaccinium vitis procyanidin increased either． The expression of Bcl-2 was decreased and Bax was increased after 10，20 and
40 μg /L Vaccinium vitis procyanidin treatments． The ratio of Bax /Bcl-2 was increased when the dose of Vaccinium vitis pro-
cyanidin increased (P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01)． The expression of Bcl-2 was decreased (P ＜ 0． 01)，and Bax and caspase-3
were increased after 10，20 and 40 μg /L Vaccinium vitis procyanidin treatments． The ratio of Bax /Bcl-2 was increased
when the dose of Vaccinium vitis procyanidin increased (P ＜ 0． 01)． CONCLUSION:Vaccinium vitis procyanidin inhibits
the growth of glioma cells by down-regulating Bcl-2 protein and up-regulating Bax protein to activate caspase-3，thus indu-
cing apoptosis．
［KEY WOＲDS］ Vaccinium vitis procyanidin;Glioma;Bax protein;Bcl-2 protein;Caspase-3
笃斯越桔(Vaccinium uliginosum Linn．)是我国 野生越桔的主要品种，在吉林省长白山地区分布最
·306·中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2014，30(4):603-608
广。笃斯越桔以富含原花青素(procyanidin，PC)著
称。研究发现原花青素具有抗压力、抗氧化、抗炎
症、抗动脉硬化、抗衰老、抗肿瘤及增强免疫功能等
多种生物学作用，且不良反应低［1-3］。越桔原花青素
抗肿瘤作用的研究较少，在脑胶质瘤中的作用尚未
见报道。本实验从多方面来研究越桔原花青素对脑
胶质瘤 C6 细胞生长的作用，并探讨其可能的机制。
材 料 和 方 法
1 材料
1． 1 细胞株 大鼠脑胶质瘤 C6 细胞株由吉林大学
基础医学院提供。
1． 2 主要试剂 越桔原花青素(南京苏朗医药科技
开发有限公司);ＲPMI-1640 细胞培养基 (HyClone);
小牛血清和 0． 25% 胰酶(Gibco);MTT 和 DMSO
(Sigma) ;Bcl-2、Bax、caspase-3 和 β-actin 抗体(北京
中杉公司)。
1． 3 仪器 J-26XP 超低温高速离心机(贝克曼公
司);超低温冰箱(MDF-U53V);PLUS 384 全自动酶
标仪(MDC);IX-70 型倒置式显微镜(Olympus) ;
DNA蛋白电泳系统(Bio-Ｒad);Image-Pro Plus 图像
分析管理系统 (Media Cybernetics)。
2 方法
2． 1 C6 细胞的培养 将 C6 脑胶质瘤细胞接种于
含 10%小牛血清的 ＲPMI-1640 培养基中，37 ℃、5%
CO2 及饱和湿度条件下进行培养，隔日换液 1 次。
2． 2 越桔原花青素对 C6 细胞生长的影响 取对数
生长期的 C6 细胞制成单细胞悬液，按 6 000 cells /
well密度将细胞接种于 96 孔板，置入 37 ℃、5% CO2
培养箱中培养。加入不同浓度越桔原花青素(0、10、
20 和 40 μg /L)，每个药物浓度设 5 个复孔，分别作
用 24、48 和 72 h后弃上清，再加入 MTT 20 μL 继续
孵育 4 h，弃上清后每孔加 DMSO 150 μL并振荡。同
时设空白对照组，测定各孔 570 nm 处的吸光度
(A570)值，细胞存活率(%)= A实验 /A对照 × 100%。
2． 3 观察 C6 细胞凋亡形态 按 5 000 cells /well 密
度将 C6 细胞接种于 24 孔板中，培养 24 h 待细胞贴
壁，加入不同浓度的越桔原花青素(0、10、20 和 40
μg /L)，设空白对照组。培养 72 h，倒置显微镜下观
察并拍照。
2． 4 凋亡率检测 取对数生长期的 C6 细胞，按细
胞浓度 2 × 108 /L接种于 6 孔板，每孔 2 mL。3 个实
验组均加入越桔原花青素，使其终浓度分别为 10、20
和 40 μg /L，空白对照组加入等体积的基础培养液，
置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，72 h 离心收集细
胞。PBS 洗涤 2 次，按照说明书操作，用 1∶ 4 binding
buffer 缓冲液 190 μL 重悬细胞，调整细胞浓度为(2
～ 5)× 108 /L，然后加入 FITC标记的 Annexin V-FITC
5 μL和 20 mg /L PI 10 μL，置冰上 10 min，流式细胞
术检测各样品中每 10 000 个细胞中细胞的凋亡率。
2． 5 免疫细胞化学法检测 Bcl-2 和 Bax 蛋白的表达
将 C6细胞按 1 × 104 cells /well 密度接种于置有玻
片的 24孔板中，实验设未加药物的对照组和越桔原花
青素(10、20和 40 μg /L)组，分别作用 72 h后，10%甲
醛溶液固定，灭活封闭，Bcl-2 和 Bax 抗体孵育过夜，Ⅱ
抗室温孵育 1 h，显色、脱水、透明后封片，选择 5 个不
同视野，采用 Image-Pro Plus 分析软件分析蛋白阳性
产物的积分吸光度值，取平均值进行统计分析。
2． 6 Western blotting 法检测 Bcl-2、Bax 和 caspase-3
蛋白的表达 取对数生长期的 C6 细胞，按细胞浓度
1 × 108 /L接种于 6 孔板中，每孔 5 mL。实验组加入
越桔原花青素，使其终浓度为 10、20 和 40 μg /L，作
用 72 h，每组设 3 个复孔，空白对照组加入基础培养
基。将细胞收至 1． 5 mL 离心管中，离心后弃上清，
PBS洗涤细胞，50 μL 细胞裂解液充分裂解细胞。
12 000 × g、4 ℃ 离心 15 min，留上清，测定样品蛋白浓
度，SDS-PAGE跑胶分离样品，转膜封闭，加入 β-actin、
Bcl-2、Bax和 caspase-3 抗体，4 ℃孵育过夜。Ⅱ抗室温
孵育 1 h，胶片曝光拍照。结果采用 Image-Pro Plus图
像分析管理系统分析，以特异性条带平均吸光度与
面积的乘积为有效值，反映蛋白表达的水平。
3 统计学处理
应用 SPSS 17． 0 统计软件处理，数据以均数 ±
标准差(mean ± SD)表示，组间比较采用单因素方差
分析(ANOVA)。以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
结 果
1 越桔原花青素对 C6 胶质瘤细胞生长的抑制作用
MTT结果显示，10、20 和 40 μg /L越桔原花青素
作用于 C6 胶质瘤细胞 24、48 和 72 h，均可以明显地
抑制细胞的生长。当越桔原花青素作用于 C6 细胞
24 和 48 h，40 μg /L 浓度组胶质瘤细胞的生长明显
地受到抑制，与空白对照组比较，差异有统计学意义
(P ＜ 0． 01);越桔原花青素作用于 C6 细胞 72 h，20
和 40 μg /L 浓度组胶质瘤细胞的生长亦明显受抑
制，与空白对照组比较，差异有统计学意义(均 P ＜
0． 01)，并且药物作用具有浓度依赖性，见图 1。
·406·
Figure 1． Effects of Vaccinium vitis procyanidin on the survival
rate of C6 glioma cells． Mean ± SD． n = 5． ＊＊P ＜ 0． 01
vs control group．
图 1 越桔原花青素对 C6 细胞生长的抑制作用
2 越桔原花青素抑制 C6 细胞生长的形态学观察
倒置显微镜下观察，10、20 和 40 μg /L越桔原花
青素作用于 C6 细胞 72 h，与空白对照组比较，各浓
度组培养瓶内贴壁细胞明显减少，并且随着药物浓
度的增高，细胞密度呈下降趋势，见图 2。
3 越桔原花青素对 C6 细胞的诱导凋亡作用
10、20 和 40 μg /L越桔原花青素作用于 C6 细胞
72 h后，AnnexinV / PI分析各用药组凋亡率分别为
Figure 2． Vaccinium vitis procyanidin inhibited the growth of C6
cells observed under inverted microscope (× 200)． A:
control group;B:10 μg /L group;C:20 μg /L group;
D:40 μg /L group．
图 2 越桔原花青素抑制 C6 细胞生长的形态学变化
(9． 98 ± 2． 75)%、(16． 57 ± 3． 43)% 和(17． 32 ±
3. 15)%，各组凋亡率均明显高于同期空白对照组
(3． 25 ± 1． 08)%，20 和 40 μg /L 浓度组差异有统计
学意义(P ＜ 0． 05)，且各用药组的凋亡率随着药物
剂量的增加而显著升高，见图 3。
Figure 3． Effects of Vaccinium vitis procyanidin on apoptosis of C6 glioma cells．
图 3 越桔原花青素对 C6 细胞凋亡的影响
·506·
4 C6 细胞凋亡相关蛋白的表达
免疫细胞化学结果显示，10、20 和 40 μg /L越桔
原花青素作用于 C6 细胞 72 h 后，C6 胶质瘤细胞表
达 Bcl-2 蛋白随着药物浓度升高而减少，而表达 Bax
蛋白增加，但均无明显差异。计算 Bax /Bcl-2 比值发
现，随着药物浓度升高，两者的比值明显升高，与空
白对照组比较，差异有统计学意义(P ＜ 0． 05 或 P ＜
0． 01)，且具有明显的剂量依赖性，见图 4。
Figure 4． The changes of Bcl-2 and Bax protein expression in C6 cells after treated with Vaccinium vitis procyanidin (PC)(× 200)．
Mean ± SD． n = 3． * P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs 0 μg /L group．
图 4 越桔原花青素作用后 C6 细胞 Bcl-2 和 Bax蛋白表达的变化
5 Western blotting结果
Western blotting结果显示，10、20 和 40 μg /L 越
桔原花青素作用于 C6 胶质瘤细胞 72 h后，细胞表达
Bcl-2 蛋白减少，与空白对照组比较，差异具有统计
学意义(P ＜ 0． 01)，并随着药物浓度升高，表达量逐
渐减少;细胞表达 Bax 蛋白也增加，与对照组比较，
各药物组差异均有统计学意义(均 P ＜ 0． 01)。检测
细胞表达 caspase-3 蛋白发现，各药物组细胞表达均
增加，与空白对照组比较，20 μg /L 越桔原花青素组
差异有统计学意义(P ＜ 0． 01)。计算 Bax /Bcl-2 结
果发现，与空白对照组比较，各药物组细胞的 Bax /
Bcl-2 均明显增加(P ＜ 0． 01)，见图 5。
讨 论
2007 年北京市首次发布《全市健康状况白皮
书》指出，恶性肿瘤第 1 次位居疾病死亡原因首位。
而脑肿瘤由于其地位的特殊性，成为严重威胁人类
健康的重大疾病之一。脑肿瘤大多数为胶质瘤，且
以恶性居多［4］，包括替莫唑胺在内的多种疗法对于
患者生存期延长的意义不大［5］。有研究表明，这是
由于在肿瘤发生过程中激活了肿瘤细胞的生长途径
和 /或抑制了肿瘤细胞的凋亡途径 ［6-8］。
肿瘤细胞在生长过程中由于凋亡信号转导通路
出现障碍，使它具有极强的生长能力。Bcl-2家族成
·606·
Figure 5． Changes of Bcl-2，Bax and caspase-3 protein expression after Vaccinium vitis procyanidin (PC)treatment in C6 glioma
cells． Mean ± SD． n = 3． ＊＊P ＜ 0． 01 vs 0 μg /L group．
图 5 越桔原花青素作用后 C6 胶质瘤细胞 Bcl-2、Bax和 caspase-3 蛋白的变化
员是肿瘤凋亡研究的热点，研究表明，在线粒体膜上
Bcl-2蛋白增多就会阻断Bax等促凋亡蛋白的诱导
凋亡作用，当降低 Bcl-2 蛋白表达时就会消除这种阻
遏作用，使 Bax 等激活，线粒体膜上大孔通道开放，
从而线粒体内细胞色素 C 等蛋白释放，促使凋亡发
生［9 － 10］。在肿瘤细胞内，当 Bax /Bcl-2 的比值增加也
会引起肿瘤细胞凋亡［11］。在凋亡途径中，caspase-3
是效应因子，是凋亡的执行者，当线粒体蛋白释放后
就会使 caspase-3 活化裂解，使凋亡得以进行［12］。
本实验研究了不同浓度的越桔原花青素对脑胶
质瘤细胞生长的作用，MTT 结果显示，10、20 和 40
μg /L越桔原花青素作用 24、48 和 72 h，均可以明显
地抑制 C6 细胞的生长，并且随着药物浓度的升高，
细胞生长受抑制更加明显;如果增加药物作用的时
间，也可以增加细胞生长的抑制作用(图 1)。当在
倒置显微镜下观察 10、20 和 40 μg /L 越桔原花青素
作用于 C6 细胞 72 h，与空白对照组比较，各药物组
细胞的密度随着药物浓度的升高而降低(图 2)。以
上这些结果提示，越桔原花青素可以抑制胶质瘤细
胞的生长，且这种作用具有剂量依赖性。流式分析
术分析其凋亡率发现，神经球的凋亡率亦随着药物
浓度的增加而明显增加，也呈现明显的剂量效应(图
3)。这说明越桔原花青素可能诱导 C6 细胞凋亡而
抑制胶质瘤细胞的生长，但机制不清。
为了研究诱导胶质瘤细胞凋亡使生长受抑制的
机制，本实验继续研究 Bcl-2、Bax 和 caspase-3 等相
·706·
关凋亡蛋白的表达，细胞免疫组化和 Western blotting
结果表明，10、20 和 40 μg /L 越桔原花青素作用于
C6 细胞 72 h 后，细胞表达 Bcl-2 蛋白减少而表达
Bax蛋白增加，Bax /Bcl-2 的比值随着药物浓度升高
而升高，并且细胞表达 Bcl-2 蛋白减少呈现浓度依赖
性(图 4、5)。进一步检测细胞表达 caspase-3 蛋白发
现，各药物组细胞表达 caspase-3 蛋白均增加，与空白
对照组比较，20 μg /L越桔原花青素组差异有统计学
意义(P ＜ 0． 01)。并且由于越桔原花青素作用于 C6
胶质瘤细胞后，通过线粒体路径促使凋亡发生过程
中，caspase-3 活化是凋亡的下游事件，所以可能导致
Bax /Bcl-2 的结果与之不完全平行。
以上实验结果说明，越桔原花青素可以抑制胶
质瘤细胞的生长，并且通过上调促凋亡蛋白 Bax 表
达、下调 Bcl-2 表达，使 Bax /Bcl-2 的比值升高，增加
促凋亡因素，最后促进下游效应因子 caspase-3 的活
化增加，从而使肿瘤细胞凋亡。有研究显示，从葡萄
籽中提取出来的原花青素低聚物虽可以使 U87 胶质
瘤细胞死亡，但其主要不是通过凋亡途径来实现
的［13］，所以在越桔原花青素抑制胶质瘤细胞生长中
是否有其它作用机制还需进一步研究。
［参 考 文 献］
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