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华山松松塔提取物对人白血病、卵巢癌细胞增殖的影响
李春艳， 张 桢， 赖 泳， 刘 熙， 丁 云， 刘光明*
(大理大学药学与化学学院药理教研室，云南 大理 671000)
收稿日期:2014-12-30
基金项目:国家自然基金 (81102350，81260632) ;大理学院校级青年基金 (KYQN2009-40)
作者简介:李春艳 (1983—) ，女，硕士，讲师，研究方向为中药药效学。Tel: (0872)2257412，E-mail:lcyyanyan@ 126． com
* 通信作者:刘光明 (1953—) ，男，硕士，教授，研究方向为中药药效学。Tel: (0872)2257412，E-mail:lgm13330555378 @
126． com
摘要:目的 研究华山松松塔提取物体外对人慢性粒细胞白血病细胞 (K562)、卵巢癌细胞 (SKOV3)的影响。方法
采用 MTT法，观察华山松松塔提取物对 K562 细胞、SKOV3 细胞增殖的影响。结果 48 h，华山松松塔不同溶剂提
取物在 1 000 μg /mL时，对 K562 细胞、SKOV3 细胞均有抑制作用 (P ＜ 0. 05) ;72 h，华山松松塔石油醚提取物高剂
量下 (1 000 μg /mL)对 SKOV3 细胞无抑制作用，但对 K562 细胞有抑制作用 (P ＜ 0. 05) ;氯仿、乙酸乙酯、正丁醇
提取物在高剂量下均对 K562 细胞、SKOV3 细胞有抑制作用 (P ＜ 0. 05)。结论 华山松松塔氯仿、正丁醇、乙酸乙酯
提取物均具有抑制人慢性粒细胞白血病细胞、人卵巢癌细胞增殖的作用。
关键词:华山松松塔;提取物;抗肿瘤;K562;SKOV3
中图分类号:R285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)03-0668-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 03. 041
松科松属植物全世界约 100 种，分布于北半球直达北
极圈，在热带和亚热带地区只生于山地。我国有 22 种，
l0 个变种，另引进 16 种，2 个变种，合计 50 余种，分布
极广［1］。华山松松塔系松科 (Pinaceae)松属 (Pinus)
华山松 (Pinus armandii Franch．)植物的球果，可入药。
《本草纲目》记载，松塔具有祛痰、止咳平喘、祛风、润
肠、安神的功效［2］。近年来，国内外已有多位学者对不
同松科植物进行了研究。Sakagami H 等对日本五针松
(Pinus Parviflora)的化学成分和药理作用进行了研究，发
现日本五针松的木质素与糖的结合体具有抗肿瘤活
性［3-4］。Hiroshi Sakagami 等 发 现 赤 松 (Pinus densiflora
Sieb． et Zucc．) ，湿地松 (Pinus elliottii Engelm．) ，火炬松
(Pinus taeda L．) ，加勒比松 (Pinus caribaea Morelet)以
及樟子松 (Pinus sylvestris L． var． mongolica Litv．)松塔中
的木质素-糖复合物具有良好的体内抗肿瘤和抗菌活性［5］。
此外，樟子松松塔具有抗氧化及抗炎作用［6］。国内学者
的研究发现红松球果鳞片多糖具有一定的抗肿瘤活性［7］，
但未见对华山松塔抗癌活性的研究，故本实验以人慢性粒
细胞白血病细胞株和人卵巢癌细胞株为研究对象，初步探
讨采集于云南巍山县的华山松松塔的不同溶剂提取物是否
有体外抗肿瘤活性，为华山松松塔的药用开发及后续机制
研究提供理论依据。
1 材料与仪器
1. 1 材料 华山松松塔采自云南省巍山县，经大理学院夏从
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Vol． 38 No． 3
龙教授鉴定为松科 (Pinaceae)松属华山松 (Pinus arman-
dii Franch．)的果实 (松塔) ，样品存于大理学院药学院
生药教研室的标本室。取华山松松塔 10 kg，95%乙醇回
流提取 3 次，回收乙醇得到浸膏，加水悬浮，分别用石油
醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚 (收率
为 2. 05%)、氯仿 (收率为 0. 11%)、乙酸乙酯 (收率为
0. 08%)、正丁醇提取物 (收率为 1. 34%)。K562 (人慢
性粒细胞白血病细胞株)、SKOV3 (人卵巢癌细胞株) ，
均购自中国科学院昆明动物研究所。
1. 2 试剂 胎牛血清 (DMEM，美国 Gibco公司) ;0. 25%
胰蛋白酶、MTT (噻唑蓝)、100 × 双抗 (Sigma 公司) ;
DDP (顺铂) (粉针剂，山东罗欣药业股份有限公司) ;羟
乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES)和二甲基亚砜 (DMSO) ，购
自美国 Sigma公司;0. 22 μm微孔滤膜，购自美国 Millipore
公司。
1. 3 仪器 IX-7 型倒置相差显微镜 (日本 Olympus公司) ;
连续波长酶标仪 (美国 Bio-Tek公司) ;水套式 CO2 细胞培
养基 (美国 Thermo) ;YJ-1450 型无菌操作台 (苏州安泰空
气技术有限公司) ;ES-315 型高压灭菌器 (日本 Tomykogyo
公司) ;96 孔板 (香港 Nest公司)。
2 方法
2. 1 样品配制 华山松松塔提取物及 DDP 用含 10%灭活
FBS的 DMEM培养基超声溶解，0. 22 μm 微孔膜过滤，配
制成 1 g /L溶液。实验时，用含有 10%胎牛血清的 DMEM
稀释成梯度质量浓度。
2. 2 华山松松塔提取物对 K562 细胞增殖的影响［8］ MTT
比色法测定华山松松塔提取物对 K562 细胞增殖的影响。取
对数生长期的 K562 细胞，在 96 孔板细胞培养板上将 K562
细胞悬液与不同剂量华山松松塔提取物溶液混匀，终体积
为 100 μL，细胞密度为 1 × 105 /mL。每个梯度设置 3 个复
孔，同时设置阴性对照 (细胞对照，未加入药物)、空白
对照 (空白调零孔)及 DDP药物对照。37 ℃、5% CO2 条
件下分别培养 48、72 h 后，加入 20 μL /孔 MTT 溶液
(5 g /L) ，继续培养 4 h 后，吸走上清后，每孔分别加入
150 μL DMSO，待每孔紫色结晶溶解后，Bio-Tek 连续波长
酶标仪测定 48、72 h吸光度 (D)值。测定波长为570 nm，
并按下式计算按下式计算抑制率。
抑制率 = (1 －实验组平均吸光度值 /对照组平均吸光
度值) × 100%
2. 3 华山松松塔提取物对 SKOV3 细胞增殖的影响［8］ 取
对数生长期的 SKOV3 细胞，0. 25%胰酶消化后 1 × 105 /mL
密度接种于 96 板，每孔 100 μL。待细胞贴壁后，弃去上
清，加入华山松松塔提取物，其终剂量分别为 1 000、250、
62. 5、15. 63、3. 91、0. 98 μg /mL，每个梯度设置 3 个复
孔，同时设置阴性、空白及 DDP 药物对照。37 ℃、5%
CO2 条件下分别培养 48、72 h 后，加入 20 μL /孔 MTT 溶
液 (5 mg /mL) ，继续培养 4 h 后，弃去上清后，分别加入
150 μL /孔 DMSO，待紫色结晶溶解后，Bio-Tek连续波长酶
标仪测定 48、72 h 吸光度 (D)值，测定波长为570 nm。
抑制率计算方法同“2. 2”项。
3 统计学方法
实验数据均采用 SPSS 18. 0 统计软件进行处理，数据
以 x ± s 表示，各组数据进行 t 检验。多组间均数比较首先
采用方差齐性检验后用单因素方差分析 (one-way ANVOA)
进行统计学分析。
4 结果
4. 1 华山松松塔提取物对 K562细胞的作用 华山松松塔提
取物与 K562细胞共同孵育 48 h后，对 K562细胞增殖的影响
见表 1。4个华山松松塔提取物中，高剂量下 (1 000 μg /mL)
正丁醇提取物对 K562 细胞增殖的抑制作用较好 (与阴性
对照组比较，P ＜ 0. 01) ;石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物
在 1 000 μg /mL 时，对 K562 细胞增殖的抑制率分别为
20. 27%、34. 80%、25. 10%。72 h 时，华山松松塔提取物
对 K562 细胞的抑制率在高剂量下均比 48 h 大，抑制作用
增强。正丁醇提取物在 72 h高剂量下仍表现出很好的抑制
作用，其抑制率为 88. 94%。石油醚、氯仿、乙酸乙酯提
取物的抑制率 (1 000 μg /mL 时)分别为 30. 55%、
55. 25%、50. 25%。随着作用时间的延长，平行剂量下的
抑制作用均比 48 h 强，可见华山松松塔提取物对 K562 细
胞增殖的抑制最佳时间为 72 h。
表 1 作用 48、72 h时华山松松塔不同提取物对 K562 细胞增殖作用的影响 (x ± s，n =3)
组别
剂量 /
(μg·mL －1)
48 h抑制率 /% 72 h抑制率 /%
石油醚 氯仿 正丁醇 乙酸乙酯 石油醚 氯仿 正丁醇 乙酸乙酯
阴性对照组 － 0. 00 ± 0. 36 0. 00 ± 0. 26
顺铂组 3. 91 61. 43 ± 0. 02＊＊ 55. 99 ± 0. 02＊＊
华山松松 1 000 20. 27 ± 7. 05* 34. 80 ± 0. 94* 80. 17 ± 5. 72＊＊ 25. 10 ± 4. 52* 30. 55 ± 4. 40* 55. 25 ± 1. 39＊＊ 88. 94 ± 3. 20＊＊ 50. 52 ± 4. 17＊＊
塔提取物组 250 5. 02 ± 7. 91 18. 39 ± 0. 79 7. 18 ± 7. 36 19. 97 ± 3. 88 5. 08 ± 1. 83 47. 67 ± 1. 89＊＊ 26. 60 ± 2. 52* 48. 93 ± 1. 46＊＊
62. 5 4. 76 ± 6. 79 0. 00 ± 2. 67 0. 00 ± 5. 11 15. 54 ± 4. 30 1. 32 ± 4. 60 25. 75 ± 1. 15 9. 47 ± 9. 01 45. 98 ± 4. 86＊＊
15. 63 4. 60 ± 7. 07 0. 00 ± 2. 71 0. 00 ± 8. 90 8. 94 ± 5. 73 0. 00 ± 2. 35 5. 98 ± 2. 96 6. 08 ± 0. 21 17. 84 ± 3. 92
3. 91 0. 00 ± 8. 33 0. 00 ± 2. 91 0. 00 ± 6. 93 8. 55 ± 1. 28 0. 00 ± 2. 35 0. 00 ± 4. 03 0. 00 ± 3. 00 14. 89 ± 8. 64
0. 98 0. 00 ± 15. 88 0. 00 ± 4. 23 0. 00 ± 3. 73 8. 08 ± 4. 46 0. 00 ± 3. 43 0. 00 ± 1. 42 0. 00 ± 1. 82 4. 05 ± 3. 45
注:与阴性对照组比较，* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01
4. 2 华山松松塔提取物对 SKOV3 的作用 华山松松塔提
取 48 h对人卵巢癌细胞的抑制的作用见表 2。石油醚和正
丁醇在 (1 000 ～ 62. 5)μg /mL 时，对 SKOV3 细胞均表现
出抑制作用，与阴性对照组比较，P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01;氯
仿和乙酸乙酯提取物则在 (1 000 ～ 250) μg /mL 时对
SKOV3细胞有抑制作用。华山松松塔的 4 个提取物在 48 h
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高剂量下，对 SKOV3 增殖的抑制抑制率分别为 43. 71%、
22. 65%、39. 79%、31. 91%。72 h 后，石油醚提取物在高
剂量下 (1 000 μg /mL)对 SKOV3 无抑制作用，抑制率从
48 h的 43. 71%下降到 72 h的 14. 96%;氯仿提取物在高剂
量下仍表现出抑制作用，抑制率为 21. 64%，与 48 h 的抑
制率 22. 65% (1 000 μg /mL时)相差不大;正丁醇提取物
除在 0. 98 μg /mL时无抑制作用，其余剂量均表现出抑制作
用 (与阴性对照组比较，P ＜ 0. 05) ;乙酸乙酯提取物对
SKOV3增殖的影响在各剂量梯度下，随着作用时间的延长，
均有抑制作用 (与阴性对照组比较，P ＜ 0. 05)。
表 2 作用 48、72 h时华山松松塔提取物对 SKOV3 增殖作用的影响 (x ± s，n =3)
组别
剂量 /
(μg·mL －1)
48 h抑制率 /% 72 h抑制率 /%
石油醚 氯仿 正丁醇 乙酸乙酯 石油醚 氯仿 正丁醇 乙酸乙酯
阴性对照组 － 0. 00 ± 0. 42 0. 00 ± 0. 25
顺铂组 3. 91 79. 82 ± 0. 03＊＊ 69. 42 ± 0. 04＊＊
华山松松 1 000 43. 71 ± 3. 54＊＊ 22. 65 ± 9. 06* 39. 79 ± 4. 89* 31. 91 ± 2. 49* 14. 96 ± 3. 61 21. 64 ± 4. 16* 45. 56 ± 7. 95＊＊ 47. 04 ± 8. 12＊＊
塔提取物组 250 43. 21 ± 3. 91＊＊ 21. 26 ± 6. 31* 32. 73 ± 3. 07* 20. 87 ± 3. 16* 3. 56 ± 8. 25 16. 05 ± 1. 33 41. 17 ± 2. 95＊＊ 38. 02 ± 2. 24*
62. 5 38. 62 ± 3. 50* 15. 37 ± 1. 54 27. 63 ± 5. 53* 12. 01 ± 5. 99 2. 03 ± 0. 24 9. 59 ± 4. 21 25. 12 ± 5. 81* 37. 90 ± 3. 31*
15. 63 33. 93 ± 8. 59* 9. 18 ± 5. 36 23. 87 ± 9. 81* 11. 94 ± 2. 22 0. 00 ± 3. 97 4. 21 ± 7. 04 24. 01 ± 1. 82* 36. 54 ± 4. 83*
3. 91 10. 68 ± 0. 74 0. 00 ± 2. 29 14. 49 ± 6. 03 2. 55 ± 3. 26 0. 00 ± 5. 46 0. 00 ± 9. 82 22. 72 ± 3. 62* 27. 41 ± 6. 21*
0. 98 10. 18 ± 0. 67 0. 00 ± 7. 07 8. 86 ± 8. 46 0. 00 ± 5. 74 0. 00 ± 5. 71 0. 00 ± 3. 95 14. 63 ± 9. 36 21. 91 ± 7. 01*
注:与阴性对照组比较，* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01
5 讨论
近年来，我国白血病的发病呈逐渐上升态势。白血病
是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，受累细胞 (白血
病细胞)出现增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，大量蓄积
于骨髓和其他造血组织，从而抑制骨髓正常造血功能并浸
润淋巴结、肝、脾等组织器官。根据白血病的分化程度和
自然病程，一般分为急性和慢性两大类。急性白血病
(acute leukemia，AL)的分化停滞于早期阶段，多为原始
细胞和早期幼稚细胞，病情发展迅速，自然病程仅数月;
慢性白血病 (chronic leukemia，CL)的分化停滞于晚期阶
段，多为较成熟细胞和成熟细胞，病情相对缓慢，自然病
程可达数年。根据受累的细胞系，AL可分为急性髓系白血
病 (acute myeloid leukemia，AML)和急性淋巴细胞白血病
(acute lymphoblastic leukemia，ALL) ;CL 分为慢性髓系白
血病 (chronic myeloid leukemia，CML，惯称慢粒)和慢性
淋巴细胞白血病 (chronic lymphoblastic leukemia，CLL)［9］。
慢性粒细胞白血病 (chronic myelogenous leukemia，CML)
是我国慢性白血病中常见的一种类型，可发生于各年龄人
群。Bcr /Abl蛋白抑制剂依马替尼 (IM)是目前治疗慢性
粒细胞白血病的靶点药，虽取得一定效果［10］，但存在原发
及继发耐药等问题。对于复发难治患者，大多数还需接受
细胞毒药物联合化疗。而细胞毒药物的严重毒副作用不但
削弱了患者接受治疗的顺应性，还会严重影响患者生活质
量，甚至继发其他肿瘤［11］。因此，具有抗肿瘤作用且毒副
作用较小的一些非细胞毒药物引起学者们的关注。在本实
验中讨论了华山松不同溶剂提取物对 K562 细胞增殖的影
响，在 48 h时，华山松松塔不同溶剂提取物高剂量下均对
K562 细胞有抑制作用，其中华山松松塔正丁醇提取物在
高剂量下对 K562 细胞增殖的抑制作用较好。72 h 时，随
着华山松松塔提取物与 K562 细胞作用时间的延长，各提
取物平行剂量下对其的抑制作用也相应加强，同样，华山
松松塔正丁醇提取物对 K562 细胞增殖的抑制表现出较好
的作用。
卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，其死亡率
居女性生殖系统肿瘤首位。由于位于盆腔深部，缺乏有效
的早期筛查方法，当患者出现明显症状时，疾病多已处于
晚期，已成为严重威胁妇女生命和健康的主要肿瘤，应高
度警惕［11］目前卵巢癌的标准治疗方案是以手术为主，辅以
术后化疗的联合治疗，手术可行肿瘤细胞减灭术，目的是
尽最大努力切除卵巢癌之原发灶和转移灶，使残余肿瘤直
径小于 1 cm。也可先行新辅助化疗，减少肿瘤负荷，提高
手术质量［12］。卵巢癌术后化疗首选紫杉醇加铂类药物，但
逐渐出现的化疗耐药已成为影响卵巢癌临床治疗效果的重
要障碍［13］。中医药在卵巢癌的治疗中发挥着积极的作用，
在术后及放，化疗过程中配合中医药治疗能扶助正气，保
护脾胃功能，提高机体免疫力，降低化疗带来的毒副反应，
减少并发症，提高生活质量及生存期［14］。对华山松的药理
活性研究中，发现华山松籽油有降低 TC、LDL-C 及升高
HDL-C的作用［15］，华山松松塔中的多糖成分具有体外抑制
HIV活性［16］。但未见对华山松松塔抗肿瘤活性的报告，故
本文讨论华山松松塔 4 个提取物对人卵巢癌增殖的影响。
48 h时，华山松松塔不同溶剂提取物高剂量下对 SKOV3 均
表现出抑制作用 (与阴性对照组比较，P ＜ 0. 05) ，到 72 h
时，华山松松塔石油醚提取物对 SKOV3 细胞的增殖无抑制
作用，华山松松塔氯仿提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇
提取物对 SKOV3 细胞仍表现出抑制作用，其中华山松松塔
乙酸乙酯提取物 72 h的抑制作用较好。
中医药在治疗肿瘤方面，积累了丰富的经验，且疗效
显著，无明显不良反应，具有多靶点，多部位，多途径，
多效应的作用。通过实验发现华山松松塔 4 个不同溶剂提
取物中，在 48 h和 72 h时，对 K562 细胞抑制作用较好的
是华山松松塔正丁醇提取物;对 SKOV3 的抑制，48 h时华
山松松塔石油醚提取物表现出较好的抑制作用，而 72h 时
则是华山松松塔乙酸乙酯提取物抑制作用好。华山松松塔
提取物后续抗肿瘤机制的研究，除对有效成分进一步分离，
提取，纯化得到活性单体外，还应结合细胞实验中得出的
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数据，从整体药效学确证及分子药理学实验出发，寻找新
的分子作用靶点，为肿瘤临床开发出生物活性高且低毒的
新型中成药及中药靶向干预卵巢癌，人慢性粒性白血病和
其他实体瘤打下坚实的基础。
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2016 年 3 月
第 38 卷 第 3 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
March 2016
Vol． 38 No． 3