全 文 ：书第 32 卷 第 4 期
2016 年 8 月
哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报(自然科学版)
Journal of Harbin University of Commerce (Natural Sciences Edition)
Vol． 32 No． 4
Aug． 2016
收稿日期:2015 － 09 － 02．
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531625);黑龙江省自然科学基金面上项目(H2015044) ;黑龙江中医药大学研究生创新科
研项目(2015)
作者简介:崔明宇(1971 －)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向:中药活性成分及其药物动力学研究．
蓬子菜香叶木苷对大鼠细胞色素 P450 酶活性影响
崔明宇，王美薇，杨 柳，陈婷婷，孙 爽
(黑龙江中医药大学 药学院 哈尔滨 150040)
摘 要:考察香叶木苷对大鼠细胞色素 P450 酶活性的影响． SD大鼠 12 只，雌雄各半，随机分为 2 组，
分别为空白对照组与香叶木苷给药组(300 mg /kg)，连续灌胃 7 d，于给药结束后次日制备肝微粒体，
采用 CO还原差示光谱法、紫外分光光度法测定大鼠细胞色素 P450 酶的质量浓度．香叶木苷给药组
肝微粒体酶质量浓度明显高于空白对照组，组间差异 P ＜ 0． 05，差异显著．香叶木苷对大鼠肝微粒体
P450 酶具有诱导作用．
关键词::蓬子菜;香叶木苷;细胞色素 P450 酶
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:A 文章编号:1672 － 0946(2016)04 － 0406 － 03
Effect of diosmin from Galium verum L． on activity of cytochrome
P450 enzymes in rat liver microsomes
CUI Ming-yu，WANG Mei-wei，YANG Liu，CHEN Ting-ting，SUN Shuang
(School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:To study the effect of diosmin on the activity in rat cytochrome P450 enzyme twelve
SD rats were randomly divided into two groups，half male and half female． The blank control
group and diosmin administration group (300 mg /kg)were administered by intragastric for
seven days in a row． The extracts of the liver tissues of rats were in preparation of micro-
somes． The activity of total CYP450 was determined by the reduction of CO difference spec-
troscopy and spectrophotometer method． Ｒesults indicated that compared with blank control
group，contents of CYP450 enzyme were increasing obeviously in diosmin group (P ＜ 0．
05)． Diosmin could induce the CYP450 enzyme in the liver tissues of rats．
Key words:Galium verum L;diosmin;cytochrome P450 enzymes
蓬子菜为茜草科拉拉藤属植物蓬子菜(Galium
verum L．)的干燥全草，民间常作为活血化瘀药使
用．香叶木苷(diosmin)是从蓬子菜中分离得到的
黄酮苷类化合物，是蓬子菜活血化瘀作用的主要活
性成分．临床用于肛门常见疾病、下肢慢性静脉功
能不全、手术后水肿、糖尿病并发症、前列腺增生等
疾病的治疗［1］．现代药理研究表明，香叶木苷具有
改善静脉通透性、增加静脉张力、改善微循环及诱
导分化肝癌细胞的作用［2］，在静脉系统疾病及抗
肿瘤方面具有很好的开发价值及应用前景．
药物对代谢酶活性的影响，是新药研究的重要
组成部分，也是保证临床合理用药的关键． 肝微粒
体中细胞色素 P450 酶是药物代谢中最重要的酶
系，可参与多数内源性物质与外源性药物的代谢，
同时药物对细胞色素 P450 活性的诱导或抑制作用
也是药物间相互作用的重要原因之一．本研究通过
测定给药后大鼠细胞色素 P450 酶质量浓度的变
化，探讨香叶木苷对细胞色素 P450 酶活性的影响，
以期为香叶木苷的新药研究及临床合理用药提供
参考，确保临床联合用药的安全与有效．
1 实验材料
1． 1 药品与试剂
香叶木苷对照品(Sigma 公司，质量分数≥
98%)，三羟甲基氨基甲烷(北京夏斯生物有限公
司) ，无水氯化钙(天津光复精细化工研究所)，磷
酸二氢钾(天津市凯通化学试剂有限公司)，氢氧
化钠(天津市瑞金特化学品有限公司)，连二亚硫
酸钠(天津基准化学试剂有限公司)，甘油(天津基
准化学试剂有限公司)，盐酸(天津市巴斯夫化工
有限公司)，BCA 试剂盒(碧云天生物技术公司)，
CO(哈尔滨春林气体厂)．
1． 2 实验仪器
低 温 高 速 离 心 机 (BeckMan coulter，
Allegra64Ｒ)，组织匀浆机(Sigma 公司 IKA，T10)，
酶标仪(SpectraMax Plus384)，紫外分光光度计
(ShimadzuUV －260)．
1． 3 实验动物
SD大鼠(200 ± 20)g，雌雄各半，由黑龙江中医
药大学实验动物中心提供，合格证:黑动字第
P00101006．
2 方法与结果
2． 1 溶液的配制
2． 1． 1 磷酸盐缓冲液(pH7． 4)
取磷酸二氢钾 1． 36 g 加 0． 1 mol /L 氢氧化钠
溶液 79 mL，用水稀释至 200 mL，即得．
2． 1． 2 氯化钙溶液(88 mmol /L)
精密称取无水 CaCl2 4． 88 g，加入蒸馏水至
500 mL定容．
2． 1． 3 100 mmolTris － HCl缓冲液
0． 2 mol /LTris 溶液 250 mL 加入 0． 2 mol /L
HCl10 mL 再加 5． 59 gKCl 粉末加水至 500 mL 定
容．
2． 2 分组及给药
取 SD大鼠随机分为 2 组，分别为空白对照组
及香叶木苷给药组，于实验室适应性喂养 1 周，香
叶木苷给药组每天灌胃给予香叶木苷(300 mg /
kg)，空白对照组灌胃给予等剂量的 CMC － Na 溶
液，连续灌胃给药 7 d，最后一次给药后禁食 12 h．
2． 3 大鼠肝微粒体的制备
将连续给药 7 d并禁食 12 h 后的大鼠断头处
死，迅速剖开大鼠腹部，进行肝门静脉插管，以预冷
的生理盐水灌流肝脏，清除肝中淤血直至变为蜡黄
色为止，取出肝脏，置冰浴冷却的生理盐水中，除去
肝脏表面血渍，并以滤纸吸干水分． 将洗净的肝脏
以 Tris － HCl缓冲液反复清洗后，将大鼠肝组织剪
成碎片，以 4 倍肝组织重量的 Tris － HCl 缓冲液在
冰浴中制成匀浆，将得到的匀浆液转移至离心管
中，于冷冻离心机中离心 20 min 后弃去沉淀(4
℃，14 000 r /m)，取上清液，上清液即为线粒体后
上清液(S9)［3 － 4］． 取线粒体后上清液以每毫升加
入 0． 1 倍体积氯化钙溶液 (88 mmol /L)的比例混
合，置冰浴中 5 min，期间轻轻振摇几次，然后在 4
℃、27 000 r /m下离心 20 min，去除上清液，剩余下
层沉淀物再用 Tris － HCl缓冲液混合，于 27 000 r /
m离心 20 min(4 ℃)，得到的下层悬浮物即是大鼠
肝微粒体悬液，－ 70 ℃低温保存．
2． 4 肝微粒体总蛋白质量浓度的测定
2． 4． 1 血清蛋白标准曲线制备
取 0． 8 mL 蛋白标准配制液加入蛋白标准(20
mg BSA)中，充分溶解后得到 25 mg /mL 的蛋白标
准溶液． 取适量 25 mg /mL 蛋白标准溶液，稀释至
终质量浓度为 0． 5 mg /mL．按 50 体积 BCA 试剂 A
加 1 体积 BCA 试剂 B(50∶ 1)配制适量 BCA 工作
液，充分混匀．将标准蛋白液用生理盐水稀释得一
系列质量浓度的标准蛋白储备液，于 562 nm 处测
吸光度，以吸光度对蛋白质质量浓度进行线性回
归，制备牛血清白蛋白标准曲线．
2． 4． 2 肝微粒体总蛋白质量浓度的测定
将大鼠肝微粒体混悬液稀释一定的倍数，取稀
释后的混悬液 20 μL 加 200 μL BCA 工作液混匀，
室温放置 2 h 后在 562 nm 处测定吸光度，根据标
准曲线及稀释倍数计算肝微粒体混悬液中总蛋白
质量浓度［4 － 5］．
2． 5 肝微粒体 CYP450 酶质量浓度的测定
利用 Omura法测定肝微粒体 CYP450 酶质量
浓度，将已知蛋白质量浓度的肝微粒体样品以 KCl
－磷酸缓冲溶液稀释至 0． 5 mg /mL，分别取 2． 0
mL置于样品池和参比池，在 400 ～ 500 nm 全波段
扫描;另取少量连二亚硫酸钠，轻微搅拌，2 min 后
等分到样品池和参比池中，缓慢向样品池中通入
CO 1 min，室温下放置 3 min 后放入检测区域，测
定 450、490 nm处的吸光度值(n = 6)．
3 实验结果
3． 1 牛血清蛋白标准曲线
·704·第 4 期 崔明宇，等:蓬子菜香叶木苷对大鼠细胞色素 P450 酶活性影响
以蛋白质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘
制标准曲线，得线性回归方程为:A = 0． 688 9C +
0． 110 1(Ｒ2 = 0． 996 6)，结果表明牛血清白蛋白在
0 ～ 0． 5 mg /mL 范围内线性关系良好，符合大鼠肝
微粒体质量浓度测定的要求．
3． 2 肝微粒体 CYP450 酶质量浓度测定结果
酶质量浓度测量正常对照组平均为 0． 193 ±
0． 00 6，香叶木苷给药组平均为 0． 324 7 ± 0． 062 4，
组间差异检验 P = 0． 023 ＜ 0． 05，差异显著，说明香
叶木苷给药组酶质量浓度高于正常对照组．
表 1 香叶木苷给药组、空白对照组 P450
酶质量浓度与蛋白质量浓度
测量指标
正常对照组
(n = 6)
香叶木苷给药组
(n = 6)
P
P450 0． 193 ± 0． 007 6 0． 324 7 ± 0． 062 4 0． 023*
蛋白质量浓度 2． 8696 ± 0． 126 1 2． 125 5 ± 0． 472 8 0． 047
注:* P ＜ 0． 05
图 1 香叶木苷给药组和正常对
照组 P450 酶质量浓度差异
4 讨 论
细胞色素 P450 是肝微粒体中最重要的混合功
能氧化酶，可参与激素、脂肪酸等内源性物质及药
物、前致癌物、前毒物等外源性物质的代谢过程，其
催化活性取决于酶的质量浓度水平，故可从酶质量
浓度的变化推断酶活性被诱导或抑制．本研究初步
考察了香叶木苷对大鼠肝微粒体 CYP 450 酶系的
影响，通过观察连续给药七天后，香叶木苷给药组
和空白对照组酶质量浓度的变化，判断香叶木苷对
P450 酶活性的影响．结果表明，香叶木苷给药组可
明显提高大鼠肝微粒体总 CYP450 酶的质量浓度，
说明香叶木苷对大鼠肝微粒体 CYP450 酶活性有
诱导作用，同时对临床联合用药可能存在潜在的影
响．在此实验基础上，可进一步采用 cocktail 法探
讨香叶木苷对 CYP1A2、CYP3A4、CYP2A9 等与药
物代谢密切相关酶的影响，对提高临床联合用药水
平及阐明在代谢环节上发生的药物相互作用具有
重要意义．
参考文献:
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·804· 哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 32 卷