全 文 ：从喜树果中分离提纯喜树碱的工艺条件
赵东亮 ,郁建平＊
(贵州大学 生化营养研究所 , 贵州 贵阳　550025)
摘　要:探讨了用大孔吸附树脂从喜树果中提取 、纯化喜树碱的工艺。结果表明 , 以 70%乙醇为提取液 , 浓缩后
用饱和石灰水提取 ,提取液上 AB-8 树脂 ,洗脱条件经实验确定为用 pH=2 , 浓度为 90%的乙醇洗脱最佳。结
晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚(2∶3), 所得喜树碱纯度可达 98%,得率为 0.41‰。
关键词:喜树碱;大孔吸附树脂;提取分离;石灰水;纯化工艺
中图分类号:S792.990.8;Q946.88　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0457(2004)06-0493-04
Study on the method of separating and purifying camptothecin from the fruits of Camptotheca
acuminata
ZHAO Dong-liang , Y U Jian-ping＊(Institute of Biochemistry and Nutrition , Guizhou University , Guizhou ,
Guiyang 550025 , China)
Abstract:The optimal method for separation and purification of campto thecin with macroreticular resin from the fruits
of Camptotheca acuminata was reported.The results showed that camptothecin w as extracted from the fruits of
Camptotheca acuminata with 70% alcohol , the extracting solvent w as concentrated , the liquid w as ex tracted with sat-
urated limewater and the campto thecin was adsorbed by AB-8 resin.The campto thecin in resin was eluted with 90%
alcohol in pH=2 and the crystallizing agent is acetic ester/petroleum ether(2∶3).The content of camptothecin in the
product w as normally 98% and the productivity was 0.41‰.
Key words:camptothecin;macroreticular resin;ex tracting and separating;limewater;purifying technology
喜树碱(camptothecin ,A)、10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin ,B)、10-羟基脱氧喜树碱(10-
hydroxydeoxycamptothecin ,C)和甲氧基喜树碱(methyoxycampto thecin , D)等是我国南方的特有树种———
珙桐科喜树 Camptotheca acum inata Decne中所含的生物碱 ,已从喜树果中分离得到 20余种化合物 ,这些
化合物均有不同的生物活性 ,其中喜树碱和 10-羟基喜树碱等具有显著的抗癌活性 ,其作用机理为通过
抑制拓扑异构酶 Ⅰ来表现抗癌活性[ 1] 。喜树碱毒性较大 ,但以喜树碱为原料 ,合成出一系列的衍生物 ,从
中筛选出高效低毒的新化合物已成为获得新型抗癌药物的有效途径之一[ 2] 。同时喜树碱对牛皮癣亦具
有良好的治疗效果[ 3] 。
已报道的喜树碱提取工艺 ,以乙醇提取为最多 ,其次为酸水 、0.3%的 NaOH 、水煮等。纯化方法有直
接萃取再结晶 、大孔吸附树脂纯化等方法[ 4 ～ 8] 。比较而言 ,以乙醇为提取溶剂提取率较高 ,大孔吸附树脂
纯化为最好。但目前所报道的方法大多存在得率低 ,成本较高的问题。本文首次探讨了石灰水在提取纯
化喜树碱中的作用 ,结果表明 ,用石灰水处理后得率大大提高 ,并减少了大孔吸附树脂再处理的步骤 ,使喜
收稿日期:2004-11-12;修回日期:2004-12-01
作者简介:赵东亮(1974-),男 ,湖南人 ,贵州大学生化所硕士研究生 ,研究方向为活性成分分离及检测技术。
＊　通讯作者
山 地农业 生物 学报　23(6):493 ～ 496 , 2004
Journal of Mountain Agriculture and Biology
DOI :10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2004.06.007
树碱的生产更经济。现将结果报告如下:
1　材料与方法
1.1　材料和仪器
喜树果于 2003年 11月采自贵州大学 ,粉碎过 60目筛备用 。
色谱用甲醇为色谱纯 ,展层剂试剂为分析纯 ,实验用乙醇为医用乙醇 ,其余试剂为工业级 。喜树碱对
照品购自北京中西公司(喜树碱HPLC 纯度 99.1%,10-羟基喜树碱 HPLC 纯度 98.9%)。
高效液相色谱仪为岛津 L-3A 型;紫外检测器;色谱柱 C18柱(250mm ×4.6mm , 5μ);QY-20三用
紫外分析仪;LD4-2低速离心机;普析通 TU-1901双光束紫外可见分光光度计。
1.2　实验方法
1.2.1　喜树碱含量的测定方法(HPLC法)
1.2.1.1　喜树碱标准液的配制　精密称取喜树碱对照品 2.0mg 于 100mL 的容量瓶中 ,以 50%的甲醇溶
解 ,稀释至刻度 ,摇匀备用 。
1.2.1.2　色谱条件　流动相∶甲醇-水(1∶1);流速:0.6mL·min-1;检测波长:254nm;进样量 10μL。
1.2.1.3　标准曲线的绘制　分别吸取喜树碱标准液 1mL , 2mL ,3mL , 4mL , 5mL , 6mL , 7mL ,8mL , 9mL
于10mL容量瓶中 ,用50%的甲醇稀释至刻度 ,摇匀。分别取稀释后对照品液及原液10μL ,按上述色谱条
件进样 , 每样重复 3 次 ,取峰面积平均值 ,得峰面积(Y)与喜树碱浓度(X)的线性回归方程:Y =1
554.26X -1 107.53 , r=0.999 5 。
1.2.1.4　喜树碱含量测定　称取 5g 喜树果粉(60目 ,自然晒干粉碎 ,含水 10%)于 100mL 锥形瓶中 ,加
60mL 、40mL 80%的乙醇 ,超声萃取 2 次 ,每次萃取 3h ,合并萃取液 ,定容到 100mL ,将提取液在 4 000
r·min-1的条件下离心 12min ,取清液 10μL 进行色谱分析 ,重复 3次 ,取平均值 ,代入回归方程 ,计算得含
量为 0.786‰。
1.2.2　喜树碱的提取与纯化
1.2.2.1　喜树碱的提取方法　文献报道的用乙醇提取最佳方法有 70%、80%、60%3种 ,本文在实验时不
考虑温度的影响 ,以 50%、60%、70%、80%的乙醇为提取溶剂进行提取 , HPLC 分析表明 ,提取率分别为
88.2%、84.7%、89.6%、88.9%,提取液中喜树碱的含量分别为 10.8%、11.3%、13.6%、13.5%。实验结
果表明 ,4种提取溶剂以 70%为最佳 ,所以本实验以 70%的乙醇为提取溶剂 ,提取 3次 ,每次乙醇用量为
料液比 1∶2为佳 。
1.2.2.2　喜树碱的纯化方法　采用 70%的乙醇浸提 ,提取液浓缩回收乙醇后 ,加 8倍量饱和石灰水 ,搅
拌 30min过滤 ,滤液调 pH 值 8 ～ 9后上 AB-8树脂柱 ,自来水洗涤后 ,用 pH 2 ～ 3的 90%的乙醇洗脱 ,浓
缩至悬浊后 ,用乙酸乙酯萃取 ,萃取液浓缩至析出固体 ,结晶得喜树碱粗品 ,粗品喜树碱用乙酸乙酯∶石油醚
(2∶3)溶解后重结晶得纯品 。
2　结果与讨论
2.1　提取液中喜树碱的分析
本实验喜树果用量为 1kg ,得乙醇提取液约 10.51L;经HPLC 分析及计算 ,提取液中喜树碱的含量约
为 55.9μg·mL-1 ,共约 0.629g ,提取率为 80%左右。
2.2　浓缩液的分析及处理
浓缩至无乙醇后 ,得浓缩液 1.22L ,将浓缩液在 4 000r·min-1的条件下离心 8min ,得清液 1.19L ,经
HPLC分析 ,清液中喜树碱的浓度为 375.7μg·mL-1 ,共约 0.447g ,由此可以看出 ,清液中的喜树碱只有所
提取的 71%左右 ,还有约 29%混在固体物中 。由于喜树碱为弱极性物质 ,不溶或微溶于水 ,浓缩液中的喜
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树碱为协同溶解所致 ,所以只用清液上柱则得率必然降低;而喜树碱在碱性条件下可开环成盐而溶于水 ,
酸性条件下又可重新生成喜树碱 ,所以可在浓缩液中加碱 ,使混在固体中的喜树碱溶解出来;再者钙离子
可以使有机酸类 、甙类 、氨基酸生成沉淀 ,因此往浓缩液中加入饱和的石灰水 ,有利于喜树碱的溶出 ,同时
也有利于杂质的去除 。经实验 ,第一次往浓缩液中加入 8倍量的石灰水 ,搅拌 30min ,第二次加入 2倍量
的石灰水 ,可使石灰水中的喜树碱达乙醇初提时的 93%。
2.3　吸附树脂的选择
对D-101 、AB-8 、GDX-501 、DM-130 、NKA 5种树脂进行了动态吸附分析 ,结果表明 ,AB-8 和
DM-130为最好 ,每毫升树脂吸附量可达 60mL 处理液左右。本实验选用AB-8树脂 。
2.4　上柱条件的选择
本实验在常温下进行 ,将石灰水处理液调 pH值至 7 、8 、9 、10 、11 、12 、13上柱 ,结果见表 1 。
表 1　树脂吸附量及树脂颜色
Tab.1　The adsorbent content and colour of resins
pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11 pH 12 pH 13
吸附量(mL) 62 72 70 65 64 64 60
颜　色 ＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊＊＊ ＊＊＊
　　注:＊示颜色深浅情况;＊＊＊为最深。
从所用树脂吸附结果可知 ,pH 8 ～ 9为最好 ,pH 值过高 ,树脂吸附的杂质增多 ,洗脱困难 ,pH 为 7时 ,
清液出现浑浊 ,沉淀中有喜树碱 ,所以选用 pH 值 8 ～ 9为上柱条件 。
2.5　洗脱条件的选择
以有机溶剂萃取浓缩悬浊液为纯化方法 ,易于浓缩至悬浊液 ,故选用 90%的乙醇为洗脱液(只考虑洗
脱液的 pH值)。参照张红等[ 4]及本人实验结果 ,以 pH 2 ～ 3为最好 ,洗脱液的用量为 7倍树脂量 ,洗脱率
达 93%。
2.6　萃取溶剂的选择
将树脂洗脱液浓缩至悬浊状后 ,分别以乙酸乙酯 、95%的乙醇 、丙酮 、乙酸乙酯∶丙酮(1∶1)、乙酸乙
酯∶95%乙醇(1∶1)萃取 ,萃取液经HPLC 分析 ,结果见表 2 。
表 2　不同萃取剂对喜树碱的萃取情况
Tab.2　Extraction effects of camptothecin with different solvents
萃　取　剂 乙酸乙酯 95%的乙醇 丙　酮 乙酸乙酯∶丙酮(1∶1) 乙酸乙酯∶95%乙醇(1∶1)
喜树碱的含量(μg·mL -1) 981.5 1 054.3 1 047.1 1 002.6 1 008.8
喜 树 碱 的 含 度 (%) 23.1 10.8 14.0 16.3 15.9
　　由表 2可知 ,上述 5种萃取液的萃取能力相差不大 ,但含量以乙酸乙酯为多 ,所以本实验采用乙酸乙
酯为萃取剂。另外还用氯仿为萃取剂萃取 ,结果略好于乙酸乙酯 ,但考虑到氯仿的毒性较大 ,故未选用。
2.7　重结晶溶剂的选择
乙酸乙酯萃取液浓缩至刚析出固体 ,暗处放置 ,析出大量结晶 ,该结晶在乙酸乙酯中溶解较小 ,但可溶
于乙酸乙酯∶石油醚(2∶3)中 ,薄层层析只有一个点 ,HPLC 分析为喜树碱 ,含量达 98%,结晶得喜树碱纯品 。
3　结　论
本实验确立了喜树碱提取 、纯化的优化工艺:
喜树果粉末※70%的乙醇浸泡※浓缩※浓缩液加饱和石灰水 ,搅拌 30min过滤※滤液调 pH 值 8 ～ 9
※上 AB-8树脂柱※90%pH 2 ～ 3的乙醇洗脱※浓缩至悬浊状※乙酸乙酯萃取※浓缩 ,避光结晶※粗品
※乙酸乙酯/石油醚(2∶3)溶解重结晶得纯品。
495第 6期　 赵东亮 ,等:从喜树果中分离提纯喜树碱的工艺条件
本实验的成功之处在于乙醇提取液浓缩后用饱和石灰水处理 ,可大大提高喜树碱的得率 ,得率可达
0.41‰,同时也使杂质大为减少 。树脂经 pH2 ～ 3 、90%的乙醇洗脱后 ,只要用自来水洗掉乙醇 ,就可以再
用 ,不需经过复杂的处理 。
乙酸乙酯∶石油醚(2∶3)萃取后剩下的不溶物经氯仿∶甲醇(1∶1)溶解 ,薄层层析 ,发现里面存在大量的羟基
喜树碱 ,而羟基喜树碱的价格是喜树碱的 10倍左右 ,所以可进一步对其进行纯化。
参　考　文　献:
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